長鏈非編碼RNA NORAD對氧化型低密度脂蛋白誘導內皮細胞功能障礙的影響及機制

趙曉雪，張冰玉，劉宇翔

遼寧省金秋醫院綜合老年醫學科三病房，沈陽110016

動脈粥樣硬化（AS）是全球發病和死亡的首要原因，但目前為止其發病機制仍未完全明確。已知的公認發病機制包括代謝紊亂、內皮細胞功能障礙、免疫反應異常以及慢性動脈壁炎癥等。內皮細胞功能障礙是AS病變的首要步驟，可以通過對一氧化氮的生物利用度、縮血管物質生成、血小板聚集、趨化因子生成、單核細胞貼壁等方面的影響，最終導致AS的發生及進展［1］。AS的發病機制復雜，涉及因素較多，因此探索新的機制仍具有迫切性和現實意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）能夠通過修飾和調控編碼基因的轉錄，直接與蛋白質或編碼蛋白本身結合，從而影響多種生物學過程?，F有研究顯示lncRNA在心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚、心律失常等心血管疾病的發生發展中均發揮了關鍵的作用，顯著影響患者的預后和生存［2］。越來越多的證據表明，lncRNA將成為一種有前景的藥物治療靶點。lncRNA NORAD可以維持細胞基因組的穩定，與腎癌、淋巴瘤等的不良預后有關，但在AS發病過程中的作用仍不明確。本課題組在2020年6月—11月，對NORAD與AS之間的關系進行了初步研究，通過觀察NORAD對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的內皮細胞功能障礙的調控作用，探討其對AS的影響及潛在分子機制，為疾病的診斷和治療提供新的生物標志物和靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）購自上海中喬新舟生物科技有限公司，ox-LDL購自北京協生生物科技有限責任公司，Opti-MEM購自美國GIBCO公司，Powder瓊脂糖購自法國Biowest公司，FastDigest BamHI、FastDigest HindⅢ購自上海Thermo Scientific公司，Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司，質粒大量制備試劑盒、TRIpure、Super M-MLV 反 轉 錄 酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix購自北京BioTeke生物技術有限公司，SYBR Green購自德國Sigma公司，Western及IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和其他Western blotting試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司，核因子κB p65（NF-κB p65）與磷酸化核因子κB抑制蛋白（p-IκBα）購自Abclonal公司，山羊抗兔IgG購自beyotime公司，Histone H3購自proteintech公司，β-actin購自BOSTER公司，白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及細胞間黏附分子1（ICAM-1）的ELISA檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.2 HUVECs的培養與ox-LDL處理 將HUVECs接種于6孔板中，分為陰性對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3，用含20%胎牛血清的M199完全培養基于37℃、5%CO2的培養箱內培養，待細胞貼壁換用無血清的基礎培養基處理HUVECs 1 h，各組分別加入0、50、100、200 μg/mL的ox-LDL，24 h后收集細胞進行后續實驗。

1.3 質粒載體構建 根據人NORAD的序列，設計shRNA退火引物并合成共50μL的反應體系進行引物退火。利用質粒大量制備試劑盒提取目的質粒。根據實驗設計的酶切位點對提取的質粒進行雙酶切，電泳檢測。退火產物與雙酶切后的干擾載體片段連接。連接產物加入至感受態細胞中，在含有Amp的瓊脂平板上培養，形成單菌落。挑選菌落，鑒定插入的片段，選取陽性克隆，制備菌保送測序。1.4 HUVECs的轉染 將HUVECs接種于6孔板，分為陰性對照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組。培養待貼壁。用Opti-MEN培養基分別稀釋Lipofectamine2000、shNORAD和shNC。將已稀釋的Lipofectamine2000溶液分別與shNORAD（NORAD的干擾RNA）、shNC（非特異性的干擾RNA）溶液混勻，室溫孵育20 min，待用。參照Lipofectamine2000試劑盒說明書，ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組分別轉染shNC、shNORAD，轉染后繼續培養48 h。ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組加入200μg/mL的ox-LDL處理24 h后進行后續試驗。

1.5 HUVECs內NORAD表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。用TRIpure試劑分別提取1.2與1.4中各組HUVECs的總RNA，紫外分光光度計測定各樣本的RNA濃度，計算逆轉錄所需的RNA體積。保證RNA上樣量一致，以Oligo（dT）15和Random為引物，進行反轉錄以得到相應的cDNA。PCR的反應體系為20μL，其中包括1μL的cDNA模板，各0.5μL的上下游引物。lncRNA NORAD正向引物序列5'-GGAGAATCGCTTGAACT-3'，反向引物序列5'-CAAACACCCAATGAATAG-3'；β-actin正向引物序列5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物序列5'-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3'。反應條件：94℃ 5 min，94℃ 15 s變性，60℃ 25 s退火，72℃30 s延伸。用2-ΔΔCt法計算NORAD相對表達量。

1.6 HUVECs內NF-κB p65、p-IκBα表達檢測 采用Western blotting法。分別收集1.2與1.4中各組的HUVECs，用細胞裂解液于冰上充分裂解樣本。開啟冷凍離心機，12 000 r/min 4℃離心10 min，分離上清即為蛋白質提取物。BCA法測量提取的每組蛋白濃度。制備蛋白上樣液，每孔含40μg蛋白。用SDS-PAGE電泳分離蛋白質后，將蛋白質轉至PVDF膜。用TBST緩沖液配制5%脫脂奶粉，將PVDF膜置于脫脂奶粉中封閉1 h。在雜交袋內放入配制好的NF-κB p65、p-IκBα抗體工作液與封閉的PVDF膜，4℃過夜，孵育一抗。取出PVDF膜，TBST洗膜4次，每次5 min。然后將PVDF膜與辣根過氧化物酶標記的二抗共同于室溫下孵育45 min。再次TBST洗膜6次，每次5 min。ECL化學發光試劑浸濕PVDF膜，暗室曝光。用凝膠圖象處理系統分析目標條帶的光密度值進行統計分析。

1.7 HUVECs內 IL-6、TNF-α、ICAM-1檢測 采用ELISA法。用包被液稀釋包被抗體至濃度為10μg/mL，4℃包被過夜。用PBST將IL-6、TNF-α與ICAM-1標準品分別從1 000 pg/mL開始做倍比稀釋，濃度分別為 500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/mL。將稀釋后的標準品各100μL，依次加入96孔板中，空白孔內加入1×PBST，樣本孔內分別加入100μL陰性對照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組的待測樣本，37℃孵育2 h。甩掉孔內的液體，加入捕捉抗體100μL，37℃孵育1 h。用PBST洗板3次，每次2 min。加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素100μL，37℃孵育30 min。用PBST洗板5次，每次2 min。每孔內加入100μL的TMB顯色液，37℃孵育15 min后加入終止液。酶標儀測定450 nm處的各孔OD值。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據不同樣本的OD值計算出相應的樣本濃度。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism7.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用非配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度ox-LDL處理后HUVECs內NORAD的表達變化 陰性對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3 NORAD的相對表達量分別為1.00±0.05、1.41±0.03、3.19±0.06、3.95±0.22，陰性對照組與實驗組2、實驗組3相比，實驗組2與實驗組3相比，P均＜0.05。

2.2 不同濃度ox-LDL處理HUVECs后NF-κB通路的變化 陰性對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3 NF-κBp65的相對表達量分別為1.00± 0.04、1.90±0.05、2.98± 0.06、4.08± 0.03，p-IκBα的相對表達量分別為1.00±0.02、1.66±0.05、3.15±0.07、3.53±0.04，組間兩兩相比P均＜0.05。選擇200μg/mL作為后續試驗的ox-LDL濃度。

2.3 shNORAD的轉染效率 陰性對照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組中NORAD的相對表達量分別為1.00±0.02、4.01±0.21、3.94±0.16、0.76±0.01，ox-LDL+shNORAD組與ox-LDL+shNC組相比P＜0.05。

2.4 NORAD對NF-κB通路的調控作用 陰性對照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組中NF-κB p65的相對表達量分別為1.00±0.05、3.93 ± 0.03、4.04 ± 0.04、3.05 ± 0.05，p-IκBα的相對表達量分別為1.00±0.02、3.60±0.08、3.49±0.09、2.89±0.06，ox-LDL+shNORAD組與ox-LDL+shNC組相比P＜0.05。

2.5 NORAD對HUVECs分泌功能的調控作用 陰性對照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組中IL-6水平分別為（52.53±0.31）、（215.40 ± 0.39）、（218.30 ± 0.45）、（203.60 ±0.38）pg/mL，TNF-α水平分別為（45.75± 0.29）、（172.70 ± 0.34）、（168.40 ± 0.34）、（160.80 ±0.41）pg/mL，ICAM-1水平分別為（92.36± 0.65）、（318.20 ± 0.33）、（315.30 ± 0.33）、（297.90 ±0.83）pg/mL，陰性對照組與ox-LDL組相比，ox-LDL+shNORAD組與ox-LDL+shNC組相比，P均＜0.05。

3 討論

內皮細胞功能障礙、氧化應激和慢性炎癥共同誘發并維持AS的病變過程［3］。內皮細胞功能障礙發生在AS的早期，表現為抗炎、抗凝功能的變化以及調節血管舒縮能力的受損。而ox-LDL可以通過多種機制促進AS斑塊的形成和發展，包括誘導內皮細胞功能障礙。ox-LDL可以介導內皮細胞的活化，通過上調單核細胞趨化蛋白1、IL-8、E-選擇素、血管間黏附分子等趨化因子和黏附分子的表達，促進循環單核細胞黏附到血管內皮。ox-LDL可以減少內皮細胞釋放血管舒張劑一氧化氮；通過消耗質膜微囊內的膽固醇取代內皮型一氧化氮，抑制一氧化氮的生成；以及促進活性氧的生成，滅活一氧化氮。ox-LDL還能夠刺激內皮細胞產生內皮素、血管緊張素Ⅱ等血管收縮因子。ox-LDL激活caspase-9、caspase-3及Fas等凋亡因子，降低凋亡蛋白Bcl-2的表達，誘導內皮細胞的凋亡，促使血管對細胞和脂質的通透性增加。ox-LDL還可以誘導內皮細胞生成更多的ROS，介導氧化應激反應［4］。研究顯示，NF-κB信號通路與內皮細胞功能障礙之間存在著關系。替格瑞洛和氯吡格雷可以通過抑制NF-κB信號通路，減輕LPS誘導的內皮細胞功能障礙［5］。另一項實驗顯示，富組氨酸糖蛋白通過抑制NF-κB信號通路的活性，減少TNF-α/LPS誘導的細胞因子釋放，改善內皮細胞功能［6］?？傊瓵S的治療目前仍以調脂、預防血栓形成為主。但由于其發病機制是多方面的，當前的針對性治療尚不能覆蓋所有方面。進一步深入研究AS的發病機制，為治療提供新的靶點和策略是臨床醫生的關注重點。lncRNA由于能夠在表觀遺傳學水平上調控多種疾病的病理生理過程，其與AS的關系成為研究的熱點。

隨著基因技術的不斷發展，人們逐漸意識到大約98%的基因組轉錄為非編碼RNA。這些轉錄本中，長度超過200個堿基對的被稱為lncRNA。lncRNA雖然無法編碼蛋白質，但是越來越多的證據表明其在細胞分化、運動、凋亡以及基因表達模式的改變中起著關鍵作用［7-9］。lncRNA參與了多種心血管疾病的發病過程。lncRNA TCONS-00106987通過內源性競爭miRNA-26，誘導其靶基因KCNJ2的轉錄，促進電重構，從而增加內向整流K＋電流，縮短心房有效不應期，誘導房顫的發生［10］。lncRNA也參與了對缺血性心臟病的調節，FOXO3a通過促進lncRNA LINC00261的轉錄，下調miR-23b-3p的表達，提高NRF2的水平，減輕了缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡，改善了心功能［11］。lncRNA可通過多個方面調控AS的病理過程。CHI等［12］發 現，沉 默 lncRNA HOXA-AS3可 以 通 過 調控miR-455-5p/p27 Kip1軸，減輕ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡、生長抑制以及G1周期阻滯，從而抑制AS的進展。而另一lncRNA PEBP1P2則通過與CDK9結合，抑制血管平滑肌細胞的增殖、遷移和去分化，減輕AS病變［13］。目前為止有關lncRNA與AS之間關系的研究仍十分有限，進一步的機制研究很有必要。本實驗試圖從lncRNA對內皮細胞功能障礙的影響入手，揭示lncRNA對AS病理生理變化的影響。

NORAD通過阻斷PUMILIO蛋白的作用來維持基因組的穩定性。由于其獨特的特性，很快便成為研究的焦點。后續的研究表明，NORAD在不同類型的癌癥中處于功能失調狀態，并與癌癥發生發展的幾個關鍵過程有關，如細胞增殖、侵襲、轉移和凋亡［14-15］。由于lncRNA參與了多種心血管疾病的病理生理過程，本實驗擬探討lncRNA NORAD在AS過程中的作用及潛在的分子機制。由于氧化應激反應是AS重要的始動和維持因素，因此本實驗首先用ox-LDL構建細胞損傷模型，分別用 0、50、100、200μg/mL四種不同濃度的ox-LDL處理HUVECs 24 h。之后的檢測發現，隨著ox-LDL濃度的升高，NORAD在HUVECs中的表達也逐漸上調。由于NF-κB通路的異常與腫瘤、免疫反應、炎癥等疾病相關，且其也參與了AS的過程。本實驗接下來驗證NF-κB通路在氧化應激情況下的變化，結果顯示HUVECs中 NF-κB 通路的關鍵因子 NF-κB p65與p-IκBα的表達也隨著ox-LDL濃度的增加而上調。因此選擇了200μg/mL的ox-LDL繼續后續實驗。NORAD 可 參 與 NF-κB 信 號 通 路 的 調 節［16］，推 測NORAD可能通過對NF-κB通路的調節，影響內皮細胞的功能障礙。為了證實上述的假設，本實驗構建了shNORAD質粒載體，并轉染HUVECs以下調NORAD的表達，經過200μg/mL的ox-LDL處理后，與非特異性序列shNC轉染的HUVECs相比，ox-LDL+shNORAD組NF-κB p65與p-IκBα表達下調。提示NORAD表達下調抑制了NF-κB通路的活性。內皮細胞功能障礙的表現之一為趨化因子、炎癥因子分泌的異常。進一步實驗顯示，與陰性對照組相比，ox-LDL組HUVECs分泌的IL-6、TNF-α、ICAM-1水平升高，提示氧化應激加重了內皮細胞的功能障礙。轉染后，與ox-LDL+shNC組相比，ox-LDL+shNORAD 組 HUVECs分泌的 IL-6、TNF-α、ICAM-1水平降低，提示在氧化應激的情況下，內皮細胞的功能障礙得到了部分的逆轉。

綜上所述，lncRNA NORAD表達下調可以減少氧化應激情況下內皮細胞分泌趨化因子與炎癥因子，其可能是通過抑制NF-κB通路的活性發揮作用，可能成為AS新的診斷標志物和治療靶點。