不同濃度A549細胞上清液對人骨髓間充質干細胞遷移的影響*

沈雷 姜楊 張善強 金海峰 姚立杰 張嵩 劉丹陽 李永濤王璐璐

每年全世界死于肺癌的有60萬人[1]，目前各種方法仍無法阻止肺癌發展[2]。研究認為，肺癌組織含有的肺癌干細胞可能來源于間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）[3-4]。MSCs具有向遠處組織定向遷移等能力，還能夠成為腫瘤樣細胞[5]。目前認為，結腸癌或乳腺癌等惡性腫瘤發生發展及腫瘤干細胞的形成均與MSCs密切相關[6]。但是肺癌微環境招募MSCs遷移的影響還需要深入研究。

趨化因子是一類肽類家族，該類因子與MSCs表面受體相互結合，具有促進MSCs等細胞遷移的作用[7]。趨化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）隨著結腸癌發展呈現高表達，與結腸癌轉移密切相關[8]。但是基于CXCL-8的A549細胞與MSCs之間的關系還鮮見報道。本實驗從趨化因子角度驗證不同濃度A549細胞上清液對hBMSCs細胞遷移的影響，為靶向抑制MSCs遷移到肺癌微環境奠定研究基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑、儀器 研究時間為2018年1月-2019年10月，人A549細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司；人骨髓間充質干細胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）由本實驗室保存。α-MEM培養基、DMEM培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Thermo公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購于Sigma公司；RIPA細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白檢測試劑盒為碧云天生物公司產品，小鼠抗人CXCL-8單克隆抗體和小鼠抗人β-actin抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG為英國Abcam公司產品；人Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。日本Olympus公司的BX50型倒置顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 含10%FBS的DMEM培養基培養A549細胞。含10%FBS的α-MEM培養基培養hBMSCs。所有細胞均未出現衰老或死亡現象。

1.2.2 實驗分組 5.5×106A549細胞在37 ℃，5%的CO2培養6 h后，800 r/min離心3 min，提取A549細胞上清液。將A549細胞上清液用含1%FBS的α-MEM培養基分別按體積比5%、25%稀釋為條件培養基（conditioned medium，CM）。以此兩種條件培養基分別培養hBMSCs為5%A549-CM組、25%A549-CM組，無任何刺激的hBMSCs為對照組。

1.2.3 Transwell細胞遷移實驗 1.0×104hBMSCs置于孔徑0.8 μm的Transwell細胞小室內，下層腔室加入5%、25%條件培養基或正常培養基，37 ℃，5%的CO2繼續培養18 h后：棉簽擦除Transwell細胞小室內細胞，0.01 mmol/L PBS清洗3次，2 min/次；4%多聚甲醛溶液室溫固定1 h，0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/次；1%結晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1軟件計算hBMSCs細胞遷移數目。

1.2.4 ELISA ELISA試劑盒檢測各組hBMSCs裂解液的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白含量。

1.2.5 Western blot RIPA細胞裂解緩沖液裂解5.5×106各組hBMSCs，BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測總蛋白濃度，分別進行ELISA和Western blot實驗。45 μg蛋白以10% SDS-PAGE電泳90 min后轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，添加小鼠抗人CXCL-8單克隆抗體（1︰300）和小鼠抗人β-actin抗體（1︰700），4 ℃過夜后；再添加HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1︰400），室溫孵育3 h；ECL發光液顯影成像，IPP 6.0.1軟件分析各蛋白條帶相對吸光度值，β-actin為內參對照。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料用（）表示，兩組間比較來用t檢驗，多組比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A549細胞上清液對hBMSCs遷移的影響 對照組、5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs細胞遷移數目分別為（1 452.25±13.57）、（3 574.16±15.85），（4 523.11±13.35）個。對照組、5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs細胞遷移數目逐漸升高，差異有統計學意義（F=145 046.61，P<0.01）。

2.2 A549細胞上清液對hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達的影響 與對照組比較，5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達均明顯增高，差異均有統計學意義（P<0.01），見表1。

表1 A549細胞上清液對hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達的影響[μg/mL，（）]

表1 A549細胞上清液對hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達的影響[μg/mL，（）]

*與對照組比較，P<0.05；#與5%A549-CM組比較，P<0.01。

2.3 A549細胞上清液對hBMSCs的CXCL-8蛋白表達的影響 對照組、5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs的CXCL-8蛋白表達分別為（0.51±0.01）、（0.73±0.05）、（1.39±0.06），差異有統計學意義（F=2 435.61，P<0.01）。25%A549-CM組CXCL-8蛋白表達明顯比其余兩組增高，見圖1。

圖1 A549細胞上清液對hBMSCs的CXCL-8蛋白表達的影響

3 討論

肺癌發病部位比較隱蔽，采取放射或化學藥物治療后，患者免疫力低下、并發癥較多等問題給患者身體和心理均帶來極大痛苦。癌細胞從原位置擴散至周圍或至遠處組織器官的過程中會產生一系列反應，癌細胞轉移約占惡性腫瘤死亡率的90%[9]。MSCs具有多分化、定向歸巢能力，與腫瘤細胞干性特征相類似，雖然MSCs可能是攻克惡性腫瘤的重要細胞治療手段，但是MSCs對腫瘤組織發揮作用的前提是MSCs歸巢到腫瘤微環境內，目前關于MSCs遷移到惡性腫瘤組織的機制還不清楚。

本實驗觀察A549細胞對MSCs遷移的影響，結果發現，25%A549-CM組hBMSCs細胞18 h遷移率最明顯，A549細胞對hBMSCs促進細胞遷移的能力隨著A549條件培養基的濃度增高而逐漸升高，這可能是由于A549惡性腫瘤細胞能夠分泌促進腫瘤自身生長的炎癥因子或趨化因子有關[10]，這些活性因子對促進腫瘤等細胞移動具有重要意義。研究顯示MSCs能促進胃癌細胞增殖或遷移，胃癌細胞與MSCs共培養時，MSCs能夠促進胃癌細胞增殖或遷移，更促進胃癌移植瘤生長[11]。MSCs分泌趨化因子CCL5等趨化因子，增強了乳腺癌細胞運動性，侵襲性和轉移能力[12]。

CXCL-8又稱為IL-8，能促進高糖或缺氧環境下MSCs的增殖或遷移[13]。IL-8與胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤的分級分期密切相關[14]，從趨化因子角度，揭示A549肺癌微環境對MSCs的影響具有較大影響。5%A549-CM組、25%A549-CM組細胞上清液中CXCL-8蛋白含量均明顯高于對照組，說明A549細胞可以表達CXCL-8蛋白等趨化因子，CXCL-8能夠與MSCs表面CXCR1/2受體特異結合，活化細胞遷移或增殖等過程[15]。實驗發現5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達均明顯上調，這與研究發現的CXCL-8蛋白能夠激活Erk通路促進甲狀腺癌細胞增殖或遷移的研究結果相一致[16]。當PI3K-Erk信號通路被激活后，細胞微絲微管發生收縮移動，細胞在細胞外基質會形成粘連，而細胞膜向前形成突出物，再以附著力和偽足作為支點，細胞整體向前移動，當細胞移動離開后，這些粘附點就會分解，多次這樣的循環使細胞能四處移動。肌動蛋白會在細胞邊緣聚合形成突出物，與整合素連結的細胞骨架可調節細胞對于細胞外基質的附著能力[17]。由此可見細胞骨架和基質蛋白酶在細胞移行過程中扮演著重要的角色，關于CXCL-8誘導肺癌等惡性腫瘤細胞招募MSCs移動的機制還需要進一步確定。

綜上所述，A549細胞上清液含有的CXCL-8蛋白能激活hBMSCs內PI3K-Erk信號通路，促進hBMSCs遷移，這對揭示肺癌干細胞來源具有重要意義。