基因工程豬紅細胞替代人紅細胞治療貧血疾病的進展

崔燁華　王毅

[摘要] 目前，血液制品短缺是一項世界性難題。其中，一些疾病如鐮刀型貧血等疾病需要反復輸注紅細胞治療，由此增加了患者發生致敏和溶血性輸血反應等不良反應，也更加限制了他們對供體血液的選擇范圍。為了解決這些問題，異種輸血是潛在的解決方案之一，而豬紅細胞（pRBCs）因為與人紅細胞具有多重相似性而受到廣泛的關注。然而，由于豬的紅細胞上天然存在3種已知的碳水化合物的異種抗原（半乳糖-α1，3-半乳糖[Gal]，N-羥乙酰神經氨酸[Neu5Gc]，β-1，4-N-乙?；?半乳糖胺基轉移酶2[Sda]），單純的異種輸血是不可行的。最近，隨著基因工程豬技術的發展，已實現了敲除豬體內特異性抗原的能力，以減少人類體液和細胞免疫反應的發生。該文主要總結了異種輸血的起源、最新研究進展以及實現異種輸血需要克服的障礙等問題。

[關鍵詞] 紅細胞;異種輸血;豬紅細胞;基因工程

[中圖分類號] R556 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2020）11（a）-0196-03

Progress of Genetically Engineered Pig Red Blood Cells to Replace Human Red Blood Cells to Treat Anemia

CUI Ye-hua1， WANG Yi2

1.Department of Urology， Second Affiliated Hospital of Nanhua University， Hengyang， Hunan Province， 421001 China; 2.Department of Urology， Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou， Hainan Province， 570311 China

[Abstract] At present， the shortage of blood products is a worldwide problem. Among them， some diseases， such as sickle-type anemia， require repeated red blood cell transfusion， which increases the patient's adverse reactions such as sensitization and hemolytic transfusion reactions， and also limits their choice of donor blood. To solve these problems， heterologous blood transfusion is one of the potential solutions， and porcine red blood cells （pRBCs） have received widespread attention because of their multiple similarities with human red blood cells. However， due to the natural existence of three known carbohydrate heterologous antigens （galactose-α1，3-galactose [Gal]， N-glycolylneuraminic acid [Neu5Gc]， β-1，4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2 [Sda]）， pure heterogeneous blood transfusion is not feasible. Recently， with the development of genetically engineered pig technology， the ability to knock out specific antigens in pigs has been achieved to reduce the occurrence of human humoral and cellular immune responses. This article mainly summarizes the origin of heterogeneous blood transfusion， the latest research progress， and the obstacles that need to be overcome to achieve heterogeneous blood transfusion.

[Key words] Red blood cells;Heterologous blood transfusion;Pig red blood cells;Genetic engineering

紅細胞血液制品在急救復蘇、大型危重手術和慢性血液疾病上的治療可謂是重中之重，但隨著對血液需求量的上升，血液制品的供需平衡遭到了破壞，各大醫院以及輸血中心經常會出現供不應求的情況，用血緊張是目前臨床上公認的問題。近幾年來，尋找新的血液制品替代品已成為熱門的研究方向，由于種種原因，例如后代的數量、器官的大小以及與人類的功能相似性，豬被認為是跨物種移植（異種移植）或輸血（異種輸血）的最佳器官和細胞來源而受到了廣泛的關注。該綜述涵蓋了2011年5月—2020年4月世界范圍內14篇關于異種紅細胞輸注的研究文章，從豬紅細胞所具備的優點、實驗動物模型的選擇以及異種紅細胞輸注所面臨困難的幾個方面，淺要地分析了基因工程豬紅細胞作為新型血液制品替代品的可行性，為解決世界范圍內紅細胞短缺的問題提供了新的思路。

1 ?介紹

1.1 ?異種輸血的起源

使用非人類動物血液制品替代人血液制品治療可追溯到1667年，且一直持續到20世紀初，早期的異種輸血血液制品為異種來源，1665年Richard Low僅使用兩只狗進行了最初的動物紅細胞輸注的實驗研究。而第一次用于人類身上的異種輸血發生在1667年，當時法國路易十四國王的醫生將一只羔羊的血液輸入至一名高燒的年輕男子身上，隨后患者出現了反復的流血現象[1]，在現代稱這種現象叫做急性溶血反應。

1.2 ?血液的供應、需求及安全

根據WHO世界衛生組織的最新報告，每年可以收集大約1.12億獻血者的血液，但這遠遠滿足不了全球血液的需求量，其中又以O型血的短缺最為嚴重[2]。而在人類免疫缺陷病毒（HIV）高發的國家，血液制品短缺的情況就越發嚴峻。同時對于需要反復接受紅細胞輸注治療的患者（如鐮刀型貧血等）而言，長期的慢性輸血史使其體內具有遠高于一般健康人表達水平的同種異型免疫抗體，其原因可能是因為大多數鐮刀型貧血（SCD）患者是非洲裔美國人，他們絕大多數的RH血型表型為RH D+C-E-c+e+，但由于大多數捐血者是美國白人，只有不到2%的美國白人RH血型與之相同[3]。因此，尋找新的血液制品替代品已成為亟待解決的問題。

1.3 ?豬紅細胞作為一種新的血液替代品

鑒于上述種種問題，人類紅細胞血液制品的新型替代品引起了高度關注，其中豬作為異種器官移植及異種輸血的供體受到的關注度最高。豬作為異種輸血的供體有以下幾個優點：①豬紅細胞的平均壽命稍短于人紅細胞（豬紅細胞平均89 d，人紅細胞平均120 d），但二者紅細胞的直徑和計數差別不大;②豬與人血紅蛋白具有相似的三維結構，豬的血型系統是AO（H）系統，和人類的ABO系統亦松散相關聯， 而且許多“次要”血型抗原（例如Kell血型抗原）似乎沒有在豬紅細胞表面上表達[4];③豬在無菌環境下相對容易繁殖和成熟，其高繁殖能力提供了取之不盡，用之不竭紅細胞;④相關報道表明[1]豬基本上沒有對人類有致病性的細菌、真菌和寄生蟲，雖然豬器官可能存在異種逆轉錄病毒引入人體的風險，但由于成熟的紅細胞并沒有細胞核，所以規避了該風險。根據相關的實驗報告[5]，通過必要的篩查方案和豬群必須的生物安全性住房檢查，與人類捐贈者相比，豬異種移植傳播傳染病的風險要低許多。綜上所述，豬紅細胞可能是作為人類紅細胞血液制品替代品進行異種輸血的最優選擇。

2 ?免疫障礙

想真正將豬紅細胞（pRBC）用于臨床輸血之前，首當其沖需要解決的問題是免疫學問題。野生豬身上天然存在Gal、Neu5Gc和 Sda 3種異種抗原，而人類細胞表面并沒有表達這3類抗原，所以血清中存在3者的天然抗體，舊世界非人類靈長類動物（OWNHP）如狒狒的紅細胞只存在Neu5Gc抗原，不存在Gal和Sda抗原，所以和人類一樣，血清中天然表達Gal以及Sda抗體[6]。如果將野生型的pRBCs輸入靈長類動物體內，則會因為野生豬天然存在的3種異種抗原（Gal， Neu5Gc 和 Sda），立即引起抗原抗體結合，導致免疫系統排斥反應。其中Gal是末端上的寡糖結構，是靈長類動物抗體的主要靶抗原，故將存在Gal抗原的豬紅細胞、組織和器官作為供體移植給人類或NHP（非人靈長類動物），會迅速激活補體，導致快速炎癥反應和凝血功能失調，使細胞損傷裂解并死亡，加速HAR（超急性排斥反應）的發生。HAR會導致移植物被迅速清除，類似于人類ABO血型不相容的結果[7-8]。除此之外，人類有另外2種天然存在的抗體（Neu5Gc和 Sda），盡管細胞毒性較抗Gal抗體小，卻能在體外快速啟動補體介導的豬細胞裂解反應和NPH對豬器官的異種排斥反應。相關實驗室使用GTKO（Gal基因敲除）供體的器官消除了Gal抗體介導的異種移植物排斥反應，卻依然沒有消除其他異種抗原介導的排斥反應，強調了其他異種抗原對異種移植的重要性和關聯性[9]。

3 ?TKO基因工程豬的獲得與前景

隨著基因工程技術的發展，獲得3種異種抗原基因均敲除（TKO）的豬成為可能。如果要將pRBC成功輸入人體， TKO豬可能是更好的選擇。流式細胞儀分析顯示，每敲除一個異種抗原基因，其血清抗原抗體結合水平就隨之降低。當使用GTKO、Gal/Neu5Gc抗原敲除以及 TKO豬的RBCs和PBMC（外周血單核細胞）分別與人類血清相結合時，TKO的豬與人血清的IgM（免疫球蛋白M）及IgG（免疫球蛋白G）抗體結合比率遠低于GTKO pRBC與人血清結合的比率，并且和人ABO血型相容（陰性對照組）的結合結果差異并不明顯[10-11]。這表明具有更低的抗原抗體結合水平TKO豬是更好供體的選擇，相關實驗報道同樣證實了TKO基因豬是人類生物人工心臟瓣膜理想的替代品[12]。未來異種移植的動物研究模型，應該要基于具有低水平抗體結合和水平的TKO豬作為背景，調節補體和抗凝血機制，以最大限度延長移植物的存活時間。

4 ?TKO豬異種實驗的非人靈長類動物模型選擇研究

目前，狒狒或者其他OWNHP已被確定為異種移植模型中的可靠宿主，因為它們表達與人類相似的蛋白質，但舊世界猴子仍然在一個重要方面和人類不同，即它們表達Neu5Gc抗原（人類不表達），因此不產生抗Neu5Gc抗體，所以舊世界猴對于研究Gal以及Sda抗原是一個合適的模型，但它們不適合用于研究表達（或不表達）豬Neu5Gc的模型。當使用TKO豬作為供體，會發現TKO豬與狒狒血清的抗體結合水平遠高于TKO豬與人類血清的結合水平，與TKO豬低水平抗體的實驗預期不相符。究其原因可能是在未知第4種抗原在敲除3種基因后得到了表達并與狒狒血清中的未知抗體結合，而人類并沒有此類抗體[13]。所以使用狒狒作為TKO豬移植受體時，可能很難得到實驗預期的結果。而卷尾猴（capuchin）這類NWHNP（新世界非人靈長類動物）在紅細胞上完全和人類一樣不表達Gal、Neu5Gc和Sda[6]，更加貼近人類異種抗原表達情況。受限于卷尾猴體型等其他原因，缺乏作為大型異種器官移植動物模型的經驗，但對于組織以及紅細胞異種移植，尤其是TKO基因型豬作為供體時，卷尾猴更加優于狒狒及其他舊世界猴子模型，是更理想的動物實驗研究模型。

5 ?結論

尋找新的紅細胞血液替代制品是解決全世界血液供應短缺最有效的辦法之一，目前新的血液替代制品的研究主要為兩條發展思路，分別是尋找及研發血紅蛋白類攜氧載體以及使用異種來源的紅細胞，而異種輸血所面臨的問題則主要是由天然的異種抗原抗體所介導的免疫排斥反應。隨著近幾年基因工程技術的發展，使得通過基因敲除技術培育出細胞表面天然不表達異種抗原（Gal、Neu5Gc、Sda）的豬成為可能，即我們常說的TKO豬（三重基因敲除豬）。因為TKO豬紅細胞具有與人類血清極低的抗原抗體結合率[10-11]，使得TKO 豬紅細胞作為新型紅細胞血液制品的理想選擇而受到人們廣泛的關注，特別是對輸血有著嚴格限制以及長期需要進行紅細胞輸注治療的慢性疾病患者而言，由于豬紅細胞表面不會表達次要血型抗原，以及可通過基因工程人為地選擇敲除掉豬紅細胞主要抗原[4]，豬紅細胞比起普通血液制品可以更有效地降低慢性血液疾病患者中同種免疫的發生率，以減少溶血反應，對于某些疾病來說豬紅細胞可能是更好的選擇。但狒狒這類舊世界猴由于細胞表面天然表達Neu5Gc抗原（人類不表達），所以并不適合作為研究表達（或不表達）豬Neu5Gc的動物模型。為此選擇使用與人類紅細胞抗原表達更為接近的卷尾猴（即紅細胞表面天然不表達Gal、Neu5Gc和Sda）可能是更好的選擇[6]，當使用TKO豬作為紅細胞供體時，卷尾猴比起狒狒更加適合作為異種紅細胞輸注的移植受體。但在真正實行豬異種紅細胞輸注的初步臨床試驗之前，依然存在一些不足需要進一步完善，如證明豬紅細胞完全沒有人畜共患病;證明使用過豬紅細胞血液制品的人不會影響將來人與人同種之間的輸血;明確血液等滲性的微小差異等因素是否會影響豬紅細胞的存活率;確定豬紅細胞存儲的最佳時間和最佳條件;以及一些倫理及地域文化問題。但我們相信，在不久的將來，豬紅細胞會被進一步證明是人類紅細胞新型血液制品的替代品中較好的選擇。

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（收稿日期：2020-08-09）

[作者簡介] 崔燁華（1992-），男，碩士在讀，研究方向為異種移植。

[通信作者] 王毅（1964-），男，博士，教授，研究方向為異種移植，E-mail：wayne0108@126.com。