微液滴適應性進化強化大腸桿菌耐受高濃度L-山梨糖

曾偉主，單小玉，房峻，周景文*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)

2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)是生產維生素C的直接前體[1]。維生素C是人體維持正常生命活動必需的維生素，是一種有效的抗氧化劑，廣泛應用于化妝品、食品、飲料、制藥和飼料等領域[2-4]。我國是維生素C生產大國，產能占世界90%以上，生產技術水平和生產規模均達到世界領先水平[5]。維生素C生產通常先利用微生物發酵合成2-KLG，再將2-KLG酯化生成維生素C。目前，維生素C生產主要依賴由氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)和普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)組成的三菌二步發酵法[6-7]。隨著發酵工業的不斷發展，三菌二步發酵法存在的缺陷日益凸顯，如菌株選育困難、操作復雜且穩定性差、原材料與能源消耗大等，不僅導致生產成本顯著高于類似產品，菌株選育也一直未能取得重要突破[8-9]。

研究人員企圖通過構建一菌一步發酵法從根源上解決三菌二步發酵法中存在的問題。ANDERSONT等試圖通過在歐文氏菌(Erwiniaherbicola)過量表達來源于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶，以葡萄糖為底物生產2,5-二酮基-D-葡萄糖酸，然后再生產2-KLG，但由于酶活力較低以及輔因子再生不匹配等問題，該方法始終未能實現2-KLG的高效生產[10]。SAITO等將來源于G.oxydansT100中合成2-KLG的2個關鍵脫氫酶山梨糖脫氫酶(sorbose dehydrogenase，SDH)和山梨酮脫氫酶(sorbosone dehydrogenase，SNDH)在G.oxydans表達，可以實現2-KLG的少量積累，但在大腸桿菌中進行過表達，卻不能實現2-KLG的積累，經過深入研究發現，SDH低酶活力是其主要的限制因素[11]。本研究室前期在G.oxydansWSH-003中表達山梨糖/山梨酮脫氫酶(SSDHs)，成功構建了2-KLG一步發酵菌，但脫氫酶SSDHs的底物/產物特異性較差，2-KLG得率始終低于70%[12-13]。目前，一步一菌發酵法存在的問題主要包括輔因子再生、關鍵酶的鑒定以及中間代謝副產物的競爭等[14-15]。

本研究室通過建立基于2-KLG還原酶的高通量篩選方法，篩選到1株可直接積累2-KLG的G.oxydansWSH-004，該菌株含有依賴輔助因子FAD的SDH，可以轉化L-山梨糖直接生成2-KLG，轉化率幾乎100%，但由于酶活性較低，2-KLG積累量仍較低[16]。在EscherichiacoliBL21 (DE3)中組成型表達SDH，獲得了1株能積累2-KLG的菌株E.coliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH，但該菌株能在低濃度L-山梨糖培養基中良好生長，在較高濃度L-山梨糖培養基中生長速度很慢，而菌種前期的生長狀態對目的產物的高效積累具有關鍵作用[17]。近年來，通過適應性進化策略顯著提高了工業微生物的底物耐受性以及生產性能[18-19]。張翀等開發了一種基于微流控技術的全自動高通量微生物液滴培養系統(microbial microdroplet culture system，MMC)，能夠實時在線檢測微生物的生長(OD)，定時定量更換新鮮培養基或添加化學因子，并完成微生物繼代培養，從而實現菌株的進化和篩選[20-21]?；诖?，本研究應用MMC對出發菌株進行不同濃度梯度L-山梨糖的適應性進化，提高出發菌株對L-山梨糖的耐受性，并考察其發酵生產2-KLG的性能。結果表明進化菌株具有較好的積累2-KLG的能力，該研究為一菌一步發酵法生產維生素C前體2-KLG提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

EscherichiacoliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH由本實驗室前期研究構建[17]，氧化葡萄糖酸桿菌G.oxydansWSH-004 (保藏號：CCTCC M2019481)，由本研究室前期篩選獲得，用于擴增SNDH基因[16]。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨和酵母粉，Oxoid公司；氨芐青霉素(Amp)、NaCl，上海國藥集團；各種用于構建載體的一步克隆酶、連接酶以及商品化的pMD19-T Simple Vector，大連寶生物(TaKaRa)有限公司；L-山梨糖，本實驗室發酵提取獲得。

1.1.3 主要儀器

搖床，上海知楚儀器有限公司；島津液相色譜儀，日本shimadzu公司；Nanodrop ND-2000分光光度計，美國Thermo公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；離心機，美國Eppendorf公司；全自動高通量微生物液滴培養儀，無錫源清天木生物科技有限公司。

1.1.4 培養基

種子培養基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，115 ℃，滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，根據需要添加不同濃度的L-山梨糖，115 ℃，滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 全自動高通量微生物液滴培養

將出發菌株E.coliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH通過MMC進行適應性進化培養。首先，在MMC上進行生長曲線測定，獲得該菌株培養至生長對數期的時間，選擇在對數中期開始進行下次傳代。根據前期生長曲線的測定設定傳代時間，在分別添加10.00、13.33、16.67和20.00 g/L四個不同低質量濃度的L-山梨糖培養基中培養進化，每個質量濃度傳代2次。在此基礎上，在10.00、20.00和30.00 g/L三個中質量濃度梯度的L-山梨糖培養基中進化，每個梯度傳代至少5次，第1輪進化結束后，獲得較好的進化菌株。繼續進行第2輪進化，將第1輪獲得的進化菌株培養到對數中期，依次按照含有30、50、70和100 g/L四個不同質量濃度L-山梨糖培養基中進化，每個梯度傳代5次，獲得更好的耐受高L-山梨糖的菌株。

1.2.2 菌株構建

參照文獻[17]設計引物。應用PCR技術將G.oxydansWSH-004來源的SNDH，應用一步克隆的方法獲得誘導型表達SNDH的質粒(pET28a-SNDH)，轉入進化菌株2-F6。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 細胞培養的方法

種子培養：將保存在-80 ℃冰箱的菌株劃線，放置37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，挑取平板上的單菌落轉接至14 mL搖菌管種子液，37 ℃，220 r/min培養9～12 h。

1.2.4 進化菌株搖瓶生長狀況

在LB培養基中添加不同質量濃度的L-山梨糖，配制不同底物質量濃度L-山梨糖培養基(10、30、100和200 g/L)，25 mL分裝至250 mL搖瓶中。以體積分數2%的接種量接入培養好的種子液，37 ℃、220 r/min培養2 h，調節溫度至30 ℃繼續培養，取不同時間點檢測OD600值。

1.2.5 發酵條件的優化

接種量分別選擇2%、4%、6%、8%、10%、12%和14% (體積分數)，每個接種量做3個平行，37 ℃、220 r/min培養2 h，調節溫度至30 ℃繼續培養，發酵72 h后檢測2-KLG的積累量；在優化接種量的基礎上進行發酵溫度的優化，選擇了25、30和37 ℃三個溫度進行對比，發酵72 h后，檢測2-KLG的產量；在優化了接種量和培養溫度的基礎上，對SNDH的IPTG誘導時間和誘導濃度進行優化。本部分所用發酵培養基組成為：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，L-山梨糖添加量為1%(體積分數)。

1.2.6 發酵罐分批發酵

在5 L發酵罐中，裝液量為2.5 L，接種量為2%。接種前加入50 μg/mL卡納抗生素和100 μg/mL氨芐抗生素，通氣量1 vvm，轉速300 r/min。當OD600值為3～4時加入IPTG誘導，同時加入底物L-山梨糖。

1.2.7 液相檢測條件

采用高效液相色譜法檢測2-KLG含量。色譜柱：Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, CA)，檢測器：示差檢測器，檢測條件：流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃[12]。

2 結果與分析

2.1 耐高濃度L-山梨糖菌株的進化

以E.coliBL21(DE3)-pMD19-cspA-SDH為出發菌株，在MMC上測定生長曲線，確定6 h時為傳代時間(圖1-a)。在6～48 h依次在添加10.00、13.33、16.67和20.00 g/L四個不同低質量濃度的L-山梨糖培養基進化(圖1-b)，繼續在10.00、20.00和30.00 g/L三個中質量濃度梯度L-山梨糖培養基中進化(圖1-c)。第1輪進化后獲得了1株較好的耐受菌1-18，比較耐受菌株1-18 (b)與出發菌株(a)的生長狀況，發現在30 g/L的L-山梨糖培養基中耐受菌株前期生長明顯快于出發菌株(圖1-d)。為了獲得耐受性更好的菌株，在含有30、50、70和100 g/L四個不同質量濃度L-山梨糖培養基中進行第2輪進化(圖1-e)，最終獲得了1株能耐受更高L-山梨糖濃度的菌株2-F6。對比耐受菌株2-F6 (d)與出發菌株(c)生長狀況，發現在100 g/L的高濃度L-山梨糖培養基中，耐受菌株生長明顯快于出發菌株(圖1-f)。表明通過MMC的培養提高了菌株對L-山梨糖的耐受性，進化菌株在高濃度L-山梨糖培養基中能夠生長良好。

a-出發菌株生長曲線；b-較低質量濃度L-山梨糖(梯度質量濃度為10.00、13.33、16.67和20.00 g/L)培養基中的進化過程；c-中質量濃度 L-山梨糖(梯度質量濃度為10.00、20.00和30.00 g/L)培養基中的進化過程；d-出發菌株(a)和進化菌株1-18 (b)的生長對比；e-高質量濃度 L-山梨糖(梯度質量濃度為30.00、50.00、70.00和100.00 g/L)培養基中的進化過程；f-出發菌株(c)和進化菌株2-F6 (d)的生長對比圖1 菌株耐高濃度L-山梨糖的適應性進化結果Fig.1 Results of adaptive laboratory evolution of high concentration L-sorbose

2.2 進化菌株在搖瓶水平上的生長情況驗證

為了檢測在MMC上獲得的進化菌株能否在搖瓶中有著同樣良好的生長狀況，在搖瓶水平上考察了2株進化菌株的生長狀況，以出發菌株為對照。將3株菌株分別在1%、3%、10% 和20%四個不同濃度的L-山梨糖培養基中進行搖瓶培養，結果如圖2-a所示。發現進化菌株的生長狀況與出發菌株存在明顯差異，在添加10 g/LL-山梨糖的培養基中培養時，進化菌株與出發菌株均可良好生長，而當培養基中L-山梨糖含量增加至30 g/L后，出發菌株出現了生長緩慢的現象，生長趨勢明顯遲于進化菌株，而進化菌株2-F6更優于1-18。結果表明進化得到的高濃度L-山梨糖耐受菌，在添加高濃度L-山梨糖培養基中進行搖瓶培養也具有良好的生長能力，且在不同L-山梨糖培養基中均可較好地生長。

a-添加10 g/L L-山梨糖；b-添加30 g/L L-山梨糖；c-添加100 g/L L-山梨糖；d-添加200 g/L L-山梨糖圖2 進化菌株在搖瓶中的生長狀況Fig.2 Growth of evolutionary strains in shaking flasks

2.3 進化菌株積累2-KLG的發酵條件優化

前期研究發現，在組成型表達了SDH的大腸桿菌工程菌中繼續表達關鍵酶山梨酮脫氫酶SNDH能提高2-KLG的產量?；谇捌跇嫿ǖ碾p酶表達系統，在進化菌株2-F6中游離表達了SNDH提高菌株利用L-山梨糖生產2-KLG的能力[17]。在搖瓶水平上，比較了不同接種量、發酵溫度以及對SNDH誘導時間和IPTG誘導濃度對進行菌株積累2-KLG的影響，結果如圖3所示。

a-接種量的影響；b-發酵溫度的影響；c-誘導時間的影響；d-IPTG濃度的影響圖3 搖瓶培養條件的優化Fig.3 Optimization of culture conditions in shaking flasks

當接種量在體積分數10%以內時，2-KLG產量沒有明顯差異，而超過10%后，2-KLG產量有所下降(圖3-a)。培養溫度為30 ℃最佳，繼續升高溫度反而不利于2-KLG的積累(圖3-b)。培養3 h后誘導更有利于2-KLG的積累(3-c)。誘導劑IPTG的濃度對2-KLG產量的影響結果顯示，IPTG濃度為0.3 mmol/L時2-KLG產量最高(圖3-d)。

2.4 L-山梨糖添加量對進化菌株積累2-KLG的影響

上述實驗表明,經MMC進化后的進化菌株在低濃度的L-山梨糖培養基中的生長明顯優于出發菌株，考慮到進化菌株仍無法完全將培養基中添加的L-山梨糖轉化生成2-KLG。因此，在搖瓶水平上繼續考察添加10、20和30 g/L三個較低濃度L-山梨糖的培養基對共表達SDH/SNDH的進化菌株2-F6積累2-KLG的影響，以表達SDH的進化菌株2-F6為對照，結果如圖4所示。

a-只表達SDH的進化菌株2-F6；b-共表達SDH/SNDH的進化菌株圖4 不同L-山梨糖濃度對進化菌株積累2-KLG的影響Fig.4 Effects of different L-sorbose concentrations on 2-KLG accumulation in evolutionary strain

共表達SDH/SNDH的進化菌株(圖4-b)的發酵性能明顯優于表達SDH的進化菌株(圖4-a)。共表達SDH/SNDH的進化菌株發酵24 h時，不同L-山梨糖添加量對產物的影響較為明顯；當發酵至48 h時，添加10、20和30 g/L三種不同質量濃度的L-山梨糖培養基發酵生產的2-KLG量分別為5.10、5.40和6.05 g/L，含有10 g/LL-山梨糖和20 g/LL-山梨糖的發酵液中2-KLG產量差異不明顯，含有30 g/LL-山梨糖的發酵液中2-KLG產量最高。結果表明菌株已具有耐受較高濃度L-山梨糖的能力，不同L-山梨糖濃度對2-KLG產量的影響不顯著。

2.5 進化菌株在5 L罐上發酵生產2-KLG

在搖瓶上對重組進化菌株的生長以及2-KLG的產量進行了較全面的優化，得到最佳接種量為體積分數2%，培養3 h后加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG進行誘導，底物L-山梨糖的添加量為30 g/L。為了解重組菌在發酵罐上的生長特性，在5 L發酵罐上參考搖瓶發酵條件上進行一次性發酵培養。發酵過程中菌體的濃度、pH、L-山梨糖消耗及2-KLG產量的變化如圖5所示。0～8 h菌體生長較快，8～12 h菌體生長較慢，32～36 h菌體出現二次生長，36 h后達到穩定期。發酵前24 h內底物被快速利用，產物2-KLG快速積累，24 h之后底物緩慢被消耗，底物生成量變化不大，2-KLG的最高產量為5.70 g/L。而過程中pH呈現先增加后降低的趨勢，由于2-KLG的積累變慢，pH降低至5～6之間后變化較少。取樣檢測發現，L-山梨糖初始質量濃度為28.56 g/L，發酵結束后L-山梨糖仍剩余20.91 g/L，已利用部分的底物轉化率達74.5%。發酵后期發酵液中仍在大量底物剩余，后期研究可進一步優化提高2-KLG的產量。

圖5 5 L罐發酵過程曲線Fig.5 Process curve in 5 L fermenter

3 結論

與維生素C生產相關的研究主要集中在其前體2-KLG，目前，2-KLG主要采用三菌二步發酵法生產。隨著新一代發酵工程技術的興起，三菌二步發酵法存在的菌株選育困難、操作復雜、穩定性差和原材料與能源消耗大等問題缺陷日益顯著，建立高效的一菌一步法顯得日趨重要。近年來，雖然研究人員已開展大量工作，但一菌一步工程菌生產2-KLG的效率遠比經典三菌兩步發酵法低，始終未達到工業生產的目標。因此，要實現一菌一步發酵法工業化生產仍面臨許多挑戰[24]。

本研究基于前期構建的1株組成型表達山梨糖脫氫酶SDH轉化L-山梨糖生產2-KLG，但不能耐受高濃度底物L-山梨糖的大腸桿菌工程菌為研究對象，應用全自動高通量微生物液滴培養系統，篩選獲得了1株能耐受高濃度L-山梨糖的進化菌株2-F6。在進化菌株中共表達2-KLG合成的另一個關鍵酶山梨酮脫氫酶SNDH，并在搖瓶水平上對接種量、發酵溫度、SNDH誘導表達時間、誘導劑IPTG添加量以及初始山梨糖添加量等條件進行了優化，之后進一步在5 L發酵罐中進行了放大培養。最終，在5 L發酵罐中2-KLG的產量達5.70 g/L，已利用部分的底物轉化率達74.5%，發酵液中剩余大量的底物。在后續研究中，我們將采取強化基因表達、提高關鍵酶活性、敲除或抑制副產物生成途徑以及發酵過程優化等策略進一步提高2-KLG的產量和底物L-山梨糖的實際轉化率。