蛋白質腺苷化修飾研究進展

胡 陽,丁 明

（中國藥科大學 生命科學與技術學院,江蘇 南京 210009）

蛋白質是生命活動的“執行者”,對蛋白質功能的研究是生命科學領域的一大重點。蛋白質的功能不僅取決于翻譯完成之后的蛋白質結構,也與蛋白質的翻譯后修飾密切相關,例如蛋白質的磷酸化、泛素化、糖基化、甲基化、乙?；?、棕櫚?；确g后修飾機制已經被證明對于蛋白質正常生物學功能的發揮至關重要。蛋白質腺苷化修飾是指腺苷化酶以ATP為底物將腺苷一磷酸通過磷酸二脂鍵共價結合到蛋白質特定的氨基酸上,從而對蛋白質的功能進行調節。最常見且穩定的腺苷化修飾發生在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的側鏈羥基上[1]。蛋白質的腺苷化修飾首先在原核生物中被發現,Stadtman實驗室發現大腸桿菌中的氮環境發生改變時,一個未知的蛋白會將腺苷一磷酸連接到谷氨酰胺合成酶上,從而改變谷氨酰胺合成酶的催化活性[2]。但40年之后才出現關于新的腺苷化修飾的報道,科學家們發現病原微生物副溶血性弧菌的分泌蛋白VopS能夠在真核生物中介導腺苷化修飾[3]。由于真核細胞中腺苷化修飾的發現,使得該翻譯后修飾機制再度引起了科學家們的廣泛關注。

1 原核生物中的蛋白質腺苷化修飾

原核生物中的腺苷化修飾對原核生物主要起到兩方面作用,首先是維護原核生物自身的穩態?？茖W家們發現的第一個腺苷化酶是來自于大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶腺苷轉移酶,谷氨酰胺合成酶以谷氨酸和氨離子為底物合成谷氨酰胺,為其他幾種氨基酸和核苷酸的合成提供原料,谷氨酰胺合成酶腺苷轉移酶通過腺苷化修飾和去腺苷化修飾調控谷氨酰胺合成酶的活性,對菌體中的氮代謝穩態具有重要意義[4-6]。Canhua Lu等將熒光假單胞菌中的FicT在大腸桿菌中表達之后發現FicT會腺苷化修飾DNA促旋酶的亞基GyrB,誘發SOS反應,抑制菌體DNA復制,特異性蛋白AntF是FicT抗毒性蛋白,能夠抑制FicT的腺苷化修飾活性,兩種蛋白組成的毒性-抗毒性分子對細菌DNA復制的調控具有重要意義[7]。FicT也能夠腺苷化修飾熒光假單胞菌體內的拓撲異構酶IV ParE tyr109從而抑制ParE的活性,誘發SOS反應。FicT的上述生物學功能在假結核耶爾森菌和金黃色葡萄球菌中得到驗證[8-9]。此外,沃爾巴克氏體中的FicT參與的腺苷化修飾過程可能與細胞生存壓力的調節相關[10]。Sreelatha等發現大腸桿菌中的假激酶Selo是一種腺苷化酶,能夠腺苷化修飾grxA Tyr13從而通過谷胱甘肽對大腸桿菌的氧化還原穩態進行調控[11-12]。

原核生物中腺苷化修飾的另一個生物學意義是通過對宿主細胞相關信號轉導的劫持來促進病原體對宿主細胞的入侵。Yarbrough等通過研究表明副溶血性弧菌分泌的腺苷化酶VopS能夠腺苷化修飾宿主細胞的GTPases家族蛋白Rac Thr35來抑制宿主細胞內肌動蛋白聚集,從而破壞宿主細胞的細胞骨架,促進副溶血性弧菌對宿主細胞的入侵[3]。與此同時,副溶血性弧菌分泌的腺苷化酶VopS也被證明能夠通過腺苷化修飾抑制宿主細胞中的NF-KB、Erk和JNK信號通路來促進副溶血性弧菌對宿主細胞的入侵[13]。嗜肺軍團菌的效應蛋白DrrA也是一種腺苷化酶,宿主細胞質中包含嗜肺軍團菌的囊泡會通過DrrA招募宿主的Rab1b蛋白至囊泡周圍,并對其進行腺苷化修飾,從而影響宿主細胞的囊泡運輸功能,促進嗜肺軍團菌對宿主細胞的入侵[14-15]。

2 真核生物中的蛋白質腺苷化修飾

現階段,真核生物中只有FicD和SELO兩種蛋白質被證實具有腺苷化修飾活性,FicD在尋找亨廷頓蛋白直接相互作用蛋白的酵母雙雜交篩選實驗中首次被發現,因此又被稱為HYPE（Huntingtin yeast interacting protein E）[16]。FicD和其同源蛋白在結構上具有高度的保守性,均由一個N端跨膜結構域和一個C端I型Fic結構域組成,定位于內質網[17-19]。

科學家們對FicD的研究較為深入,但迄今為止FicD也只有HSPA5、HSP70、eEF1A、HSP40和αSyn 5種下游底物蛋白被發現。2014年,Ham等在黑腹果蠅的S2細胞中首次發現dFic對HSPA5的腺苷化修飾作用[17]。HSPA5定位于內質網腔內,是HSP70家族的一員,當內質網內出現未折疊蛋白反應（UPR）時,HSPA5能夠抑制未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的集聚,從而保護細胞,而FicD則通過對HSPA5特定氨基酸位點的腺苷化修飾影響HSPA5的活性,從而參與到UPR中?，F在已知FicD對HSPA5有3個特異性的氨基酸腺苷化修飾位點,分別是T518、S356和T366,不同位點的修飾對HSPA5功能的影響也不相同,T518的腺苷化修飾會抑制HSPA5在UPR中的活性[18,20],而S356和T366的腺苷化修飾則會增強HSPA5在UPR中的活性[21]。Matthias C.Truttmann等研究表明FicD能夠腺苷化修飾HSP70從而抑制HSP70輔助蛋白正確折疊的功能[22]。與此同時,腺苷化修飾也被報道存在于帕金森綜合征。Syn是一種突觸蛋白,研究表明Syn蛋白的沉積會誘發帕金森綜合征,Anwesha Sanyal等通過體外研究發現FicD能夠腺苷化修飾Syn,減輕Syn沉積在細胞中誘發的相關表型[23]。與FicD相比,科學家們對SELO生物學功能的了解知之甚少。SELO是哺乳動物中25個含硒蛋白中最大的一個,在多種器官中表達并定位于線粒體。Sreelatha,A等報道了人源SELO蛋白晶體結構并揭示了一種蛋白激酶樣折疊,因此他們推測SELO實際上是一種可以將AMP而不是磷酸基連接到特定蛋白質的Ser,Thr和Tyr殘基上的活性酶,并在體外實驗中證明SELO能夠腺苷化修飾自身和MBP、在細胞的氧化應激反應中發揮至關重要的作用[11]。

3 蛋白質腺苷化修飾的檢測方法

從腺苷化修飾發現至今,科學家們已經發展出多種檢測腺苷化修飾的方法。在研究的早期,32P-α-labeled ATP被添加到腺苷化修飾體外實驗體系中,當底物被腺苷化修飾時會被檢測到放射性[3]?？紤]到進行放射性實驗需要專門的材料和處理,Daniel M.Lewallen等開發出可操作性更強的ATP類似物FL-ATP,FL-ATP的C6被熒光素標記,在免疫沉淀以及與質譜的聯用實驗中具有與32P-a-labeled ATP相似的效果[24]。Kathrin Pieles等在巴爾通氏體屬的腺苷化酶BeP2所介導的體外腺苷化修飾實驗中添加穩定同位素標記的ATP,而后結合質譜技術發現了新的靶蛋白Vimentin,并通過獨立的實驗對這一結果進行了驗證[25]。與此同時,點擊化學的方法也被廣泛應用于蛋白質腺苷化修飾的檢測。Markus Grammel等開發出帶炔基的N6pATP,該檢測方法的基本原理是將ATP類似物N6pATP摻入到重組腺苷化酶介導的腺苷化修飾反應,反應完成之后被N6pATP來源的AMP修飾的蛋白質在銅催化的條件下與帶有疊氮基團的生物素進行疊氮-炔基環加成反應,進而被標記上生物素,avidin磁珠富集之后運用質譜技術即可找到被腺苷化修飾的蛋白[26]。但該檢測方法也有一定的局限性,例如由于對細胞膜的透過性不高,因此不能用于生理條件下新的腺苷化修飾靶蛋白的發現。為了解決這一問題,Kielkowski等開發出新一代ATP類似物pro-N6pA,該類似物中帶負電的磷酸基團被封閉,對細胞膜的透過性得到顯著提高,進入細胞后會被切割成N6pATP,發揮與之相同的作用,pro-N6pA的開發使得生理條件下新的腺苷化修飾靶蛋白的發現成為可能。該團隊還開發出另外一種ATP類似物pro-N6azA,該類似物的胞內衍生物在被修飾到靶蛋白之后進行的疊氮-炔基環加成反應中會使靶蛋白帶上熒光標簽,該熒光標簽能穩定存在至少24小時,使得生理條件下觀察腺苷化修飾的動態變化成為可能[27-28]。腺苷化修飾識別抗體的發展也備受關注。Yi-Heng Hao等以第35位蘇氨酸被腺苷化修飾的Rac1為抗原來誘導產生兔源多克隆抗體,隨后多克隆抗體被用于WB和免疫共沉淀實驗,發現該多克隆抗體能夠特異性較強地識別蘇氨酸被腺苷化修飾的蛋白,因此具有被用于識別未知腺苷化修飾蛋白的潛能[29]。2020年,Dorothea HO¨pfner等開發出三種特異性識別腺苷化修飾而較少受肽段骨架影響的多克隆抗體,并在WB、ELISA、IP實驗中對它們的效果進行了驗證,雖然在WB實驗中會出現交叉識別MARylation修飾的現象、在IP實驗中不能很好地識別低豐度腺苷化修飾,但這三種抗體在腺苷化修飾靶蛋白識別中具有廣闊前景[30]。最近,一些新的腺苷化修飾檢測方法也相繼被開發出來。Burak Gulen等人工合成了巰基反應核苷酸衍生物TReNDs,該衍生物能夠替代ATP特異且穩定地與Fic腺苷化酶活性中心的半胱氨酸側鏈巰基共價結合形成二元復合物FicTReND,接著捕捉Fic腺苷化酶的特異性底物,他們運用IbpA,BepA,FicD和他們已知的底物對這一方法進行了驗證,找到已知底物的同時也發現了新的底物,他們稱這種方法為“共沉淀介導的共價捕捉法”[31]。

4 討論

隨著越來越多的科學家關注腺苷化修飾,我們對腺苷化修飾的了解也在不斷加深。到目前為止,在原核生物中發現了多種腺苷化酶,并識別到一些底物。但在真核生物中只發現了FICD和SELO兩種腺苷化酶且已知的底物較少,特別是暫時沒有發現SELO的腺苷化修飾底物?？茖W家們根據腺苷化酶中催化結構域的結構,對已知的腺苷化酶進行了詳細的分類,對其催化和調控機制也進行了詳細的描述,分析了原核生物中的腺苷化修飾對其自身生理穩態、輔助入侵宿主細胞具有的重要意義,闡述了真核生物中的腺苷化修飾在內質網未折疊蛋白反應、神經發育和神經退行性疾病中所扮演的角色。與此同時,科學家們也開發了多種檢測方法用于腺苷化修飾的檢測和腺苷化修飾新靶點的發現。但總的來說,相對于其他研究較為成熟的翻譯后修飾,我們對腺苷化修飾的了解還相當匱乏。新的腺苷化酶、已知腺苷化酶的靶蛋白還有待進一步發掘,腺苷化修飾所參與的生物學過程有待進一步研究拓展,腺苷化修飾的檢測方法還有待進一步開發,例如腺苷化修飾蛋白的富集方法的發現有利于整合提高質譜等高通量檢測方式對腺苷化修飾蛋白的檢測能力和可信度?？傊?對腺苷化修飾相關問題的回答會進一步加深我們對生命過程的了解,為相關疾病的治療提供堅實的理論依據。