肝細胞核核因子4α 在肝細胞分化及肝再生中的研究進展

常鑫鉞，王震俠，趙建國

(內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科，內蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

肝細胞核因子4α(HNF4α)是一種高度保守的孤核受體超家族成員，作為一種配體結合轉錄因子表達在肝臟和胃腸道器官(胰腺、胃和腸)[1]。HNF4α 最先于大鼠成熟肝臟中發現，一度被認為是肝細胞特異性因子，之后被發現與人MODY1 型糖尿病發病密切相關[2]。目前研究表明，根據轉錄啟動子P1、P2 的不同，HNF4α 的亞型共分為兩大類，其中P1 介導的于肝臟表達，p2 介導的于胰腺表達[3]。HNF4α 廣泛參與肝細胞的正常生物學功能及代謝調節，如膽汁酸合成，脂質穩態，糖異生，尿素生成，細胞粘附，增殖和凋亡，藥物代謝[4]，同時也是調控干細胞向成熟肝細胞分化的關鍵[5]。

1 HNF4a 的結構

HNF4α 是一種高度保守的核受體超家族成員，富集與肝臟。于肝臟、腎臟，肝臟，胰腺β 細胞及胃腸消化道細胞中均有表達，與MODY1 型糖尿病的發生密切相關。HNF4α 保守的表達模式可以在沒有外源性配體的情況下激活基因轉錄，在器官發育、器官生成和維持器官功能方面發揮著重要作用[6]。人HNF4α 基因定位于20 號染色體長臂(20q13，12)，包含11 個內含子和12 外顯子。根據其轉錄啟動子P1、P2的調控，共分為12 種亞型，其中P1 驅動的HNF4α(1-6) 亞型，而P2 驅動的HNF4α(7-12)亞型[7]。HNF4α 由結構上來說是一種鋅指結構蛋白，共包含6 個結構域(5 個功能域，1 個鉸鏈區)的模塊蛋白。其中A、B 區域為反式激活結構域，包含n-末端反激活域(AD-1)，與啟動子序列密切相關；C 區是一個高度保守的DNA 鋅指結合域(DBD)，D 區為柔性鉸鏈，E區包含第二個反激活域的多功能配體結合域(AD-2)，F 區為抑制區[8]，為HNF4α 特有，兩個反激活域對HNF4α 驅動的基因轉錄有重要影響[9]。

2 HNF4α 的主要功能

HNF4α 的人類全基因組定位分析表明，HNF4α 在肝細胞的物質代謝及分化再生等多條途徑中處于中心環節。HNF4α 與人肝細胞中12%的基因相結合，高于其他肝細胞核因子，其中RNA 聚合酶II 所占的活性轉錄基因中有42%與HNF4α 相結合[10]。HNF4α 自身通過甲基化、乙?；?、磷酸化等的調節方式改變自身生物學活性，通過同源二聚體形式與順式作用原件結合，激活目標基因，介導不同的生理反應[11]；通過控制肝細胞內其他轉錄因子以及功能必需基因，調控肝細胞的正常發育[12]。研究表明，HNF4α 在調控肝細胞分化[13]，穩定肝細胞表型[14]，調節肝細胞增殖[15]，過程中起重要作用。同時還參與調節代謝廢物和藥物的解毒[16]，血清蛋白、載脂蛋白的合成[17]等多條物質代謝途徑。由此可見HNF4α 對于肝臟正常形態結構的發生與維持及肝細胞內物質代謝至關重要。HNF4α 的缺乏或表達量異常會導致嚴重的后果。胚胎期小鼠缺失HNF4α(由HNF4 編碼)因無法形成正常內胚層而早期死亡[18]，Parviz 等通過Hnf4loxP/loxPAlfp.cre 嵌合體的研究也表明，HNF4α 缺失導致小鼠肝臟體積增大，肝實質內肝血竇發育異常，Gys2、Pck1、G6pc 糖原合成關鍵因子缺失，相鄰肝細胞缺乏正常細胞間連接，肝細胞缺乏正常生理功能[19]，最終導致死亡。由此可見，HNF4α 在肝細胞中參與多種生物學功能，缺失HNF4α 會對肝細胞及生物體產生致死性影響。

3 HNF4α 與肝細胞分化

肝細胞來源于內胚層，由肝祖細胞分化而成肝細胞，在肝組織中占絕大多數[20]。肝祖細胞是肝臟的成體干細胞，有分化為肝細胞、膽管細胞的雙向潛能。在肝祖細胞形態和功能上向肝細胞分化并形成胞內嗜堿性深染區時，首先可以檢測到HNF4α 的表達[21]，直至肝細胞發育成熟后維持相對穩定。HNF4α 可誘導多種細胞向肝細胞方向分化，產生類肝細胞和人工肝組織，在肝祖細胞，胚胎干細胞，人誘導多能干細胞等的研究中均有報道。

3.1 HNF4α 促進肝祖細胞向肝細胞分化

肝祖細胞是肝臟的成體干細胞，有分化為肝細胞、膽管細胞的雙向潛能。Ancey 等人在體外對肝祖細胞(HPCs)的研究表明，HNF4α 在肝祖細胞由5hmc 激活，經FOXA2/TET1/P1途徑，使HNF4α 遠端啟動子去甲基化表達HNF4αP1 亞型，指導肝祖細胞的向肝細胞定向分化[22]。而HNF4α 缺乏會阻礙肝祖細胞向肝細胞的正常分化及發育，對生物體產生致死性影響。Li 等對HNF4α 陰性(HNF4α-/-)小鼠的研究表明，HNF4α-/-胚胎由于內臟內胚層功能的缺陷于原腸胚期死亡；雖然通過與野生型四倍體胚胎互補可避免早期死亡，分化形成肝祖細胞。但缺乏HNF4α 會使肝祖細胞分化異常，新生肝細胞中apoA1、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、轉鐵蛋白(TFN)、視黃醇結合蛋白(RBP)和促紅細胞生成素(Epo)的表達明顯降低[23]，肝細胞的形態和功能分化、肝糖原的積累和肝上皮的生成均出現明顯異常[19]。筆者認為，HNF4α 通過影響肝細胞的必要代謝途徑，影響肝細胞表達正常生理功能蛋白，最終導致肝細胞分化受阻，阻礙肝細胞分化成熟。

3.2 HNF4α 促進胚胎干細胞向肝譜系分化

胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性，是一類亞全能干細胞。無論在體外還是體內環境中，該細胞都能被誘導分化為內、中、外三個胚層幾乎所有的細胞類型。DeLaForest 等通過對ESC 的研究表明，HNF4α 表達的開始與ESC 向肝細胞譜系分化的確立密切相關。通過動態檢測第0 天(胚胎干細胞)、第5 天(最終內胚層細胞)和第10 天(肝祖細胞)的HNF4α的表達水平，在第0 天至第5 天，HNF4α 與其mRNA 均未檢測到表達；在第10 天，即出現肝祖細胞分化時，HNF4α 與其mRNA 又可檢測到表達，而HNF4α 的表達缺失會導致ESC肝譜系分化停滯[24]。Liu 等通過對外源性導入Foxa2/ Hnf4a的鼠ESC 與正常鼠ESC 肝譜系分化對比發現，兩組ESC 均可向肝譜系分化生成肝樣細胞，但實驗組向肝譜系的分化程度顯著增加[25]。犬骨髓干細胞(cBMSCs)的研究表明，轉染了Foxa1 和Hnf4a 的犬骨髓干細胞可以誘導分化為肝樣細胞[20]。。以上研究均表明，HNF4α 在調控ESC 向肝譜系分化過程中具有重要作用，HNF4α 是調控ESC 向肝譜系分化的始動因子，其過表達可以顯著增強ESC 向肝譜系的分化。

3.3 HNF4α 促進人誘導多能干細胞的向肝譜系分化

人誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一類具有多向分化潛能的細胞，它們具有體外自我更新和長期分化為人體內所有細胞類型的能力，可通過內胚層細胞向類肝細胞分化[26]，是一種研究肝細胞分化的重要研究對象。HNF4α 表達的開始與iPSCs 的肝譜系的生成明確相關，在胚胎期8.5 天及在肝臟中肝芽到成年過程中HNF4α 呈高表達，而敲低HNF4α 則會抑制人iPSCs 向最終內胚層分化，降低最終內胚層(GSC，SOX17 和Lefty1)的基因表達水平，阻礙其進一步向肝譜系分化，這些結果提示HNF4α 是肝祖細胞和肝細胞分化的必要條件[27]。DeLaForest 等通過體外培養iPSCs 研究表明，HNF4α 與iPSCs 向內胚層分化、肝祖細胞形成及肝基因表達的始動環節均密切相關，HNF4α 的缺失最終會阻礙內胚層細胞向肝祖細胞的轉化[28]。

以上研究均表明，HNF4a 在指導多種干細胞及肝祖細胞向肝譜系方向分化中具有重要作用。HNF4α 通過調控下游靶基因的表達，控制其向肝譜系表達，進而分化成為肝細胞；而HNF4α 的缺失會使分化停滯甚至產生致死性影響。

4 HNF4α 與肝再生的關系

肝臟是具有再生潛力的器官，生理情況下，肝細胞處于靜息狀態，無明顯再生。在肝切除及病理性損傷的情況下，肝臟產生多種細胞因子，經白細胞介素(IL)-6/Jak 激酶(Jak)/信號轉導因子和轉錄-3(STAT3)激活因子以及磷酸肌醇肽3-激酶(PI3-K)/磷酸肌醇肽依賴蛋白激酶1(PDK1)/Akt 等通路協同調控[29]，激活肝細胞、肝祖細胞及其它來源的干細胞進入細胞周期，增殖分化產生肝細胞，完成肝臟的修復再生[30]。Huck 等的研究發現，在肝部分切除術后早期，肝再生開始時HNF4α 表達明顯下降，而在肝再生終止階段，HNF4α 表達恢復正常[31]，而在敲除HNF4α 的情況下，肝細胞處于高增殖狀態，新生細胞出現去分化、促癌表型[32]。以上均表明HNF4α在肝再生過程中參與調控了肝細胞增殖和分化，在肝再生中具有重要作用。

4.1 HNF4α 參與調節細胞增殖

HNF4α 參與調節細胞增殖，這是由于觀察到原本正常表達HNF4α 在多種腫瘤細胞中表達下調。腎細胞癌(RCC)中HNF4a 的mRNA 及蛋白表達較正常腎組織均下調；對腎細胞株HEK293 轉導HNF4α 基因，通過上調HNF4α 的表達可抑制腫瘤細胞增殖[33]。去分化肝癌細胞中HNF4α 的表達水平較低或不存在[34]；而在去分化肝癌細胞株中上調HNF4α表達，可以有效抑制肝癌細胞株快速增殖[35]，上調HNF4a 的表達會導致肝癌細胞向更類似于肝細胞表型的方向重新分化[36]。以上研究表明，HNF4α 參與調控細胞增殖，HNF4α 在細胞中可能作為抑癌基因抑制細胞過度增殖。

4.2 HNF4α 參與調節肝細胞增殖

前述已知HNF4α 參與細胞增殖的調節。在肝再生的研究表明，HNF4α 在肝再生的起始與終止階段均有重要作用，尤其是肝細胞。在小鼠急性肝切除6h 即檢測到肝細胞中HNF4α 的表達明顯下降，12h 達最低，直至7 天后肝再生終止階段HNF4α 表達恢復正常[37]；而在HNF4α 敲除小鼠行相同處理，小鼠肝細胞可檢測到PCNA、Ki67 等的持續高表達，肝細胞增殖活躍[38]。HNF4α 的缺失不僅上調增殖抗原的表達，還促使肝細胞更快進入細胞周期。HNF4α 的表達下調誘導CyclinD1 的高表達[39]，而CyclinD1 抑制HNF4α 與特定基因的結合[40]，影響肝細胞其他代謝途徑的進行，使肝細胞快速進入復制周期，完成肝細胞的增殖。

4.3 HNF4α 調節肝再生的可能機制

HNF4α 作為控制肝細胞代謝的核心因子，控制肝細胞的多種基礎代謝。以往的研究認為HNF4α 對肝再生的影響，由于肝臟中存在大量HNF4α 靶點而影響了肝臟中多種信號通路[41]，進而影響肝再生的進行。HNF4α 通過競爭與c-Myc結合來上調p21[41]，通過p21 抑制增殖；Sladek 等人提出肝臟中可能存在c-Myc/ Cyclin D1/HNF4α 循環[40]，進一步研究表明，HNF4α/Cyclin D1 之間相互抑制協同控制了肝臟的細胞周期機制和代謝[39]。HNF4α 在控制增殖的過程中可能通過協調肝臟能量代謝與細胞增殖，調動細胞內物質主要作用于肝細胞增殖，為肝細胞增殖提供合適的細胞環境，以此促進肝細胞的再生。

5 結語

HNF4α 作為富集于成熟肝細胞的細胞因子，在調控肝細胞物質代謝、抑制增殖、促進分化、調控增殖等方面具有重要作用。HNF4α 在促進干細胞向肝樣細胞分化的作用已然明確，但其詳細機制仍不明確，明確HNF4α 對干細胞向肝樣細胞分化的調控機制有利于體外肝細胞的再生，有助于推動體外干細胞移植治療的發展，結合新興的細胞支架技術，有可能使人工肝臟成為可能，對重度肝損傷及肝癌的治療具有重要的臨床意義。HNF4α 在肝再生的研究表明HNF4α 在肝再生過程中對激活和終止兩階段均起到重要調節作用，在肝再生過程中起到了雙向調節作用，在肝再生的起始與終止階段均有重要作用，同時HNF4α 對肝再生的調節作用還可能通過改變細胞內在環境，為肝再生提供適當的細胞環境來調節肝再生，外源性調控HNF4α 的表達可能影響肝細胞代謝，促進肝細胞內物質向特定代謝途徑進展，對臨床急慢性肝病促進肝再生及術后肝功能的快速恢復具有重要意義。