基于MeDIP-seq 研究蛋氨酸對巨噬細胞炎癥中甲基化水平的影響

徐翌斌，羅成龍，瞿 浩，計 堅，舒鼎銘

（畜禽育種國家重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣東省農業科學院動物科學研究所，廣東廣州 510640）

蛋氨酸（Methionine，Met）作為家禽玉米-豆粕型日糧的第一限制性氨基酸，也是動物體內的必需氨基酸，對提高家禽的免疫功能、生長性能和抗氧化性等方面至關重要[1]。當日糧缺乏Met 時，肉雞會出現食欲減退、生長緩慢和免疫功能缺陷等癥狀[2]。Li 等[3]研究表明，Met 不僅能參與免疫分子（細胞因子、抗體、補體等）的合成，同時介導了免疫組織和器官的正常發育。同時，Met 可通過提高機體內血清溶菌酶活性、外周淋巴細胞活性和和白細胞的吞噬活性[4]，積極參與調節機體的固有免疫和體液免疫[5-6]。

Met 是機體內重要的甲基供體之一，參與眾多的DNA 甲基化過程[7]。DNA 甲基化在轉錄水平上調控基因的表達，高甲基化狀態會導致基因表達抑制，而低甲基化狀態會促進基因表達。Wichnieski 等[8]研究發現，DNA 甲基化與動物機體炎癥和衰老等眾多生理疾病密切相關。用甲基化方式調控炎癥因子或炎癥信號通路的表達可以緩解炎癥反應[9]。Arroyo-Jousse 等[10]研究表明半胱氨酸可提高TNF-α啟動子區高甲基化水平從而緩解炎癥反應。本課題組前期發現Met 能緩解脂多糖（LPS）誘導巨噬細胞炎癥反應[11]，但其分子調控機制尚不明確。因此，本研究從甲基化角度初步探究DNA甲基化與Met 抑制LPS 誘導巨噬細胞炎癥中調控機制的相關性，進而為Met 調控免疫功能提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及試驗相關試劑 本試驗的小鼠巨噬細胞所用RAW264.7 細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC細胞庫）。Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/ 鏈霉素抗生素購自Gibco 公司。蛋氨酸、脂多糖、二甲基亞砜購自Sigma公司。磷酸緩沖溶液購自上海生工生物公司。

1.2 巨噬細胞處理 將細胞鋪板至6 孔板中，接種密度為1×106個/mL，細胞置于細胞培養箱中過夜培養。設置空白（Ctr）組、LPS 組和Met+LPS 組，每組3 個重復。Ctr 組細胞為正常培養基細胞（不添加LPS 和Met），LPS 組細胞為正常培養基培養后添加100 ng/mL 的LPS刺激3 h，Met+LPS 組細胞為含10 mmol/L 的Met 培養基培養12 h 后，用100 ng/mL 的LPS 刺激3 h。

1.3 全基因組甲基化測序 收集各組處理后的巨噬細胞（共3 組，每組3 個重復）放置干冰，委托安諾優達基因科技有限公司完成MeDIP-seq。操作步驟：提取并純化巨噬細胞全基因組 DNA；將基因組 DNA 打斷至100～500 bp；對全基因組 DNA 片段末端進行修復，在3'端加腺嘌呤，并連接測序接頭，雙鏈 DNA 單鏈化；采用 5-甲基胞嘧啶抗體對測序接頭DNA 進行沉淀富集；Q-PCR 擴增后跑膠，切膠純化并質控產物；合格文庫用于上機測序。

1.4 全基因組甲基化測序的生物信息學分析 對下機數據序列進行去污染和去低質量處理，將篩選后的reads 與參考基因組（mm10）進行定位對比并統計信息，每條read最多允許3 個堿基錯配?；贛ACS 軟件對全基因組處理后的序列進行甲基化峰（peak）掃描，得到每組樣品的peak 區域信息結果，并統計在基因元件（upstream2k、5'UTR、CDS、Intron、3'UTR、downstream2k）上的分布，并進行對比分析。根據差異的read 數量，將差異的基因分為高甲基化基因和低甲基化基因。例如，樣品1 vs.樣品2，同一個peak 區域內樣品2 的reads 數量高于樣品1 的基因為高甲基化基因，反之為低甲基化基因（篩選條件：P＜0.01，兩樣本在相同基因元件內都有覆蓋，且覆蓋度的差異在2 倍以上），并統計在基因組不同區域上差異甲基化基因的分布。最后，將兩樣品間的差異基因進行GO 功能富集分析和KEGG 功能分析。

2 結果與分析

2.1 全基因組測序數據處理 如表1 所示，在Ctr 組、LPS組 和LPS+Met 組分別得到177 730 085、176 089 330、163 741 744 個比對reads 數和151 460 128、151 069 422、140 320 769 個唯一比對reads 數，比對率達分別達53.04 %、56.38 %和54.04 %，唯一比對率分別達45.2 %、48.37 %和46.31 %，并且LPS 組的比對率和唯一比對率均高于Ctr 組，而LPS+Met 組的比對率和唯一比對率均低于LPS 組。

表1 MeDIP-seq 數據統計結果

2.2 統計MeDIP-Seq 的甲基化峰（Peak）信息 基于MACS 軟件對各組細胞的MeDIP-seq 數據進行peak 掃描并統計信息。如表2 所示，LPS 組的peak 數量、總長度和覆蓋率均高于Ctr 組，而LPS+Met 組的peak 數量、總長度和覆蓋比例均低于LPS 組。

表2 Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組中peak 區域信息統計結果

2.3 統計富集區域在基因不同區域上的分布 運用MACS 軟件定位peak 的位置相關信息，對peak 位置進行基因功能分類（upstream2k：轉錄上游2 000 bp 區；5'UTR：5' 端非翻譯區；CDS：編碼序列區；Intron：內含子區；3'UTR：3'端非翻譯區；downstream2k：轉錄下游2 000 bp 區）。如圖1 所示，多數的peak 分布在Intron 區（約51%）。

2.4 統計兩組間差異甲基化基因數 根據差異的reads數量，將差異的基因分為高甲基化基因和低甲基化基因，并定位到基因元件上。如圖2 可見，在Ctr 組和LPS 組不同基因元件上共鑒定出217 個低甲基化基因和506 個高甲基化基因，其中在LPS 組每個不同基因功能元件上高甲基化基因數都多于低甲基化基因數。而在LPS組和LPS+Met 組共鑒定出459 個低甲基化基因和122個高甲基化基因，其中在LPS+Met 組每個不同基因功能元件上高甲基化基因數都低于低甲基化基因數。

2.5 差異甲基化基因的GO 富集分析 基于本課題組前期研究發現，Met 能夠緩解LPS 誘導的細胞炎癥反應[11]。以下研究重點分析LPS 組和LPS+Met 組中巨噬細胞差異甲基化基因。如圖3 所示，GO 富集分析包括生物學進程、分子功能和細胞成分3 大類。生物學進程中主要富集在單一生物過程（Single-Organism Process）和細胞過程（Cellular Process），細胞成分主要富集在細胞（Cell）和細胞部分（Cell Part），分子功能主要富集在結合（Binding）上。生物進程上共富集有419 個高甲基化基因和1 576 個低甲基化基因，有517 個高甲基化基因和397 個低甲基化基因富集在分子功能，有1 277 個高甲基化基因和3 129 個低甲基化基因富集細胞組成。在3 大類GO 富集功能上總的低甲基化基因數（3 129 個）明顯多于總高甲基化基因（862 個）。

圖1 Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組中peak在不同基因功能元件上的分布Ctr vs LPS

圖2 基于不同基因元件上Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組間差異甲基化基因的分布

2.6 差異甲基化基因的KEGG 功能分析 KEGG Pathway是分析peak 區域相關基因所涉及到的細胞信號通路，選擇基因富集最顯著的20 個通路來進行分析。如圖4 所示，Q 值越小，甲基化基因富集越顯著，其中最富集的通路是Hippo 信號通路（Hippo Signaling Pathway），隨后是細胞粘附分子（Cell Adhesion Molecules）、谷氨酸能突觸（Glutamatergic Synapse）、軸突傳導（Axon Guidance）、肌動蛋白細胞骨架調控（Regulation of Actin Cytoskeleton）、磷酸肌醇代謝（Inositol Phosphate Metabolism）等通路。

3 討 論

Met 作為家禽第一限制性氨基酸，又是動物機體內重要的甲基供體之一，在DNA 轉移酶（Dnmts）的作用下參與DNA 甲基化，在調控動物機體免疫功能等方面發揮重要作用。本課題組前期研究發現Met 能緩解LPS 誘導的巨噬細胞炎癥反應[11]，但其分子調控機制尚不明確。首先，本研究利用MeDIP-seq 技術分析Met 影響巨噬細胞炎癥中全基因組DNA 甲基化變化特征，其次，確定差異甲基化基因與生物學功能之間的關系，并初步探究Met 抑炎的分子機制。本研究結果表明，Met 能緩解LPS 誘導巨噬細胞的高甲基化水平，差異甲基化基因主要富集在Hippo 信號通路。

圖3 LPS 組與 LPS+Met 組的差異甲基化基因GO 富集結果

圖4 LPS 組與 LPS+Met 組的差異甲基化基因KEGG 富集散點圖

MeDIP-seq 是基于抗體富集原理進行全基因組甲基化測序的一種高通量測序技術，可以統計整個基因組DNA 甲基化譜的分布，并能夠高效率地檢測出全基因組中甲基化差異的區域，是目前比較不同細胞、組織或疾病個體樣本間的全基因組DNA 甲基化差異的檢測技術[12]。本研究測序結果表明，Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組分別 產生了177 730 085、176 089 330、163 741 744 個唯一比對read 數，在此基礎上利用MACS軟件進一步分別鑒定出160 467、169 253、163 576 個甲基化峰（peak）區域，大多數的peak 定位在基因Intron 區，分析發現LPS 組中鑒定出的peak 數量和覆蓋比例均大于Ctr 組，而Met+LPS 組的peak 數量和覆蓋比例均小于LPS 組。結果表明LPS 組的甲基化程度高于Ctr 組，Met+LPS 組的甲基化程度低于LPS 組，添加Met 后能夠緩解LPS 誘導的巨噬細胞炎癥高甲基化水平。

根據peak 內read 數量在不同基因功能元件上挖掘分析各組間的差異甲基化基因。分析結果發現，相較于Ctr 組，LPS 組每個不同基因功能元件上的高甲基化基因數均多于低甲基化基因數，而相較于LPS 組，LPS+Met 組每個不同基因功能元件上的高甲基化基因數均低于低甲基化基因數。此結果進一步證實甲基供體Met 的補充能夠緩解LPS 誘導的巨噬細胞中基因組高甲基化水平，這與前期研究結果一致。Osorio 等[13]發現飼喂添加Met 飼料的荷斯坦奶牛中全基因組DNA甲基化水平程度較低。Yang 等[14]發現在飼糧中添加Met 的小鼠中FABP4啟動子區甲基化水平有所降低。另外一項相關研究也發現，給母體或斷奶后小鼠補充葉酸（甲基供體）飼養，其全基因組DNA 甲基化程度降低[15]。導致這一類現象的原因或許與DNA 甲基化轉移酶的表達有關。動物機體內Dnmts 分為Dnmt1、Dnmt2 和Dnmt3 3 類，其 中Dnmt3 包 括3 個亞類：Dnmt3a、Dnmt3b 和Dnmt3l。Dnmt1 是維持甲基化轉移酶，Dnmt2 的甲基轉移酶活性尚不明確，Dnmt3a 和Dnmt3b 是從頭合成甲基化轉移酶，Dnmt3l 缺乏甲基化酶活性，但可以與Dnmt3a 和Dnmt3b 相互作用[16-18]。Li 等[19]研究發現，補充葉酸能通過下調Dnmt1和Dnmt3a的表達而誘導高脂飼糧小鼠中肥胖相關基因低甲基化。另外，Kohno 等[20]研究發現Dnmt3a在動物體內調控能量代謝穩態方面發揮重大作用。Dnmt1和Dnmt3b基因可介導炎癥反應中炎癥基因的表達[21-23]。探索各類甲基轉移酶在Met 介導DNA 甲基化調控炎癥反應的影響值得進一步深入研究。

本研究通過GO 富集和KEGG 對LPS 組與Met+LPS組之間的差異甲基化基因進行分析。GO 富集分析發現在生物學過程（Biological Process）中差異甲基化基因主要富集在單一生物過程（Single-Organism Process）和細胞過程（Cellular Process）。GO 富集的每個生物學分類上的高甲基化基因數均少于低甲基化基因數，進一步證實Met 能夠降低LPS 誘導的巨噬細胞中基因組高甲基化水平。通過KEGG 分析發現，甲基化基因主要富集在Hippo 信號通路上。Hippo 信號通路最早發現于果蠅研究中，主要是調控細胞的生長，組織器官的大小以及抑制癌癥等[24]。同時，Zhou 等[25]研究表明Hippo 信號通路在調節免疫功能和維持免疫穩態方面發揮重大作用。在抑制果蠅的Hippo 信號通路情況下，果蠅會更容易被革蘭氏陽性菌感染，致死率提高[26]。Wang 等[27]研究表明不同的血流模式可通過調控內皮細胞的Hippo 信號通路來抑制炎癥并緩解動脈粥樣硬化的形成。IL-4/IL-13 誘導M2 巨噬細胞極化和LPS/IFN-γ誘導的M1 巨噬細胞極化可以通過Hippo 信號來調節[28]。抑制Hippo 信號通路，能增強LPS/TLR4 介導NF-κB 信號通路的活化，增加促炎因子IL-6 和TNF-α的表達[29]。Hippo 通路還參與腫瘤免疫反應，其關鍵蛋白Yap 活化有助于腫瘤細胞逃脫免疫系統的清除[30]。

4 結 論

本研究運用MeDIP-seq 技術發現，Met 能緩解LPS 誘導的巨噬細胞DNA 高甲基化水平，差異甲基化基因主要富集在Hippo 信號通路。通過本研究分析有助于初步理解Met 抑炎的分子調控機制，在畜禽生產中為Met 調控機體免疫功能提供一定的理論基礎。