脂多糖調控對大鼠心臟微血管內皮細胞的轉錄組分析

岳影星 楊舟鑫 盧艷 嚴靜,

膿毒癥是指宿主對感染反應失控而導致的危及生命的器官功能障礙[1]。其中，心臟功能障礙是導致膿毒癥患者死亡的重要因素之一[2]。目前對膿毒癥狀態下心臟變化的認識仍然比較初步，但在發生膿毒癥時，心肌組織的局部炎癥被認為是膿毒癥心功能異常的關鍵因素之一。膿毒癥狀態下，心臟組織會發生免疫細胞的浸潤，這些免疫細胞分泌高水平的炎癥因子如TNF-α 和IL-1β，從而影響心臟的生理功能[3]。

內皮功能改變是膿毒癥狀態下心肌炎癥的重要誘因，而大鼠心臟微血管內皮細胞（rat cardiac microvascular endothelial cells，rCMECs）狀態的變化被認為是膿毒癥內皮功能改變的關鍵。在正常狀態下，心臟內皮細胞可以起到很好的屏障作用；但是在膿毒癥狀態下，心肌內皮細胞的屏障作用降低，炎癥細胞進入心肌組織而導致心臟功能異常[4]。除了屏障作用之外，內皮細胞在病原微生物和炎癥因子的刺激下，分泌趨化因子和黏附蛋白，吸引和協助炎性細胞進入組織中[5-6]。因此，對于rCMECs 在膿毒癥中變化的研究對于膿毒癥心肌保護具有重要的意義。本文對革蘭氏陰性細菌細胞壁關鍵成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理的rCMECs細胞模型進行了的轉錄組分析，從全局的角度探索了膿毒癥rCMECs 的變化，以期為膿毒癥心肌保護提供新的提示。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：1月齡的雄性SD大鼠10只，SPF級別飼養，體質量（100±5）g，質量合格證編號：NO1612060018，從浙江省醫科院動物實驗中心購買。

2.試劑：內皮細胞完全培養基（含有雙抗，內皮細胞生長添加劑和胎牛血清，基礎培養基為M199 培養基）（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶和LPS（美國Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buff er solution，PBS）和0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司）；Trizol（美國Thermo公司），miRNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司），Next rRNA Depletion Kit（英國NEB公司），ReverTra Ace qPCR RT Kit 和SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）。

二、方法

1.rCMECs 的分離培養：根據課題組以前的方案分離rCMECs[7]。1月齡雄性SD 大鼠處死后打開胸腔，取出心臟，使用PBS 清洗心臟并排出血液。取出心臟組織，棄去結締組織，放入75 %酒精中浸泡30 s 然后泡入完全培養基。使用剪刀盡量減碎心臟組織，用PBS 清洗，加入兩倍體積0.2 %Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫振蕩15 min，加入相同體積的完全培養基終止反應，用200 目濾網過濾，300×g離心5 min，PBS 清洗1次，然后接種到1 %明膠包被的6 cm 的培養皿中，加入完全培養基，放入含有5 %CO2的37℃培養箱中培養。培養2 h后換液，去掉沒有貼壁的細胞。培養5 d 左右細胞融合度＞ 80 %。消化時使用含0.02 %EDTA 的0.25 %胰酶消化，消化至細胞即將脫落的狀態時，加入1 mL 完全培養基終止反應。然后加入3 mL 的PBS，用移液器反復吹打細胞至大部分細胞從培養皿脫落。300×g離心5 min后棄去上清液，加入內皮細胞完全培養基重懸細胞，按照1:3 的比例傳代擴增。實驗使用3 代以內的rCMECs。

2.LPS 處理rCMECs：消化rCMECs，每孔接種3×105個細胞至6 孔板，貼壁培養24 h后，按終濃度100 ng/mL 加入LPS。對照組和LPS 各有3個生物學重復。根據文獻報道LPS 處理6 h 的內皮細胞有多個指標具有較顯著的變化[8]，因此選擇LPS 處理rCMECs 6 h，棄去上清后用PBS 清洗1遍后，加入trizol 吹打幾次后放入-80℃冰箱用于后續轉錄組測序或者定量PCR。

3.轉錄組測序：轉錄組測序在上海金特達公司進行?？俁NA 使用miRNeasy Mini Kit 提取，然后使用Next rRNA Depletion Kit 來去除核糖體RNA。RNA 測序是在Illumina 的HiSeq X-Ten nextgeneration 上進行。采用STRINGTIE 軟件計算每個基因測到的計數。本文主要關注mRNA，DESeq 軟件用來計算差異基因。

4.GO 和KEGG富集和基因共表達網絡分析：上調基因和下調基因的基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析是使用基于R 語言的The Hypergeometric Distribution 來進行。將GO富集中P值最小的前10個關于生物學過程（biological processes）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）的富集以及KEGG富集中P值最小前20個的通路以圖的形式展示?；蚬脖磉_網絡是通過差異基因的結果及其表達值構建，并分析這些基因的表達調控。

5.RNA 逆轉錄和定量PCR：使用Rever Tra Ace qPCR RT Kit 進行mRNA 逆轉錄，然后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 進行定量PCR 分析。定量PCR 時使用Gapdh 的表達量作為內參。計算目的基因與Gapdh 的ΔCt 值，然后按照2-ΔCt法計算目的基因的相對表達量。（表1）

三、統計學分析方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析。Mt2a、Sod2、Ccl2、Cxcl1、Icam1、Vcaml基因的mRNA表達水平以x± s表示，采用獨立t檢驗，以P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

一、LPS 處理調控了心肌功能相關基因的改變

分析了其中編碼蛋白質的mRNA 的變化。在LPS 處理下，有265個基因被檢測到表達上調，有118個基因的表達下調（圖1）。最顯著上調前10個 基 因 為：Mt2a、Cyp7b1、Sod2、Icam1、Ccl2、AC128848.1、Mt1、Cebpd、Serpinb2和Tnfrsf11b。最顯著下調前10個基因為：Cavin2、Ankrd1、Edn1、Prss35、Lmod1、Dhrs3、Ttc22、Sema6a、Map2k3和Sema7a。上調基因中，選擇了與氧化應激（Mt2a、Sod2）、趨化因子（Ccl2、Cxcl1）和細胞表面黏附（Vcam1、Icam1）相關的幾個基因進行了定量PCR驗證。定量PCR 的結果表明這幾個基因在LPS 的處理下均上調，與測序的結果相符。下調基因中，選擇了Cavin2、Ankrd1、Edn1和Prss35進行了驗證，定量PCR 的結果表明這幾個基因均下調。（表2）

表1 引物序列信息

圖1 轉錄組測序結果火山圖

二、差異基因GO富集分析

上調基因從生物學角度，前3個是對LPS 的反應、對細菌來源分子的反應和細胞運動的正調節。而從細胞內成分角度，前3個是I-κB/NF-κB 復合物、核周體和質膜外側。從分子功能的角度，上調基因前3個富集是趨化因子活性、趨化因子受體結合和細胞因子活性。（圖2）

對于下調的基因，從生物學過程角度，GO富集最顯著的是磷脂酶C 激活G蛋白偶聯信號通路中胞質鈣離子濃度的正調控、鈣離子穩態和胞質鈣離子濃度的正調節。而從細胞內成分角度，GO富集中P值最小的3個是基底外側質膜、蛋白質細胞外基質和胰島素樣生長因子結合蛋白復合物。從分子功能的角度，前3個是G蛋白偶聯受體結合、睪酮脫氫酶（NAD+）活性、G蛋白β 亞單位結合。（圖3）

三、差異基因KEGG 功能分析

上調基因KEGG富集前3個是腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB 信號通路和病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用。（圖4）

表2 差異基因定量PCR 驗證（± s）

表2 差異基因定量PCR 驗證（± s）

注：對照組Ankrd1，Edn1 的實驗次數為2次

分組 實驗次數 Mt2a Sod2 Ccl2 Cxcl1 Icam1對照組 3 0.084473±0.004400 0.007357±0.000623 0.000378±0.000039 0.001666±0.000144 0.019167±0.002541 LPS 組 3 1.445459±0.372817 0.076643±0.003449 0.084866±0.004514 0.239796±0.027300 0.075535±0.006341 t 值 6.322 34.230 32.410 15.110 14.290 P 值 0.003 ＜ 0.001 ＜ 0.001 0.001 0.001分組 實驗次數 Vcaml Cavin2 Ankrd1 Edn1 Prss35對照組 3 0.000021±8.48873E-06 0.041950±0.018844 0.115589±0.014128 0.026018±0.007298 0.001844±0.000018 LPS 組 3 0.002501±0.000030 0.009144±0.000279 0.057983±0.003549 0.005615±0.001817 0.000632±0.000297 t 值 137.200 3.015 7.290 5.003 5.472 P 值 ＜ 0.001 0.039 0.005 0.015 0.012

圖2 上調基因GO富集分析

圖3 下調基因GO富集分析

下調基因KEGG富集前3個是神經活性配體-受體相互作用、黑色素生成和肌醇磷酸鹽代謝。（圖5）

四、差異基因共表達網絡分析

如圖6所示，SOD2 處于差異基因共表達網絡的核心位置，其可能在LPS 誘導的rRCMECs 功能改變中有關鍵性的調節作用。

討 論

LPS 體外刺激實驗方法，被認為是可以用來模擬革蘭氏陰性菌感染下的細胞的變化情況，而一般研究較多的是巨噬細胞炎癥反應。本研究結果表明，在LPS 處理后，大鼠心臟微血管內皮細胞大量基因的表達發生了變化，很多與氧化應激、趨化因子和細胞表面黏附相關的基因的表達都明顯上調。利用生物信息學技術的分析，本研究發現LPS 誘導的基因表達變化確實與心臟內皮功能紊亂有密切的相關性。與其他細胞受到LPS 刺激后一樣，rCMECs上調了大量與NF-κB 信號通路有關的基因表達，如Cxcl1、Nfkbia、Vcam1、Icam1等基因的表達都明顯上調。與利用LPS 處理巨噬細胞實驗不一樣的是，本實驗并沒有發現炎癥因子Tnf和Il6表達的明顯變化。通常認為分泌炎癥因子并非內皮細胞的主要功能，反而是趨化因子、黏附分子的上調對于內皮細胞功能的改變具有更加重要的意義。CXCL1 和CCL2兩個趨化因子在基因表達水平有明顯的上升，其中CXCL1 是一種粒細胞的趨化因子[9]，CCL2 是一種重要的單核細胞趨化因子[10]。VCAM1 和ICAM1是細胞表面重要的黏附分子，對淋巴細胞、單核細胞或粒細胞有黏附作用，它們的基因表達也顯著上升[11-12]。這些改變與內皮細胞在膿毒癥狀態下的改變一致，即內皮細胞分泌趨化因子可以吸引炎性單核細胞、中心粒細胞和淋巴細胞到血管內皮周圍，然后通過表面的黏附分子黏附這些細胞并轉移到組織中從而引起組織的炎癥反應。

圖4 上調基因KEGG富集分析

對于下調基因的分析表明，鈣離子信號和G蛋白相關通路的基因表達明顯下調，這兩個通路被認為可能與細胞骨架形成有密切的關聯[13-14]。在正常生理狀態下，內皮細胞可以依靠骨架蛋白呈現特定的形態；但是在膿毒癥引發的內皮損傷過程中，細胞骨架蛋白的結構被破壞。同時鈣離子信號也是VE-cadherin 重要的調節信號，膿毒癥狀態下VE-cadherin 的內化會導致心臟微血管內皮細胞依靠VE-Cadherin 形成的嗜同性結合被破壞[15]。細胞骨架蛋白和VE-cadherin 的異常，會導致rCMECs 之間的間隙變大，內皮通透性增加而引起炎癥細胞浸潤[16]。

這些結果說明內皮很多功能改變可以直接由LPS 誘導產生，而不依賴于炎癥因子的持續高表達。在膿毒癥的發生發展過程中，循環中的炎癥因子并非持續高表達；即使進入了膿毒癥后期免疫抑制狀態，內皮功能仍會有異常，這一臨床和動物層次的表現與本文的結果有很好的一致性。感染狀態下病原微生物除了刺激免疫細胞，對內皮細胞的直接刺激也是膿毒癥發生發展的關鍵環節之一。

對差異基因共表達網絡分析表明Sod2處于核心位置。Sod2即人超氧化物歧化酶-2，可以催化超氧化物為過氧化氫，是降低體內活性氧的關鍵酶之一，而高活性氧也是膿毒癥發生發展過程中對機體造成損傷的關鍵因素之一。在LPS 處理后，rCMECs 中Sod2基因表達的上升也是對活性氧上升的一種反應。然而，Sod2處于差異基因共表達網絡的核心位置說明它可能影響了rCMECs 中很多生物學過程。其具體的作用可能需要進一步的功能研究?？傊?，本文從全局的角度對LPS 誘導的rCMECs 進行了轉錄組分析，發現LPS 可以調控氧化應激、趨化因子和黏附分子等相關基因的表達，且基因共表達網絡的分析提示Sod2可能是心肌功能異常的關鍵調節基因。本研究的結果為膿毒癥狀態下內皮損傷的研究提供了新的線索。

圖5 下調基因KEGG富集分析

圖6 差異基因共表達網絡圖