高粱鉀離子通道Shaker蛋白家族的鑒定及生物信息學分析

歐陽浩　蔣君梅　杜巧麗　方遠鵬　李向陽　謝鑫

摘 要：Shaker蛋白家族是植物體攝入鉀元素的重要通道，其對植物環境耐受性發揮著重要的作用。本研究在高粱全基因組中鑒定了Shaker蛋白家族成員，并對其進行生物信息學分析。結果表明，高粱中共鑒定到9個Shaker家族成員，共可分為5個亞族，且處于同一個亞族的基因結構以及蛋白質結構相似;亞細胞定位顯示，這些成員均定位于細胞質膜上;共線性分析結果表明，高粱Shaker蛋白家族在禾本科的進化歷程中相對保守;組織特異性及模擬干旱表達結果顯示，Shaker成員具有明顯的組織特異性與干旱應答差異。本研究有望為進一步研究高粱Shaker蛋白家族的生物學功能提供理論基礎。

關鍵詞：高粱;Shaker家族;生物信息學分析

中圖分類號：S514? 文獻標識碼：A

基金項目：國家自然科學基金（31801691，32060614）;貴州省科技計劃（黔科合支撐[2019]2408）;貴州省高層次留學人才創新創業擇優資助項目（[2018]02）;大學生“SRT計劃”項目（貴大SRT字[2019]329）

文章編號：1008-0457（2021）05-0001-09? ? 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.05.001

Identification and Bioinformatics Analysis of Shaker Protein Family of Potassium Channels in Sorghum

OUYANG Hao1，JIANG Junmei1，2，DU Qiaoli1，FANG Yuanpeng1，LI Xiangyang2，XIE Xin1*

（1.Key Laboratory of Agricultural Microbiology，College of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Shaker protein family is an important channel of potassium uptake for plant，which plays an important role in plant environmental tolerance.Here，members of the Shaker protein family were identified in the whole genome of sorghum and thenanalyzed by bioinformatics.The results showed that a total of 9 Shaker members were identified in sorghum，which could be divided into 5 subfamilies.Gene structure and protein structure of members of the same subfamily were similar.The results of subcellular localization showed that all these members were located on the cytoplasmic membrane.Based on the results of collinear analysis，the Shaker protein family of sorghum was relatively conservative in the evolution of Gramineae.According to the results of tissue specificity and simulated drought expression showed that Shaker members had significant differences in tissue specificity and drought response.In words，this study is expected to provide a theoretical basis for further study of the biological function of sorghum Shaker protein family.

Keywords：sorghum;Shaker family;bioinformatics analysis

鉀作為植物細胞內主要的無機成分之一，占植株總干重的10%，在植物多種生命活動中具有重要意義[1-4]?，F有研究表明，鉀離子可以提高植物對干旱、鹽堿等非生物脅迫的耐受性，同時也可以抵抗真菌等生物脅迫[5]。由于正常土壤中鉀離子的含量遠低于植物細胞質中含量[6]，植物的生長需要根系從土壤溶液中吸收大量的鉀離子，并分布到整個植物中，以維持各個器官的正常運轉，植物鉀離子通道Shaker家族在這個過程中起到了至關重要的作用。

Shaker蛋白家族是通道蛋白中功能保守的一種，該蛋白家族廣泛存在于各種植物中[7-8]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的Shaker家族由9個成員組成[9-10]，根據其功能特點可劃分為5個亞組：內向整流通道I（Inward Rectifying Channel I）：AKT1、AKT5、SPIK;內向整流通道II（Inward Rectifying Channel II）：KAT1、KAT2;弱內向整流通道（Weakly Inward Rectifying Channel）：AKT2;參與向內整流電導形成的調節亞基（Regulatory Subunit Involved in Inwardly Rectifying Conductance Formation）：KC1（KAT3）;以及向外整流通道（Outward Rectifying Channel）：SKOR、GORK[11-13]。Shaker家族成員具有4個特殊的蛋白結構域，分別是植物特異性的跨膜鉀離子通道結構域：Ion_trans_2、存在于在離子通道與cNMP依賴性激酶中的結構域：cNMP、含有多個重復短序列的結構域：ANK以及富含疏水性和酸性殘基的鉀離子通道的二聚化結構域：KHA[12]。正是因為這四種結構域的相互協作，Shaker蛋白可以通道形成異源四聚體結構[13]，可以使植物調節不同細胞中的鉀離子轉運活性[8]。在擬南芥中，9個鉀離子通道中有7個成員具有內向整流特性，而外向整流通道僅有兩個成員，分別為：中柱外向整流型通道（SKOR）和保衛細胞外向整流型鉀離子通道（GORK）[14]。同時，Shaker蛋白家族成員具有明顯的組織特異性;例如，擬南芥AtAKT1、AtKC1主要在植物根中表達[14-15]，而AtSPIK則主要在萌發的花粉管中表達，AtSKOR主要在擬南芥的根莖組織中表達，AtGORK主要在保衛細胞中表達[16]。

高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）具有喜溫、抗旱、耐貧瘠等優良特點。在食用、藥用、釀酒以及飼料制作等方面有著重要意義，但其嚴重環境脅迫仍影響其生產[17-18]。高粱作為重要的經濟作物及C4植物，對其開展Shaker通道的系統分析，對高粱及其他C4植物抗逆研究具有指導價值。然而，目前Shaker通道的系統分析局限于擬南芥、水稻（Oryza sativa）、紫花苜蓿（Medicago truncatula）等C3植物中，但包括高粱、小米在內的C4植物中Shaker通道的系統分析尚且缺乏。本研究通過生物信息學的方法對高粱Shaker家族進行了全基因組鑒定，染色體定位分析，基因結構分析，系統進化發育分析，為進一步探究高粱鉀離子通道Shaker蛋白家族提供基礎。

1 材料與方法

1.1 高粱Shaker蛋白家族成員的鑒定

擬南芥Shaker蛋白家族的序列來源于擬南芥數據庫（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）。利用生物信息分析軟件TBtools 1.0的Simple HMM Search功能[19]。根據已報道的擬南芥Shaker家族成員作為蛋白源序列建立的比對序列徽標（PF00520、PF07885、PF00027、PF11834）檢索EnsemblPlants數據庫，最終得到符合搜索條件的Shaker成員。然后利用在線網站SMART和NCBI-CD檢測所獲取序列的保守蛋白質結構域，進一步篩選，最終獲得高粱Shaker蛋白家族全部成員。

1.2 高粱Shaker蛋白家族成員的理化性質及亞細胞定位預測

用ExPASy-ProtParam Tool預測SbShakes的基本理化性質;根據Softberry（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線網站進行SbShakers蛋白的亞細胞定位預測。

1.3 高粱Shaker蛋白家族系統進化樹構建以及亞族分組確定

利用CLUSTALW將擬南芥、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、水稻（Oryza sativa）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）以及高粱的Shaker蛋白序列進行多序列比對分析。并通過鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）在MEGA 7.0中構建系統進化樹，自展值（Bootstrap）設定為1000[20]。并使用在線網站Evolview對進化樹進行美化。

二穗短柄草、水稻、馬鈴薯、玉米的Shaker基因家族的序列來源于EnsemblPlants（https：//plants.ensembl.org/）植物數據庫。

1.4 高粱Shaker蛋白家族成員保守基序及基因結構分析

利用MEME在線網站（https：//meme-suite.org/）預測分析SbShakers蛋白保守功能基序，再結合TBtools對高粱Shaker家族成員進行基因結構分析。

1.5 高粱Shaker蛋白家族成員染色體定位分析

利用生物信息分析軟件TBtools 1.0的Show Genes on Chromosome功能，對已經鑒定的高粱中的SbShakers進行染色體定位分析。

1.6 高粱Shaker蛋白家族成員共線性分析

利用TBtools 1.0軟件MCScanX功能對高粱Shaker成員進行成員進化的共線性分析，研究不同物種間Shaker家族成員的同源性。

1.7 高粱Shaker蛋白家族的組織及脅迫表達分析

通過在線網站高粱功能組學數據庫（http：//structuralbiology.cau.edu.cn/sorghum/index.html）收集SbShakers成員的組織特異性以及環境脅迫處理表達數據，建立高粱Shaker蛋白家族表達熱圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 高粱Shaker蛋白家族鑒定結果分析

運用生物信息學方法對蛋白結構域篩選驗證后，從高粱全基因組中鑒定到9個Shaker家族成員，根據位于染色體位置順序依次命名為：SbShaker1～SbShaker9（表1）。

高粱Shaker家族的氨基酸序列長度介于601 aa（SbShaker4）與919 aa（SbShaker1）之間;分子量介于65.80 kDa（SbShaker4）與100.65 kDa（SbShaker1）之間;等電點介于5.95（SbShaker9）和8.63（SbShaker3）之間;等電點在7左右，說明該家族可能是一類中性蛋白;在對Shaker家族進行其亞細胞位置預測后發現，該家族成員全部位于細胞質膜上，這與Shaker家族通道蛋白的功能特點相符（表1）。應用SMART 和NCBI-CD中分析結構域，發現4個保守蛋白結構域，它們分別為Ion_trans_2結構域、cNMP結構域、ANK結構域和KHA結構域。其中Shaker3、Shaker4、Shaker5不存在ANK結構域，這一結果與擬南芥Shaker家族成員中的AKT1、KAT3、KAT1相同。說明ANK結構域在物種間遺傳中并不是非常保守，同時也說明了高粱與擬南芥Shaker蛋白家族結構的相似性。

2.2 高粱Shaker蛋白家族系統進化分析

為了進一步驗證高粱Shaker蛋白家族系統進化情況，構建高粱與擬南芥、二穗短柄草、水稻、馬鈴薯、玉米Shaker蛋白家族系統進化樹（圖1）。其

中I亞族成員為：Sbshaker1、Sbshaker2，II亞族成員為：Sbshaker5，III亞族成員為：Shaker6、Shaker7、Shaker8，IV亞族成員為：Shaker3、Shaker4;Ⅴ亞族成員為：Shaker9。與擬南芥不同的是，在擬南芥Shaker蛋白家族中Ⅴ亞族成員有兩個，分別為SKOR和GORK。這兩個基因在擬南芥中作為向外整流通道而存在。因此可以推測出，高粱鉀離子通道中的外整流通道與擬南芥進行了兩個不同的進化歷程。除此之外，在I、II、IV亞族的成員個數也與擬南芥中亞族成員不一致。由此可見，高粱中Shaker通道的亞族成員在禾本科植物的不斷進化中，可能發生了不保守遺傳。

2.3 高粱Shaker蛋白家族保守基序及基因結構分析

對高粱Shaker蛋白家族進行了蛋白保守結構基序分析，共預測到18個保守基序（Motif），同時對這些基序進行注釋，結果顯示Motif 1、Motif 3對應Ion_trans_2結構域、Motif 2、Motif 5對應cNMP結構域，Motif 4、Motif 10對應ANK結構域，Motif 6、Motif 9對應KHA結構域;此外在I亞族中Shaker2的cNMP結構域中多了Motif 8;III亞族中每一個成員的cNMP結構域都多了Motif 15;IV亞族成員都不存在ANK結構域;II亞族成員中Ion_trans_2結構域中多了Motif 14;Ⅴ亞族中的KHA結構域缺少Motif 6。分析結果表明Shaker家族成員的結構域并不是完全保守，高粱Shaker蛋白家族可能在物種進化中發生某些功能的缺失和增加（圖2）。

對高粱Shaker蛋白家族結構分析可知，9個成員中SbShaker4不含有非蛋白編碼區，全為蛋白編碼區段，剩余成員既含有編碼區段，又含非編碼區段。其中，SbShaker2、SbShaker5、SbShaker9均含有11個編碼區;SbShaker6、SbShaker7含有6個編碼區;SbShaker1含有9個編碼區;SbShaker3含有7個編碼區;SbShaker8含有8個編碼區;與系統發育分析結果一致的是，聚集在同一亞族中的SbShakers成員，具有相同或相似外顯子/內含子結構和基因長度（圖2）。這也表明了SbShakers基因結構具有保守性。其次，Shaker家族基因結構中其內含子數目為0～10個，說明即使是相同亞類家族成員之間，其外顯子和內含子的數量也存在較大的差異（圖2）。

2.4 高粱Shaker蛋白家族染色體定位分析

通過生物信息學分析軟件TBtools對9個高粱Shakers家族基因進行染色體定位分析。結果顯示：9個基因主要分布在2、3、4、9和10號染色體上;Shaker1分布在2號染色體上端，Shaker2、Shaker3處于3號染色體下端，Shaker4位于4號染色體上端，Shaker5位于4號染色體下端，Shaker10處于10號染色體上端。其中III亞族成員（Shaker6、Shaker7、Shaker8）全部位于9號染色體下端。而其他亞族成員不均等分布在其他染色體上?？深A測III亞族的成員（SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8）履行著相近或相同的生物學功能（圖3）。

2.5 高粱Shaker家族成員共線性分析

為深入研究不同物種間Shaker蛋白家族成員的同源性，利用模式植物：水稻，禾本科植物：二穗短柄草、高粱、玉米、谷子，繪制了5種Shaker基因家族共線圖（圖4）。共發現43對共線性基因。其中，每一個植物與另一物種的Shaker成員都出現了一個基因與多個基因或者多個基因與單個基因呈共線關系?？傻贸?，在這些物種的進化過程中發生了多個基因拷貝，其次通過對各個物種間的共線性傳遞的數量以及每個物種之間Shaker成員的數量可以分析出，高粱Shaker蛋白家族在禾本科的進化歷程中相對保守。

2.6 高粱Shaker蛋白家族的組織及脅迫表達分析

對高粱Shaker蛋白家族9個成員在胚芽（Embryos）、花分生組織（Floral meristem）、花（Flowers）、營養分生組織（Vegetative meristem）、根（Root）、葉（Shoot）6個部位進行組織表達分析（圖5）。結果顯示，高粱在不同組織部位中的表達量差異顯著。I亞族成員：SbShaker1、SbShaker2表達差異較大，SbShaker1幾乎在上述部位中不表達，SbShaker2卻在除了花器官中的組織中都有表達，特別是在花分生組織表達量最高;II亞族成員：SbShaker4在芽、胚芽、花分生組織中少量表達;III亞族成員：SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8在上述組織中表達差異較大。其中，SbShaker6在上述組織中均表達，而且在營養分生組織、芽、花中的表達量最高;SbShaker7在花中少量表達;SbShaker8在六個組織部位均不表達。IV亞族成員SbShaker3、SbShaker5在各組織中均表達，由此得出該亞族成員主要在成熟器官中表達。其中V亞族成員SbShaker9在根部、花中的表達量最高，這與擬南芥、水稻中報道的類似。

此外，對SbShakers進行激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、聚乙二醇模擬干旱（Polyethylene Glycol，PEG）分析（圖6）。結果顯示，I亞族成員： SbShaker1、SbShaker2在高粱的根與葉中表達量有所不同。SbShaker1在脫落酸、聚乙二醇處理下基因表達量變化極不顯著，SbShaker2在脫落酸、聚乙二醇處理，在根中表達量下調，而在葉中表達出現少量上調趨勢;II亞族成員：SbShaker5在高粱根中的表達，基本不受脫落酸與聚乙二醇的影響，但在葉中SbShaker5表達量卻顯著提高;III亞族成員：SbShaker7、SbShaker8在脫落酸與聚乙二醇處理，表達不顯著，但SbShaker6在脫落酸處理，其基因表達量顯著下調。IV亞族成員SbShaker3、SbShaker4在脫落酸與聚乙二醇處理表達也不明顯。V亞族成員SbShaker9的表達量則與環境中脫落酸與聚乙二醇呈正相關，且通過外源施加脫落酸還會導致SbShaker9的基因表達量出現明顯的上升的趨勢。

3 結論與討論

鉀是一種重要的礦質元素，在植物體內的各項生命活動中都發揮重要作用，如膨脹度調節、細胞伸長、氣孔和葉片運動以及酶活性調節方面[1-3，21]。其中Shaker蛋白家族是一類維持植物體內鉀離子穩態的重要通道蛋白，該家族在植物體進行環境抗逆方面發揮著極其重要的作用[22-24]。本研究對高粱Shaker蛋白家族進行全基因組鑒定，并從進化、基因表達等方面進行系統分析。在高粱中共鑒定到9個成員，并按基因及蛋白結構特征，分為5個亞家族（亞族I～亞族V）。前人的研究結果顯示，擬南芥和馬鈴薯（Solanum tuberosum）共有9個Shaker蛋白;水稻和甘薯（Ipomoea batatas）有11個;梨（Pyrus × bretschneideri）有8個，說明高粱的Shaker家族成員在物種進化過程中相對保守[25-28]。但與擬南芥、水稻的成員分布不同的是：高粱中鑒定到Shaker通道的III亞族中有3個（Shaker6、Shaker7、Shaker8），而在擬南芥中僅有1個（AtAKT2）;在V亞族中擬南芥有2個成員（AtGORK、AtSKOR），而高粱中僅有SbShaker9，該結果與豆科模式植物苜蓿（Medicago truncatula）類似[29-30]，說明不同的物種為了適應不同環境，對Shaker通道進行了基因拷貝或系統性缺失。

Shaker蛋白通道廣泛存于在植物的各個組織細胞中，具組織表達特異性[9-11]。AKT1是從吸收鉀離子缺陷酵母突變體功能互補中所克隆出的鉀離子通道基因，主要在擬南芥根中表達，它能響應外界鉀離子濃度的變化來調節植物根中生長所必需的鉀元素量，進而影響生長素在根中的重新分配[31-32]。SPIK是擬南芥中I亞族的成員，主要在花粉中特異性表達，它在維持花粉管的正常發育中起著重要作用[16]。高粱Shaker蛋白家族中I亞族成員中：SbShaker2在高粱的根中有表達，而且在胚芽、花的分生組織中的表達量最高。由此可預測高粱Shaker成員SbShaker2與擬南芥中AKT1蛋白可能具有類似的功能。KAT1是擬南芥中II亞族中的代表成員，主要表達在葉片保衛細胞，在根和莖維管組織中也有少量表達[33]。本研究結果與該結論相似，從高粱鑒定到Shaker蛋白家族的II亞族成員SbShaker4，主要在花的分生組織中表達，在根中有少量表達。說明SbShaker4與擬南芥AKT1蛋白在功能方面，具有一定的相似性。AKT2是擬南芥中表達最具特點的成員，在整個植物韌皮部組織中都有表達，它是Shaker家族中唯一具有兩相激活動力學的弱內向整流功能特點的基因[17]。其中，環境中的pH值是植物中AKT2通道活性的強調節因子，外源pH會顯著下調AKT2的活性，即使是很小的細胞質pH變化也會顯著影響AKT2的整流特性[34]。本研究中，在該亞族共鑒定到3個成員：SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8，根據基因表達以及同源分析可知，SbShaker6是AtAKT2在高粱中同源基因，由此預測SbShaker6具有與AKT2相似的功能特性。與之不同的，高粱中SbShaker7成員在高粱的花中有少量表達。AtKC1存在于細胞內質網中，是異四聚體通道內的調控亞基，能調控其他Shaker通道蛋白的表達，從而提高植物抗逆性[35-36]。在擬南芥中具有外向整流功能的Shaker家族成員有兩個，分別是SKOR和GORK。其中SKOR在擬南芥的根莖組織中表達，并將鉀離子運輸到木質部中;GORK在保衛細胞中表達，并通過保衛細胞的鉀離子輸出，通道參與植物氣孔運動，調節植物蒸騰作用[37-38]。在高粱中鑒定唯一的外向整流通道SbSahekr9，在根與花中的表達量最高。

ABA、PEG能促進保衛細胞內的鉀離子快速凈外排，從而誘導膨壓損失，從而介導氣孔關閉[39]。據報道，土壤中鹽離子的種類以及含量，對擬南芥中內向整流AKT1基因的轉錄調控作用不大，但植物為了維持體內穩態，機體會引導KC1基因表達上調，導致AtKC1亞基通過形成異聚的AtKC1-AKT1通道的方式，來調節AKT1的表達量降低，減弱或阻隔對鉀離子的吸收，讓機體對鹽堿等脅迫產生抗性;但該異聚通道對外向整流通道成員的表達無影響[40]。與本研究類似，在高粱中利用植物逆境激素ABA對SbShaker3進行處理，結果顯示SbShaker3的表達量增加，而I亞族成員SbShaker2的表達量顯著降低，但對SbShaker9無影響。由此可推測，在高粱鹽脅迫過程中仍然存在該結論。其次在擬南芥中進行激素控制方面，AKT1對ABA、PEG處理不敏感[41]，而且外源施加脫落酸能迅速且強烈地抑制SKOR的表達[42];但ABA會誘導的AKT2、GORK表達上調，說明二者對植物抗干旱起重要作用[43]。在本研究中，對高粱Shaker家族進行脅迫處理發現，對其施加脫落酸會對SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8、SbShaker9的表達量有明顯的提升。由此預測，SbShaker6、SbShaker7、SbShaker8具有擬南芥中AKT1通道蛋白的相關功能;SbShaker9可能具有AtGORK相似的功能特點。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法從高粱全基因組鑒定到9個高粱的Shaker蛋白家族成員，它們分布在高粱的2、3、4、9、10號染色體上。該家族成員有4個Shaker通道的特殊蛋白結構域，分別是Ion_trans_2、cNMP、ANK和KHA。SbShakers基因所編碼的蛋白序列長度介于601 aa（SbShaker5）與919 aa（SbShaker1）之間，所預測的蛋白質分子質量介于65.80 kDa（SbShaker5）與100.65 kDa（SbShaker1）之間。其次，發現高粱中的Shaker通道具有組織表達特異性，而且部分成員對ABA、PEG的處理有明顯的影響。以上結果為進一步研究高粱中Shaker蛋白家族的生物學功能奠定了基礎。

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通訊作者：謝鑫（1984—），男，博士，副教授，主要從事植物抗病基因功能研究，E-mail：xiexin2097757@163.com.