核糖體蛋白在骨肉瘤中的研究進展

陸禹嚴，賀茂林，羅書鉅#

1玉林市第一人民醫院脊柱骨病外科，廣西 玉林 537000

2廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科，南寧 530021

骨肉瘤起源于間葉組織，是最常見的原發性惡性骨腫瘤，平均年發病率為4.4/100萬[1]，發病年齡呈雙峰分布，分別于青春期和60歲后達到峰值。骨肉瘤好發于長骨干骺端，包括股骨遠端、脛骨和肱骨的近端，以惡性程度高、易轉移和復發為特征，是兒童和青少年腫瘤相關死亡的主要原因[2]。影響骨肉瘤患者預后的主要因素包括腫瘤部位、轉移情況、手術切除的完整性及對放化療的組織學反應等。既往骨肉瘤僅依靠手術治療，5年生存率低于20%[3]，新輔助化療和外科手術的飛速發展可使骨肉瘤患者的5年生存率提高至70%[4]，一旦發生肺轉移，患者的5年生存率也僅有20%[5-6]。近20年來，骨肉瘤患者的生存率并沒有進一步改善[7]，治療已進入瓶頸期，從分子水平闡明骨肉瘤的發病機制、尋找可靠的藥物靶點并研發安全有效的新型藥物是目前迫切需要解決的問題。

核糖體蛋白是構成核糖體的重要成分，在細胞內蛋白質的合成中發揮關鍵作用。核糖體蛋白基因的正常調控對核糖體的精確合成和維持細胞的正常生長至關重要。既往研究認為，核糖體蛋白只在核糖體形成過程中起到維持核糖體RNA（ribosome RNA，rRNA）特殊結構穩定性和協助rRNA正確折疊的作用。研究表明，核糖體蛋白除了參與核糖體的組成外，還與翻譯調控和正常細胞的惡性轉化等多種核糖體外功能相關[8-9]。研究者在多種惡性腫瘤中均已發現核糖體蛋白基因的突變或表達模式的變化，包括白血病[10-11]、結直腸癌[12]、骨肉瘤[13]、胃癌[14]、肺癌及惡性膠質瘤[11,15]等，且核糖體蛋白參與了骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和轉移并與骨肉瘤患者的預后相關。本文就核糖體蛋白在骨肉瘤中的研究進展進行綜述。

1 核糖體概述和核糖體的異質性

核糖體是蛋白質合成的場所，主要功能是促使信使RNA（messenger RNA，mRNA）和rRNA的相互識別，并將mRNA上的核苷酸序列翻譯成多肽鏈上的氨基酸序列。翻譯過程是在核糖體、轉移RNA（transfer RNA，tRNA）及多種輔助蛋白質的協助下進行的。真核生物的核糖體由60S大亞基和40S小亞基組成。60S大亞基的成分包括5S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA和大約46種核糖體蛋白，而40S小亞基包含18S rRNA和大約33種核糖體蛋白。組成大、小亞基的核糖體蛋白分別稱之為大亞基核糖體蛋白（ribosomal protein large subunit，RPL）和小亞基核糖體蛋白（ribosomal protein small subunit，RPS）。核糖體作為蛋白質合成的裝配機，既往被認為是一種靜態的實體，但近年來人們越來越清晰地認識到核糖體存在異質性，它的活動受到高度調控，且某些原癌基因蛋白和抑癌因子，如磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）、MYC、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）、p53及RB等，已被證實調控了核糖體生物合成或蛋白質翻譯起始[16-18]。

導致核糖體異質性的機制是多方面的。為適應外部環境的變化，細胞可以改變核糖體蛋白的表達水平或產生不同核糖體蛋白組成成分的核糖體，也可以使rRNA在轉錄后或核糖體蛋白在翻譯后的修飾模式發生變化[9,16-17]。核糖體異質性可導致核糖體病甚至形成腫瘤。核糖體病以各種先天性缺陷和腫瘤易感性增加為特征，這類患者體內存在核糖體蛋白基因的突變或rRNA轉錄后修飾的變化，如Diamond-Blackfan貧血癥中RPS19、RPS17及RPS24基因突變，5q-綜合征中RPS14雜合性缺失及先天性角化不良1（dyskeratosis congenita 1，DKC1）基因突變使rRNA特定位點的假尿嘧啶化修飾異常，這類患者發展為白血病的風險明顯增高[8]。此外，人類腫瘤中也經常出現核糖體蛋白基因的表達異常，如前列腺癌中RPL7A、RPL19、RPL37的過表達[19-20]，鼻咽癌中RPL27、RPL37A和RPL41的低表達[21]。與正常細胞相比，腫瘤細胞的核糖體異質性尤為突出并可能與腫瘤細胞的功能相關，這種差異可能為抗腫瘤治療開辟新的途徑。

2 核糖體蛋白在骨肉瘤中的表達變化和對骨肉瘤細胞生物學行為的影響

骨肉瘤中存在糖體蛋白基因的表達異常已得到多項研究的證實。Zhang等[22]發現RPS15A的表達敲減明顯抑制了人骨肉瘤U2OS細胞的體外增殖和克隆形成，且明顯增加了G0/G1期的細胞數量。Nagao-Kitamoto等[23]研究證實，骨肉瘤組織中RPS3的表達明顯高于正常骨組織，且RPS3在侵襲性骨肉瘤細胞株中的表達水平高于非侵襲性骨肉瘤細胞株，RPS3高表達與原發性骨肉瘤的肺轉移相關。RPS3的敲減或過表達能夠明顯抑制或增加骨肉瘤細胞的遷移，且GLI2敲減的U2OS細胞中RPS3表達顯著下調，GLI2敲減導致的骨肉瘤細胞遷移率降低可以通過RPS3過表達來恢復。該研究表明，RPS3作為Hedgehog信號通路下游轉錄因子GLI2的靶基因而參與了骨肉瘤細胞的侵襲和遷移。Cheng等[24]研究表明，RPS9在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞株中高表達且表達水平與Enngin分期和腫瘤復發率呈正相關，RPS9低表達在體外抑制了骨肉瘤細胞的增殖和集落形成能力并誘導細胞發生G1/S期阻滯，而RPS9高表達通過激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路促進了骨肉瘤細胞的增殖。

研究顯示[13]，RPL34在骨肉瘤中的表達模式發生了變化，對11例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織和癌旁組織樣本的定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測發現，63.64%的骨肉瘤組織中RPL34表達水平明顯高于相應癌旁組織；免疫組化檢測發現，95例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織標本中，78.95%呈RPL34強陽性表達，21.05%呈RPL34弱陽性表達，而60例正常骨組織的RPL34均為弱陽性表達；生存分析結果顯示，RPL34高表達患者的3年生存率明顯更差。RPL34表達敲減明顯抑制了人骨肉瘤Saos-2細胞的增殖和克隆能力，誘導了Saos-2細胞的凋亡并將細胞周期阻滯于G2/M期?；诩又荽髮W圣克魯茲分校（University of California Santa Cruz，UCSC）數據庫的轉錄因子預測和STRING數據庫的蛋白-蛋白互作分析表明，RPL34基因受原癌基因蛋白MYC的轉錄調控，其編碼的蛋白與真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）的亞基發生相互作用，這提示RPL34可能通過MYC/RPL34/eIF3亞基信號轉導通路參與骨肉瘤細胞的增殖調控。

核糖體蛋白基因也可以在骨肉瘤中低表達。Zheng等[25]對47例骨肉瘤組織、12例骨良性病變組織以及8例正常骨組織樣本的檢測發現，骨肉瘤組織和人骨肉瘤MG-63細胞中RPL7A的表達水平明顯低于骨良性病變組織和正常骨組織。RPL7A低表達與血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）升高相關，RPL7A低表達是骨肉瘤肺轉移患者的預后不良標志物。骨肉瘤中RPL7A低表達可能與9號染色體上基因的雜合性缺失有關。

3 核糖體蛋白調控骨肉瘤細胞生物學行為的可能機制

3.1 核糖體蛋白參與原癌基因或抑癌基因介導的信號轉導

核糖體蛋白參與原癌基因蛋白介導的信號轉導的最典型例子是RPS6。多種惡性腫瘤患者均存在PI3K/AKT/MTOR信號通路的失調，骨肉瘤患者常出現該信號轉導通路上某些成分的活性異?；蛲蛔僛26-27]，并在骨肉瘤細胞的增殖、分化、凋亡和患者的預后評估中發揮重要作用。PI3K可以被活化的大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）通路、有絲分裂原、生長因子和應力狀態等多種刺激所激活，活化的PI3K募集并磷酸化激活下游分子AKT，后者主要通過激活MTOR來調控mRNA的翻譯。MTOR能夠通過磷酸化的4EBP1和S6K1來激活eIF4E和RPS6，最終促進含5'TOP結構的mRNA的翻譯起始、延長和細胞周期的進程。這類含5'TOP結構的mRNA包含多種核糖體蛋白、延長因子和涉及核糖體生成或翻譯調控的蛋白質[17]。腫瘤細胞的快速增殖需要更多的核糖體成分和更高效的翻譯機制來維持，而PI3K/AKT/MTOR信號通路介導的翻譯調控機制可能滿足了腫瘤細胞的這種需求。

MYC是一種通過調控轉錄進程來調節細胞生長的重要原癌基因蛋白。參與核糖體和蛋白質合成過程的某些成分的編碼基因在轉錄水平也受MYC調控，如核糖體蛋白基因、核糖體生成所需各種因子以及細胞增殖、分化和凋亡相關的因子[17]。MYC通過修飾這些因子的表達而調控核糖體生成和特定mRNA的翻譯并改變核糖體蛋白和rRNA的總量，導致基因組的不穩定和腫瘤的發生[9]，在MYC過表達的腫瘤細胞中，表達上調的基因絕大部分是參與核糖體大小亞基構成的核糖體蛋白基因[28-30]。此外，MYC還可以通過富集eIF4E、eIF4G、eIF4A和eIF3的亞基來上調核糖體蛋白基因的表達并促進核糖體蛋白與翻譯起始因子的相互作用[9]。這與MYC/RPL34/eIF3信號轉導通路介導骨肉瘤細胞增殖調控的研究推測相一致[13]。近年來已有研究表明，eIF3的不同亞基eIF3b、eIF3c和eIF3h與骨肉瘤細胞的增殖或凋亡相關[31-33]。因此，調控蛋白質合成可能是MYC調節細胞生長和驅動腫瘤生成的重要機制。

包括骨肉瘤在內的約50%的人類惡性腫瘤中存在腫瘤抑制基因p53的突變或缺失[34]。在MYC等原癌基因異?；罨蚝颂求w蛋白基因突變、rRNA合成抑制導致核糖體生成障礙等應激條件下，部分核糖體蛋白以游離的形式增多（如RPL5和RPL11）并與鼠雙微體2同系物（mouse double minute 2 homolog，MDM2）相互作用從而抑制了MDM2對p53的泛素化降解，p53的穩定和活化最終誘導了細胞周期阻滯、細胞凋亡和自噬、DNA損傷修復、腫瘤生成抑制；此外，腫瘤抑制因子p14ARF也可以通過RP與MDM2結合而抑制其介導的p53泛素化降解[8]。因此，RP/MDM2/p53信號轉導通路在抑制腫瘤生成中發揮了重要作用，但骨肉瘤細胞中何種核糖體蛋白基因突變或表達異常導致RP/MDM2/p53信號轉導通路失調進而介導腫瘤的生成和進展仍需要更多試驗數據來證實。

3.2 參與腫瘤相關特定基因的翻譯起始調控

翻譯過程包括起始、延長、終止和再循環4個階段，起始是限速步驟和涉及翻譯調控的主要步驟。在翻譯起始階段，40S小亞基需要多種eIF的協助才能與mRNA結合。首先是mRNA的5'帽結構與 eIF4E結合，后者再與eIF4G結合并通過 eIF3的橋接作用將mRNA定位于40S小亞基上，從而起始翻譯。起始因子eIF4E、eIF4G和eIF4A共同構成三聚復合物eIF4F。這種依賴eIF4F和5'帽結構的翻譯大約占細胞內總翻譯的90%。MYC過表達能夠促進eIF4F的形成，而激活的eIF4F能夠極大地刺激與腫瘤調控相關并依賴5'帽結構的mRNA的翻譯[31]。但這種調控機制是否涉及起始因子與核糖體蛋白的相互作用仍未明確，如MYC是否可能通過調控RPL34的轉錄及RPL34與eIF3亞基的相互作用而影響骨肉瘤細胞增殖相關mRNA的翻譯[13]，目前仍不清晰。此外，在核糖體蛋白基因突變或表達異常導致核糖體壓力、有絲分裂原刺激和營養壓力等應激條件下，5'帽結構依賴的翻譯機制受到抑制，細胞可以利用特定mRNA 5'端的內部核糖體進入位點（internal ribosome entry sites，IRES）來促進mRNA與40S小亞基的結合而起始翻譯過程[35-36]。雖然IRES介導的翻譯只占細胞內總翻譯的10%，但MYC、p53和p27Kip1等腫瘤相關基因mRNA的5'端也包含IRES[37-38]，這表明IRES依賴的翻譯可能是腫瘤細胞在應激狀態下的重要翻譯機制。因此，靶向作用于翻譯起始是一種潛在的腫瘤治療策略。

3.3 調控腫瘤細胞的凋亡和細胞周期進程

細胞周期檢查點是保證DNA復制和染色體分配的質量、維持基因組穩定的重要機制，主要包括G1/S期檢查點、S期檢查點和G2/M期檢查點等。在細胞周期進程中，任何原因引起的異常事件如DNA損傷等，將導致細胞周期檢查點的激活，進而中斷細胞周期的進程并進行修復，如損傷無法修復，細胞將啟動凋亡程序并誘導細胞凋亡。骨肉瘤細胞中核糖體蛋白表達失調導致的核糖體合成異常已被證實是細胞周期進程中的異常事件而阻滯了細胞周期[13,24]。RB、p53在G1/S期和G2/M期檢查點的正常調控中發揮著至關重要的作用，但骨肉瘤細胞中存在RB、p53的突變或表達缺乏[39-40]，導致細胞周期檢查點的調控功能喪失，使核糖體蛋白表達異常的腫瘤細胞能夠避開檢查點的監督而繼續進行DNA復制和細胞分裂，最終令無限增殖成為可能[41]。

4 小結與展望

雖然有原癌基因蛋白和腫瘤抑制因子已被發現在轉錄或翻譯起始水平調控了核糖體蛋白基因的表達進而影響了骨肉瘤細胞的生物學行為，而且這種潛在的機制可能是通過靶向特定的mRNA來實現。但在骨肉瘤細胞內連接原癌基因蛋白或腫瘤抑制因子、核糖體蛋白與轉錄和翻譯起始以及細胞周期檢查點的分子機制仍需要更多令人信服的研究來闡明。靶向作用于核糖體蛋白從而抑制細胞的蛋白質合成可能是一種具有重大意義的抗腫瘤治療策略?？梢灶A見的是，當那些能夠被利用成為治療靶點的核糖體蛋白得到充分認識后，更有效的骨肉瘤靶向治療藥物的研發將成為可能。