山西省仔豬黃白痢大腸桿菌耐藥性研究

馮曉東 劉風波 連亮亮

摘? 要：采用Kirby-Bauer法，以分離自山西省10家規?；i場的60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株為材料，開展對獸醫臨床上常用的16種抗生素的耐藥性監測。結果表明，60株病原性大腸桿菌分離株對抗生素已普遍具有耐藥性，其中對復方新諾明（88.3%）、氯霉素（81.7%）、鏈霉素（78.3%）、呋喃唑酮（75.0%）和氨芐青霉素（73.3%）等的耐藥性很強，對環丙沙星及諾氟沙星的耐藥性也較高，其耐藥率分別為60.0%和56.7%。

關鍵詞：仔豬黃白痢;大腸桿菌;耐藥率;藥敏試驗

中圖分類號：S852.61 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2021）06-0026-05

仔豬黃白痢為新生仔豬常見的大腸桿菌病，會嚴重危害養豬生產，并會造成巨大的經濟損失。對于本病的防治，豬場除了加強飼養管理和衛生消毒措施，以及用自家流行菌株免疫母豬，唯有多選用敏感藥物進行治療;然而，大腸桿菌具有眾多的血清型，各地流行菌株的血清型各不相同。隨著抗生素的大量使用，大腸桿菌的耐藥性菌株也不斷出現。為了摸清山西省各地仔豬黃白痢流行病原菌株，指導豬場臨床用藥，本研究對省內各地豬場的新生仔豬黃白痢病例進行了病原分離、鑒定和耐藥性監測。

1? 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

因發生仔豬黃白痢，山西省10家規?；i場仔豬病死60例，在仔豬死后24 h內，采集病變的組織或器官樣本，采集過程中要盡可能避免樣本被污染。

1.1.2 質控菌株

大腸埃希菌ATCC25922購于中國獸藥監察所。

1.1.3 主要儀器設備

試驗所用儀器設備有比濁管、試管、培養皿、接種環、酒精燈、恒溫培養箱、冰箱、打孔器、真空抽氣機、干燥器、測量尺、電子天平、超凈工作臺。

1.1.4 標準比濁管的制備

取10支比濁管，給第1支比濁管裝入0.048 mol/L（即濃度為1.175%）氯化鋇? ? ? ? 0.5 mL，加0.18 mol/L（即濃度為1%）硫酸溶液99.5 mL，充分攪勻，隨后的9支濁管依次類推，濃度逐漸升高。選管徑與接種菌液相同的試管，每支分裝10 mL，密閉，在室溫下置于暗處保存，其濁度為0.5麥氏比混標準（Mcfarland standard），相當于108 CFU/mL的含菌量。使用前應充分搖勻[1]。

1.1.5 接種菌液的制備

稱取營養瓊脂4.5 g溶于100 mL蒸餾水中，加熱溶解，然后放入高壓鍋高壓滅菌? ? 20 min。待冷卻至50 ℃～60 ℃之后取出，在超凈工作臺內將溶液傾倒入經過滅菌的平皿中，待其冷卻凝固后取病料接種菌種。接種完畢后置于37 ℃恒溫箱中培養24 h備用。

用滅菌的接種環挑取瓊脂平板上形態相同的4～5個菌落，接種于3 mL～5 mL水解酪蛋白（mueller-hinton，M-H）肉湯中，在35 ℃下培養6 h，隨后用滅菌生理鹽水稀釋培養液，使其濃度相當于標準比濁管[2]。

1.1.6 培養基的制備

制備普通營養肉湯、普通營養瓊脂、葡萄糖蛋白胨、M-H培養基（K-B試驗專用）瓊脂。

1.1.7試驗藥物

氨芐青霉素（ampcillin，Amp）、氯霉素（chloramphenicol，CM）、紅霉素（eryhromyci，Ery）、慶大霉素（gentamicin，GM）、丁胺卡那霉素（amikacin，Amk）、鏈霉素（gtreptomyces，SM）、復方新諾明（gulfamethoxazole，Sxt）、新霉素（neomin，N）、呋喃唑酮（furazolidone，Fd）、諾氟沙星（norfloxacin，Nor）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、頭孢唑啉（cefazolin，Cfz）、強力霉素（doxcycline，Dox）、氟苯尼考（florfenicol，FLO）、多粘菌素（polymyxin，PXB）和恩諾沙星（enoxacin，ENO）共16種藥物純粉。

1.1.8藥敏紙片的制備

制備好的干燥藥敏紙片分裝在密封小瓶內，放在干燥器中低溫保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌的分離培養

挑選單個菌落，經染色鏡檢證明不含雜菌，此時用接種環挑選單個菌落，移植于各種瓊脂斜面培養，所得的培養物即為純培養物，培養后膠塞密封，置-4O ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 鏡檢

將待檢菌株做成菌液涂片，用革蘭染色法染色，選取在顯微鏡視野中顯示為紅色或粉紅色的兩端鈍圓、兩端濃染的中等大小的革蘭陰性桿菌菌株進行生化鑒定。

1.2.3 菌株的生化鑒定

按常規方法進行三糖鐵試驗、吲哚試驗、甲基紅驗、二乙酰試驗、糖發酵試驗、檸檬酸鹽利用試驗。

1.2.4 致病性試驗

取120只體重18 g～22 g的健康小白鼠。挑取普通瓊脂斜面上純培養的菌落，接種于營養肉湯培養基中。隨機選取60只小白鼠作為試驗組，腹腔注射肉湯培養物0.1 mL/只;剩下的60只小白鼠作為對照組，腹腔注射肉湯0.1 mL/只，24 h～48 h內觀察小鼠的死亡情況，取死亡或發病的小白鼠肝臟抹片，革蘭染色、鏡檢，并取病料接種于麥康凱瓊脂觀察結果。

1.3 藥敏試驗

本藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法。

2? 試驗結果

2.1 分離培養

在普通瓊脂平皿板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起、中等大的菌落，直徑2 mm～3 mm。在血液瓊脂平板上長出菌落較大、邊緣整齊并有隆起的灰白色菌落，多數不溶血。在麥康凱瓊脂平板上生長出圓形、光滑、隆起、大小均一的紅色菌落（中央顏色稍深）;普通肉湯呈均勻一致混濁狀。

2.2 細菌形態學觀察

病死仔豬的組織培養物涂片染色鏡檢，均可見兩端鈍圓，多數散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭陰性短桿菌。

2.3 動物致病力試驗結果

在試驗組60只小白鼠中，42只在24 h內死亡，16只在30 h死亡，另外2只發病;對照組小白鼠不發病。發病及死亡小白鼠的心血抹片經革蘭染色鏡檢為革蘭陰性中等小桿菌，將該心血接種于麥康凱瓊脂培養基上均為紅色菌落。

2.4 生化鑒定結果

60株菌均能在三糖鐵培養基上產酸產氣，使培養基變黃，均不產生硫化氫，均能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。甲基紅（methyl red，M-R）試驗、吲哚試驗為陽性。均不能利用檸檬酸鹽，伏-波試驗（voges-proskauer，V-P）試驗陰性。根據生化特性，表明分離的菌為大腸桿菌（表1）。

2.5 藥敏試驗結果

2.5.1 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株對16種抗生素的耐藥情況

仔豬黃白痢大腸桿菌產生耐藥性嚴重的抗生素依次為SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM、NOR、AMK、ENO、N、ERY、DOX、CFZ、PXB，其中耐藥率大于或等于50%的? ? 9種抗生素，分別為SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM和NO;耐藥率小于30%的抗生素有3種，分別為DOX、CFZ、PXB;結果見表2和圖1。

2.5.2 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株對16種抗生素的多重耐藥情況

在60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株中，沒有不耐藥和僅耐1種、2種抗生素的分離菌株，對3種、4種、5種、8種、9種、10種、11種、13種和14種抗生素有耐藥性的大腸桿菌分離株分別為2株、5株、4株、7株、3株、15株、11株、8株和5株，結果見圖2。

2.5.3 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株的耐藥譜

60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株有45種耐藥譜。4株分離株的耐藥譜完全相同，大多數分離株都具有不同的耐藥譜。主要的耐藥譜見表3。

3? 分析與討論

3.1 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株藥敏試驗及耐藥譜分析

采用Kirby-Bauer法，60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株的藥敏試驗結果（圖1）表明，在16種抗生素中，抑菌作用最強的是獸醫臨床上尚未使用或應用較少的頭孢唑啉和多粘菌素，敏感菌株分別占90.0%（54/60）、90.0%（54/60）;其次為強力霉素、紅霉素、新霉素和恩諾沙星，敏感菌株分別占73.3%（44/60）、70.0%（42/60）、68.3%（41/60）和63.3%（38/60）;而復方新諾明、氯霉素、鏈霉素、呋喃唑酮和氨芐青霉素等藥物則表現出很高的耐藥性，耐藥率分別為88.3%、81.7%、78.3%、75.0%和73.3%;環丙沙星及諾氟沙星的耐藥率也很高，分別為60.0%和56.7%。這與國內外有關文獻大體吻合。馬紅霞等報道，大腸桿菌對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、呋喃妥因同時耐藥的菌株已達半數;RolandLanz等報道豬（腹瀉、水腫?。┐竽c桿菌分離株對慶大霉素、鏈霉素、壯觀霉素、四環素、呋喃妥因的耐藥性多見，對恩諾沙星的耐藥率較高。

3.2關于抗菌藥物的使用方法

抗菌藥物的選擇應考慮采取聯合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，一方面可以充分發揮抗菌藥物之間的協同作用，增加療效：另一方面可以避免細菌長期與某一種藥物接觸，增加耐藥性的產生概率。

建議停用已普遍產生耐藥性和臨床上已明顯無效的藥物，選用目前應用較少和經藥敏試驗證明對仔豬黃白痢大腸桿菌敏感的先鋒霉素、多粘菌素、壯觀霉素等藥物。敏感藥物的選擇空間十分狹小，而研發新藥又需要大量的人力、物力和財力，并且還有研制周期長、風險大等問題[3]，因此，開展聯合應用抗菌藥物的研究，充分發揮抗菌藥物之間的協同作用，顯得十分必要和迫切。

4? 結論

隨著抗生素在養豬生產中不斷使用，耐藥性菌株不斷涌現，且出現的菌株多為對多種甚至是14種抗生素有耐藥性，這些結果與杜銀中、朱力軍及馬紅霞等報道的基本一致。如果在生產中仍不加控制地使用抗生素，隨著時間的推移，大腸桿菌的耐藥率必將大幅度上升，多重耐藥菌株將迅增，耐藥譜增寬[4]，豬病的防治將面臨嚴峻的挑戰。因此，廣大養豬生產者應嚴格遵守禁抗令，給動物生產營造一個科學的用藥環境。

參考文獻

[1] 熊焰，李德生，張和民，等. 大腸桿菌的藥敏試驗[J]. 中國獸醫科技，1999，29（3）：35-36.

[2] 石巖，梅世昌. 醫學動物實驗實用手冊[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

[3] 王秀茹. 預防醫學微生物及檢驗技術（第二版）[M]. 北京：人民衛生出版社，2002.

[4] 任家琰，馬海利. 動物病原微生物學[M]. 北京：中國農業科技出版社，2001.