Graves病動物模型構建的研究進展

冒婧敬, 相萍萍, 2, 劉 超, 2

(1. 南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院 內分泌代謝病中心, 江蘇 南京, 210028;2. 江蘇省中西醫結合醫院 內分泌科, 江蘇 南京, 210028)

Graves病(GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，典型臨床表現為高代謝癥候群，甲狀腺彌漫性腫大，部分患者可伴有Graves眼病或局限性脛前黏液性水腫[1]。GD的發病機制主要是促甲狀腺激素受體(TSHR)與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)結合，刺激甲狀腺激素大量釋放，甲狀腺濾泡增生，從而導致甲狀腺功能亢進[2]。其中TRAb是一種自身免疫性抗體，分為刺激性抗體(TSAb)以及阻斷性抗體(TBAb)。在GD患者中，以刺激性抗體TSAb表達為主[3]。鑒于TSHR與GD發病相關，目前GD造模多以此為切入點。本文就GD模型構建造模材料、造模方法、造模成功指標等方面的研究進展進行綜述。

1 改進造模材料構建GD模型

TSHR可在體內產生抗原性抗體與抗原表位相結合，導致GD發生，故GD模型的構建多基于表達TSHR的基礎?，F有的造模方法主要包括采用表達TSHR的細胞、表達TSHR的質粒DNA以及表達TSHR的重組腺病毒。

1.1 表達TSHR的細胞免疫

1996年SHIMOJO N等[4]首次成功建立GD模型，研究者以攜帶人TSHR基因的真核表達載體轉染RT4.15HP后的細胞為載體，免疫AKR/N(H-2K)小鼠，每2周免疫1次，共計6次，最終約25%的模型小鼠出現總甲狀腺素(T4)水平增高、TSAb陽性及甲狀腺彌漫性腫大，提示造模成功。此后，有學者[5]采用表達人TSHR和小鼠TSHR的M12(hM12、mM12)細胞免疫BALB/c小鼠，最終成功誘導TSAb、T4水平升高并出現典型甲亢癥狀; 而后應用表達TSHR的重組腺病毒轉染樹突狀細胞并注射免疫BALB/c小鼠，亦成功誘導約25%的小鼠出現甲亢[1]。但以上造模方式繁瑣，均需使用其他載體轉染細胞后再免疫小鼠，且成模率較低、穩定性差等，逐漸淡出研究者視線。

1.2 表達TSHR的質粒DNA

表達TSHR的質粒DNA也可有效誘導GD發生。既往研究[3]發現，將表達TSHR的質粒DNA(pc DNA 3.1-TSHR)在小鼠雙側股四頭肌注射，結果小鼠體內血清TRAb濃度增高, T4、TSAb水平均增高，而TBAb水平差異無統計學意義; 甲狀腺組織呈現甲狀腺濾泡增生、膠質濃縮等GD的病理表現，提示該質?？捎行ЫD小鼠模型。同樣, XIA N等[6]采用pcDNA3.1質粒載體構建pcDNA3.1-T289重組質粒DNA, 使90%小鼠出現明顯的甲狀腺腫大和甲亢表現, 80%實驗小鼠血清T4、TRAb水平顯著升高合并甲狀腺濾泡肥大和增生，同時MRI顯像能明顯觀察到小鼠眼眶肌肉成纖維細胞增大，提示應用質粒DNA可成功構建GD小鼠模型。此外, pcDNA3.1-TSHR268 重組質粒也可顯著提高小鼠模型的TSHR水平[7], 但重組質粒免疫的小鼠常會出現甲減而非甲亢[8]。質粒DNA重組方式多樣，一部分如pBacMam-2或pTriEx-1.1構建的質粒DNA, 具有更高的穩定性，但代價較高[9]。部分質粒DNA在短期實驗中無法有效誘導小鼠發生GD[6]。上述不足限制了質粒DNA的應用，仍有待進一步完善。

1.3 表達TSHR的重組腺病毒

相對于質粒DNA載體，采用表達TSHR全長或TSHR A亞單位的重組腺病毒造模重復性更好，成模率更高。GD 的發病是由于TSHR結構發生異常改變，在二硫鍵異構酶以及蛋白酶酶解作用下，連接A、B 2個亞單位的二硫鍵發生溶解斷裂, TSHR-A亞單位脫落表達于細胞表面，誘發并增強自身免疫反應[10]。脫落出來的A亞單位三聚體結構與致病性TSAb的抗體具有更高的親和力[11]。

CHEN C R等[12]在2003年構建重組腺病毒Ad-TSHR289, 造模成功率高達86%, 并具有高度可重復性，同時還發現應用表達TSHR-A亞單位的腺病毒比表達TSHR全長者具有更高的造模成功率, TSAb活性也更高。此后，研究者多采用表達TSHR-A亞單位的重組腺病毒進行造模。伍麗萍等[13]為比較表達TSHR的質粒DNA和腺病毒的造模效果，分別建立質粒組和病毒組小鼠模型，質粒造模組予pcDNA3.1-TSHR 50μg皮內注射，造模組予肌肉注射Ad-TSHR289, 重組腺病毒造模組中所有小鼠的TRAb和T4水平均升高, 8只小鼠中6只出現甲狀腺增大、甲狀腺濾泡組織增生等甲亢癥狀，而質粒造模組僅2只小鼠出現較弱TSHR抗體反應且總T4水平沒有升高，甲狀腺組織未發生增生性改變。另一研究[14]發現，應用TSHR重組腺病毒A亞單位長時間(3～4周)免疫BALB/c小鼠可以顯著增加小鼠抗TSHR抗體滴度，促進TSHR依賴性cAMP水平提高; 同時能夠促使小鼠出現典型甲狀腺腫、甲狀腺濾泡組織明顯增大，且上述作用可維持長達9個月，此外，模型小鼠還出現了心臟肥大、心臟重量增加以及心動過速現象。以上研究表明重組腺病毒建立GD模型更穩定、成功率更高。盡管該法還需進一步改進，但仍是目前GD造模材料的最佳選擇[15]。

2 改進造模方法構建GD模型

2.1 改進給藥途徑

目前GD模型的制備可采用多種給藥途徑，主要包括腹腔注射、股四頭肌肌肉注射、尾靜脈注射以及電穿孔注射等方法。

早期采用表達TSHR的細胞免疫小鼠時，多采取腹腔注射細胞，但該法成模率低，逐漸被淘汰。肌肉注射是目前應用最廣泛的給藥方式，無論是采用表達TSHR A亞單位的腺病毒還是質粒DNA都可采用肌肉注射且效果較好。趙紫琴等[3]對BALB/c小鼠雙側股四頭肌注射pcDNA3.1/hTSHR(188～403 bp)質粒DNA, 每3周1次，共免疫5次，在第2次免疫后發現小鼠T4、TRAb以及TSAb水平顯著升高，病理顯示甲狀腺濾泡增生，提示成功建立了GD模型。

電穿孔(EP)載藥也是造模的有效方法之一。電穿孔介導pC1-hTSHR289His-IRES-CD4 載體免疫小鼠，可使其發生甲亢并可檢測出高滴度TSAb抗體，且該抗體活性明顯高于多數模型[16-17]。與構建病毒載體相比，電穿孔表達載體快捷、方便，無需建立表達或突變體的細胞系。重組質粒pcDNA3.1/TSHR268加電穿孔方法也可成功構建GD動物模型[18], 在造模第4周時，小鼠血清中T4、TRAb羧基端抗體和氨基端抗體水平均達到最高值，停止免疫后18周仍明顯高于免疫前水平，提示電穿孔法或可延長GD的成模時間。不僅如此，電穿孔法還有助于誘發甲亢突眼，產生顯著的眼眶腫大、肉眼可見的眼結膜水腫、眼眶血管擴張和堵塞[19]。故利用肌肉注射與電穿孔技術，通過表達載體重復免疫后，均可成功造模GD小鼠模型，成功率較高。目前，比較肌肉注射與電穿孔免疫的造模效果的研究較少，但有研究發現，通過電穿孔方法傳導腺病毒會導致小鼠在最后1次免疫的4月后死亡[20], 故仍需更多研究證明兩者的優劣性。

2.2 改變給藥時間及免疫次數

GD小鼠免疫周期不完全一致，從2次免疫后2周到3次免疫后8周不等，但多集中在2次免疫后2周及3次免疫后4周。

研究[21]發現，每3周1次，共3次，末次免疫后4周造模為GD小鼠模型的最佳免疫周期，該免疫周期下，實驗小鼠血清TRAb水平能達到最高水平, T4水平升高，并能持續8周。葉楓等[22]比較第2次免疫后2周與第3次免疫后4周的造模效果, 2組小鼠TRAb水平均明顯升高，而其中3次免疫4周造模組的成模率(75%)最高，且其甲狀腺組織改變與 T4 水平變化吻合度為100%。同樣, CHEN C R等[11]選用重組腺病毒A亞單位免疫BABL/c小鼠，分別比較2次免疫后1周(5周造模)，末次免疫后4 周(10周造模)及8周(14周造模)小鼠的TRAb及T4水平，結果發現5周造模組TRAb滴度及甲亢發生率與10周造模相似，而14周造模組的抗體水平及T4升高的陽性率略低于10周造模組，表明造模時間并非越長越好。HOLTHOFF H P等[14]發現利用重組腺病毒每3～4周進行一次免疫，連續免疫9次，可使模型維持時間延長至9個月，是迄今為止最長維持時間，提示造模時間及免疫次數對GD模型有重要影響。

2.3 調整動物品系

不同小鼠品系對相同抗體會產生不同反應, SAITOH O等[23]發現，使用AdTSHR289抗體免疫C57BL6以及BALB/c雌性小鼠時，小鼠體內均可產生TSAb抗體，但只有BALB/c小鼠會出現甲亢病征。與C57BL6小鼠相比, BALB/c小鼠能夠產生更多的TSAb, 且能產生甲狀腺組織的生理變化和眼眶組織的改變[24], 故BALB/c小鼠是目前研究GD造模的主要小鼠品系。此外，一種NOD. H2h4小鼠可自發產生免疫性甲狀腺炎，甲狀腺球蛋白抗體、以及甲狀腺過氧化物酶抗體，但不能產生TSHR抗體，通過將人TSHR A 亞單位轉移至NOD. H2h4小鼠后，該轉基因小鼠可自發產生TSAb[25-26], 為GD提供了新模型，但該小鼠模型研究較少，無法保證其可重復。通常情況下，雌性小鼠本身更容易出現自身免疫性疾病，但有研究[27]發現在相同的GD模型實驗條件下，雄性小鼠TSH、FT4的表達水平會比雌性小鼠更高，但性別對于小鼠GD造模的具體影響尚不明確。此外，王悅等[28]通過肌肉注射重組腺病毒，將獼猴與小鼠進行GD造模對比，發現與獼猴相比，小鼠模型GD甲亢的誘導時間更短，發生率更高，同時GD獼猴基礎生理生化指標和免疫相關指標中顯示出更多與人類GD患者類似的表現及機制。該實驗可為日后探索GD發病機制及評估新治療方案研究提供新的造模動物類型，可以根據2種動物GD模型的不同特點選擇更合適的研究工具。

3 鑒定造模成功的指標

檢測GD造模成功的指標有很多種，臨床上GD主要以甲狀腺毒癥所致高代謝癥狀和體征、甲狀腺彌漫性腫大、TRAb陽性，以及T3、T4水平增高和TSH水平降低為主。若癥狀不明確，可進一步測定放射性碘(RAIU)攝取率(增高)或進行甲狀腺B超確診[2]。

對于GD小鼠造模病理和指標變化可分為以下幾個方面。① 臨床癥狀: 出現一系列甲亢臨床表現如體質量減輕等; ② 實驗室指標: 甲狀腺素水平增高或促甲狀腺素水平降低; 血清TRAb陽性，尤其是TSAb水平; ③ 形態學變化: 甲狀腺增大，甲狀腺濾泡上皮細胞增生，濾泡膠質濃縮或乳頭狀增生等甲亢表現[29-30]。理想的GD小鼠模型需要同時具有生化指標變化和甲狀腺病理變化。

4 小 結

GD的造模始終是當前疾病研究中的難點。近年來，經過多方面的探索，目前已能夠成功建立一個長期并且穩定的GD小鼠模型。上述研究提示，經3次應用表達促TSHR-A亞單位腺病毒免疫BALB/c小鼠，免疫后4周造模效果最佳, TSHR抗體水平明顯增高，血清T4水平升高，甲狀腺濾泡上皮細胞增生肥大，濾泡腔中膠質含量減少或缺失等一系GD體征出現，為目前較為理想小鼠GD模型。

然而，不同研究者采取的終點時間并不一致，同類別小鼠以及相同免疫時間中免疫周期亦不相同，從2 次免疫后2周到3次免疫后8周不等，部分實驗免疫時間不足導致實驗結果不夠精準，缺乏可比性，故不同免疫時間及周期對于GD小鼠造模的影響并不全面，需要更多免疫時間和周期不同的GD小鼠造模實驗以及同類型條件的對比，以提供更加合理且有效的模型。從給藥途徑來看，目前電穿孔造模成功率較高，但其操作難度較大且耗費較高，并有小鼠死亡個例，故肌肉注射可能更為經濟且常用。此外，更多類別人工合成質粒DNA及重組腺病毒等造模材料有待發掘，為GD小鼠模型的構建提供更加高效、便捷的造模條件。目前對于小鼠品系的研究較少，常用小鼠仍為BALB/c小鼠，對于其他品系如NOD. H2h4等新型鼠種以及獼猴等其他動物種類，需進一步研究其可行性。轉基因模型作為自發性的GD模型似乎具有更加廣闊的前景，該模型可傳代，可供深入研究母體及子代GD的發病機制。

綜上所述，目前現有GD模型各有特點，但仍非理想的GD模型，例如伴有Graves眼病的模型仍不穩定，或者無法展現GD的多系統損害等表現。未來仍需更深入的研究以優化GD的造模方式，提高造模效率，為加深GD的病因學及發病機制的認識提供依據。