急性抗體介導排斥反應中NTPDase1代謝胞外ADP失衡致移植物損傷研究進展

張勇，王曉雁，薛芃，魏光柱，劉雪歡

首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京100070

隨著器官移植技術不斷成熟、移植免疫基礎研究不斷深入和免疫抑制劑不斷開發，器官移植成為臨床治療終末期器官功能衰竭的有效手段。但各種因素導致的移植物失功能是國際器官移植領域亟待解決的難題之一。目前認為，排斥反應是導致移植物失功能的主要原因之一。急性排斥反應一般發生在器官移植術后數小時至一個月內，可分為T細胞介導的急性細胞性排斥反應和B細胞參與的急性抗體介導排斥反應(AMR)[1]。與T細胞介導的急性細胞性排斥反應相比，B細胞參與的急性AMR治療效果更差，屬于難治性急性排斥反應之一[1～3]。急性AMR發生時，血小板活化、B細胞激活、巨噬細胞功能上調直接或間接導致移植物不可逆性損傷。三磷酸核苷雙磷酸水解酶1(NTPDase1)是一個鈣、鎂離子依賴的核苷三磷酸二磷酸水解酶，可以水解細胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)為單磷酸腺苷。NTPDase1表達于成熟的B細胞、血小板和巨噬細胞等，能夠維持其胞外ADP平衡，使這些細胞處于靜息狀態。急性AMR發生時，NTPDase1代謝胞外ADP平衡被打破，改變了B細胞、血小板、巨噬細胞等靜息狀態，從而導致移植物損傷[4～7]。因此，NTPDase1相關通路導致的血小板活化、B細胞激活和巨噬細胞功能上調在急性AMR移植物損傷中的作用越來越受到關注。本文結合文獻就急性AMR中NTPDase1代謝胞外ADP失衡致移植物損傷的研究進展作一綜述。

1 急性AMR中移植物損傷概述

器官移植被譽為20世紀外科領域的三大醫學進展之一，已經成為臨床救治終末期器官功能衰竭的有效手段。目前，困擾器官移植進一步發展的一個亟待解決的難題是排斥反應。在臨床上，一般將排斥反應分為超急性排斥反應、急性加速性排斥反應、急性排斥反應和慢性排斥反應四類。其中，急性排斥反應又分為急性T細胞介導的排斥反應和急性AMR。20世紀90年代以前，醫學界普遍認為急性排斥反應主要是由細胞免疫介導的，直至有學者發現人類白細胞抗原(HLA)抗體在移植腎排斥反應中具有重要作用，急性AMR才受到重視[8]。AMR主要是由抗體、補體等體液免疫成分參與所致的免疫損傷，大多發生在移植術后2～3周，也可表現為慢性過程[9，10]。隨著對T細胞介導排斥反應的有效控制，AMR成為排斥反應預防和診治的核心內容。在急性AMR中，特異性抗體與移植物內皮細胞的特異性靶點結合，通過經典途徑激活補體，不僅可以直接攻擊移植物，還可以激活淋巴細胞，而淋巴細胞通過免疫反應和炎癥反應攻擊移植物，最終導致移植物不可逆性損傷[11]。

2 NTPDase1的結構和功能

1982年，Rowe等首次發現EB病毒感染的B淋巴母細胞表面存在一種特殊的分子標志物，之后被命名為CD39，即NTPDase1。NTPDase1是一個含有約510個氨基酸的跨膜蛋白，由7個N-糖基化位點、11個半胱氨酸殘基和2個跨膜區域組成。在結構上，NTPDase1由兩個跨膜區域組成，一個為含有N端和C端的胞質區域，一個為含有5個ATP酶保守區的胞外疏水區域。胞外疏水區域是維持NTPDase1結構和功能的必需區域[6，7]。

NTPDase1是一個鈣、鎂離子依賴的核苷三磷酸二磷酸水解酶，可表達于血管內皮細胞及成熟的B細胞、血小板和巨噬細胞，主要生物學功能是催化水解細胞外ATP和ADP為單磷酸腺苷，同時釋放能量，從而維持胞外磷酸腺苷的動態平衡，維持B細胞、血小板和巨噬細胞處于靜息狀態。近年研究發現，NTPDase1在缺血再灌注損傷保護、免疫炎癥反應、血栓形成及促進腫瘤生長、轉移等方面具有重要作用[6，7]。NTPDase1可以激活A1和A3腺苷酸受體，通過蛋白酶C和線粒體的ATP敏感性鉀通道，在缺血再灌注損傷中保護心臟等重要器官；在器官移植中，NTPDase1通過腺苷A2A受體介導的信號通路，對供體缺血再灌注損傷具有保護作用。NTPDase1結合NTPDase1-5′核苷酸酶-腺苷受體，通過激活磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通道，磷酸化抑制糖元合成酶激酶-3β，開放ATP敏感性鉀通道，保護線粒體功能，從而阻止中性粒細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞的炎癥因子釋放，抑制免疫反應和炎癥反應。NTPDase1通過調節血小板聚集相關的ADP依賴的P2Y1受體，直接參與血小板活化和血栓形成。腫瘤內部的壞死細胞及其周圍被殺傷的細胞可釋放細胞因子和化學因子，能夠上調NTPDase1表達，NTPDase1消除細胞外腫瘤微環境中的ATP，從而加速腫瘤生長；NTPDase1還可通過抑制抗腫瘤免疫反應和提高血管生成，促進腫瘤生長和轉移。

3 急性AMR中NTPDase1代謝胞外ADP失衡介導移植物損傷的機制

目前，大部分學者認為，急性AMR發生時特異性抗體與移植物內皮細胞的特異性靶點結合，通過經典途徑激活補體，不僅可直接攻擊移植物，還可激活淋巴細胞，通過免疫反應和炎癥反應攻擊移植物，最終導致移植物不可逆性損傷。然而，急性AMR中移植物損傷的機制非常復雜，除了上述經典途徑外，NTPDase1也發揮了重要作用。在急性AMR中，特異性抗體對移植物的攻擊及藥物因素、機械因素、血液動力學因素等能夠引起移植物血管內皮損傷，失去正常結構的血管內皮細胞跨膜蛋白-NTPDase1不能正常發揮催化水解細胞外ADP的生物學功能，導致胞外ADP蓄積，胞外ADP的生成和NTPDase1對胞外ADP的水解代謝失衡，進一步通過血小板、B細胞、巨噬細胞介導移植物不可逆性損傷，導致移植器官失功能。

3.1 NTPDase1代謝胞外ADP失衡致血小板活化、血栓形成 在急性AMR中，移植物血管內皮細胞損傷，NTPDase1結構被破壞，導致NTPDase1不能正常催化水解細胞外ADP，導致胞外ADP蓄積。胞外ADP是血小板活化的重要激動劑，血小板的活化啟動瀑布式凝血反應，導致移植物內血栓形成，移植物血供進行性下降，最終導致移植物不可逆性損傷。因此，在急性AMR中NTPDase1代謝胞外ADP失衡致血小板活化、血栓形成是導致移植物損傷的重要途徑之一。

在靜息狀態下，血小板胞外ADP的生成和NTPDase1對ADP的水解處于動態平衡狀態，從而維持血小板功能穩定。在急性AMR中，特異性抗體對移植物和移植物血管內皮細胞特異性抗原的攻擊以及藥物因素、機械因素、血液動力學因素等，能夠引起白細胞趨化、聚集、黏附，導致移植物血管內皮細胞損傷，同時移植物血管內皮細胞表面的跨膜蛋白-NTPDase1結構受到破壞，最終導致NTPDase1不能正常催化水解細胞外ADP，胞外ADP蓄積，NTPDase1代謝胞外ADP失衡[12～14]。而胞外ADP是血小板活化的重要激動劑，可與血小板表面特異受體結合，導致血小板鈣離子內流、血小板內腺苷酸環化酶和磷脂酶C活性改變，從而導致血小板活化、黏附、聚集和血栓形成[15]。

活化的血小板及其產生的炎癥介質介導了移植物不可逆性損傷，導致移植物失功能?；罨难“寮捌洚a生的炎癥介質作用途徑[16～21]：①血小板黏附在損傷的血管內皮，啟動了瀑布式凝血反應；②血小板的脂氧化酶產物促使白細胞產生白三烯，白三烯促使中性粒細胞和嗜酸性粒細胞黏附于血管內皮；③血小板激活因子可增加血管通透性、促進白細胞聚集和黏附，從而促進吞噬氧化能力，造成血管內皮損傷；④IL-1表達上調，能夠促進免疫細胞成熟、活化、增殖，在免疫調節過程中發揮重要作用；⑤血小板衍生生長因子誘導巨噬細胞、成纖維細胞游走，不僅能促進血小板的凝血功能，還能激活移植部位免疫系統功能；⑥轉化生長因子β能夠參與組織損傷和修復，調節細胞外基質形成，參與炎癥、損傷與修復等病理生理過程?？傊?，移植物內皮損傷與血小板活化相互加強，反復放大，進而造成了移植物不可逆性損傷。

在急性AMR中，微血栓形成是介導移植物不可逆性損傷的關鍵環節之一；抑制血小板活化和血栓形成，阻斷其介導的移植物損傷是治療器官移植后急性AMR的潛在途徑[22，23]。有研究報道，移植術前血小板處于活化狀態的尿毒癥患者移植后可出現血栓形成，而且活化的血小板通過產生一系列炎癥介質促進移植后血小板與內皮細胞間的黏附、血小板相互聚集及血小板與白細胞的黏附等，成為術后急性排斥反應的始動因素；移植后出現的急性AMR也可通過血管內皮損傷等途徑導致NTPDase1代謝胞外ADP失衡，引起胞外ADP蓄積和血小板活化[24～27]。這些研究佐證了NTPDase1代謝胞外ADP失衡能夠導致血小板活化、血栓形成，進而引起急性AMR中移植物不可逆性損傷。

3.2 NTPDase1代謝胞外ADP失衡致B細胞激活 在急性AMR中，移植物血管內皮細胞NTPDase1結構受損，NTPDase1不能正常催化水解細胞外ADP，導致胞外ADP蓄積；胞外ADP通過第一信號系統活化B細胞，繼而產生大量抗體，通過抗原抗體反應直接攻擊移植物，B細胞活化后還可產生大量炎癥介質，通過不同途徑攻擊移植物，最終導致移植物不可逆性損傷。因此，在急性AMR中NTPDase1代謝胞外ADP失衡致B細胞活化也是導致移植物損傷的重要途徑之一。

在靜息狀態下，90%以上的B細胞可表達NTPDase1，僅6%的T細胞可表達NTPDase1，而且B細胞表達NTPDase1的活性也高于T細胞，故NTPDase1能夠通過催化水解B細胞外ADP來維持B細胞的功能穩定[28]。當急性AMR發生時，胞外ADP生成和NTPDase1對ADP的水解失衡，B細胞被激活；被激活的B細胞產生B細胞活化因子等炎癥介質，這些炎癥介質通過B細胞受體依賴性和非依賴性機制促進未成熟的B細胞分化，進一步打破免疫平衡狀態；同種異體抗原、B細胞活化因子等因素能夠刺激B細胞分化為漿細胞，并分泌供體特異性抗體(DSA)，DSA可與移植物內皮細胞的特異性靶點結合，激活補體，從而直接攻擊移植物[29，30]。因此，B細胞一旦被激活，不僅可通過分泌DSA攻擊移植物，還可通過多種炎癥介質誘導B細胞、T細胞、單核細胞、血小板相互作用，放大瀑布式免疫反應，造成移植物不可逆性損傷。

Zhang等[12～14，24]探討了NTPDase1與胞外ADP蓄積和B細胞活化的關系、激活B細胞與腎移植急性AMR的關系、B細胞活化與移植腎間質纖維化的關系，以及抑制血小板活化對逆轉急性AMR和延緩移植腎間質纖維化的效果，結果發現，腎移植急性AMR發生時，活化的B細胞NTPDase1表達活性明顯升高；急性AMR發生時，血小板活化增加并與移植腎間質纖維化密切相關，抑制B細胞和血小板活化對逆轉急性AMR和延緩移植腎間質纖維化具有一定效果。進一步佐證了在急性AMR中NTPDase1代謝胞外ADP失衡致B細胞激活可造成移植物不可逆性損傷。

3.3 NTPDase1代謝胞外ADP失衡致巨噬細胞功能上調 在急性AMR中，血管內皮細胞NTPDase1結構和功能受損，導致巨噬細胞外ADP蓄積；胞外ADP能夠活化巨噬細胞，而活化的巨噬細胞可直接吞噬和消化移植物，導致移植物不可逆性損傷。因此，急性AMR中NTPDase1代謝胞外ADP失衡致巨噬細胞活化也是導致移植物損傷的重要途徑之一。

巨噬細胞屬于免疫細胞，主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行吞噬和消化，并激活淋巴細胞等免疫細胞，繼而對病原體作出反應。目前，NTPDase1代謝胞外ADP失衡與巨噬細胞功能上調的關系尚不完全清楚。研究表明，巨噬細胞有三種活化途徑[30]：①經典活化的巨噬細胞需要自然殺傷細胞的產物為第一信號，腫瘤壞死因子為第二信號，但在生理上第二信號通常是由Toll樣受體的配體誘導巨噬細胞自身產生內源性的腫瘤壞死因子；②替代性活化的巨噬細胞需要有合適的誘導劑；③Ⅱ型活化的巨噬細胞需要兩個信號。NTPDase1代謝胞外ADP失衡似乎可以通過上述三種途徑上調巨噬細胞活性，加強其對移植物細胞殘片的吞噬和消化，從而導致移植物細胞固有結構損傷，介導移植物不可逆性損傷。

綜上所述，急性AMR發生時NTPDase1代謝胞外ADP失衡，能夠通過相關通路導致血小板活化、B細胞激活和巨噬細胞功能上調介導移植物不可逆性損傷。因此，進一步研究急性AMR中NTPDase1導致的血小板活化、B細胞激活和巨噬細胞功能上調的作用機制，有助于早期診斷和有效治療急性AMR，保護移植物功能，從而使移植物長期存活。