雷公藤紅素對蛋氨酸-膽堿缺乏飲食致小鼠NASH的干預作用及機制研究

饒輝 盛磊 吳丹妮 吳勇 胡俊杰 鄭國華 王桂紅

摘 要 目的：研究雷公藤紅素對蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食致小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的干預作用及可能機制。方法：將雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組、模型組和雷公藤紅素低、高劑量組[0.5、1 mg/（kg·d）]，每組7只。正常對照組小鼠給予蛋氨酸-膽堿充足飲食，模型組和給藥組小鼠給予MCD飲食以復制NASH模型;與此同時，正常對照組和模型組小鼠灌胃聚氧乙烯蓖麻油，各藥物組小鼠灌胃相應藥物，灌胃體積均為0.1 mL/g，每日1次，連續4周。觀察各組小鼠肝臟形態，并采用蘇木精-伊紅染色和油紅O染色法觀察其肝組織的病理學變化;采用酶法檢測血清肝酶[天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶]、血清和肝組織中脂質指標[總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）]水平;采用Western blotting法檢測小鼠肝組織中核因子κB p65（NF-κB p65）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）的蛋白表達水平。結果：與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟體積縮小且顏色泛黃，表面粗糙，肝組織中可見炎性細胞浸潤以及脂肪空泡、脂滴聚集;其血清TC、TG水平均顯著降低，血清肝酶水平以及肝組織中TG水平和NF-κB p65、TNF-α、IL-6蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠肝臟表面紅潤光滑，無褐色斑點，肝組織中炎性細胞、脂肪空泡有所減少，脂滴覆蓋面積有所縮小;其血清TC、TG水平均顯著升高，血清肝酶水平以及肝組織中TG水平和NF-κB、TNF-α、IL-6（雷公藤紅素低劑量組除外）的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：雷公藤紅素能改善MCD飲食致NASH模型小鼠的肝損傷，其作用與減少肝組織中TG堆積、抑制炎癥相關因子表達有關。

關鍵詞 雷公藤紅素;蛋氨酸-膽堿缺乏飲食;非酒精性脂肪性肝炎;機制;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the intervention effects and potential mechanism of celastrol on non-alcoholic steatohepatitis （NASH） induced by methionine-choline deficiency （MCD） diet. METHODS： Male C57BL/6J mice were randomly divided into normal control group， model group， celastrol low-dose and high-dose groups [0.5， 1 mg/（kg·d）]， with 7 mice in each group. The normal control group was given a methionine-choline sufficient diet， while the model group and administration groups were fed an MCD diet to induce NASH model. At the same time， normal control group and model group were given polyoxyethylene castor oil intragastrically; administration groups were given relevant drugs intragastrically; the volume of gavage was 0.1 mL/g， once a day， for consecutive 4 weeks. The liver morphology was observed， and the pathological changes of liver tissue were observed by HE staining and oil red O staining. The levels of serum liver enzymes （AST， ALT）， and the levels of lipid indexes （TC， TG） in serum and liver tissue were detected by enzyme method. The protein expression of NF-κB p65， TNF-α and IL-6 in liver tissue were determined by Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal control group， the volume of the liver was reduced and the color was yellow， and the surface was rough in model group; inflammatory cell infiltration， fat vacuoles and lipid droplets aggregation were found in the liver tissue; the serum levels of TC and TG were significantly decreased， the levels of serum liver enzymes and protein expression of NF-κB p65， TNF-α and IL-6 in liver tissue were significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the liver surface of each administration group was ruddy and smooth without brown spots， the inflammatory cells and fat vacuoles in liver tissue were reduced， and the coverage area of lipid droplets was reduced; the levels of serum TC and TG were significantly increased， the levels of serum liver enzymes， the levels of TG and protein expression of NF-κB， TNF-α and IL-6 （except for celastrol low-dose group） in liver tissue were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Celastrol can improve the liver injury of NASH model mice induced by MCD diet， which is related to the reduction of TG accumulation in liver tissue and inhibition of the expression of inflammatory related factors.

KEYWORDS ? Celastrol; Methionine-choline deficiency diet; Non-alcoholic steatohepatitis; Mechanims; Mice

非酒精性脂肪肝?。∟on-alcoholic fatty liver di- sease，NAFLD）是指排除過量飲酒等明確肝損傷因素，以肝細胞內脂肪過度沉積為特征的臨床病理綜合征[1]，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和脂肪性肝硬化。其中，NASH是NAFL發展為脂肪性肝硬化的重要過渡階段[2]。據統計，約30%～40%的NASH患者合并有肝臟纖維化，10%～15%的NASH患者可發展為肝硬化，而約9%～26%的NASH合并肝硬化的患者在隨訪的4～10年內死亡;此外，NASH發病機制復雜，嚴重情況下可發展為肝癌[3-4]。目前，NASH的防治重點為控制飲食和加強運動[5]，臨床尚無療效確切的防治藥物，現有藥物大多只能發揮輔助作用，且臨床應用有所局限[1]。因此，如何有效防治NASH已成為廣受關注的肝病醫學難題[6-7]。

雷公藤紅素（Celastrol）是來源于衛矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.的一種醌甲基三萜類化合物，具有抗炎、抑制免疫、抗腫瘤等藥理作用[8]。近年來，馮澤民等[9]研究發現，雷公藤紅素能通過調節脂質合成及氧化反應來降低HepG2細胞中三酰甘油（TG）的水平;在進一步的動物實驗中，有學者發現，雷公藤紅素能通過調控肝臟脂質代謝來改善高脂飲食誘導小鼠的NAFLD[10]。因此，綜合其抗炎和調節脂質代謝的作用，筆者推測該化合物對NASH（即NAFLD較為嚴重的階段）具有一定的防治作用;同時，在常用的蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食誘導的NASH動物模型中，有關雷公藤紅素的治療作用及其機制也未見相關報道?；诖?，本研究通過MCD誘導構建NASH小鼠模型，考察預防性使用雷公藤紅素對小鼠相關指標的影響及可能機制，以期為該化合物防治NASH提供理論依據，促進其資源的進一步開發和利用。

1 材料

1.1 儀器

VCX750型超聲波破碎儀（美國Sonics公司）;CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Trans-Blot TurboTM型全能型蛋白轉膜儀、Power Pac Basic型電泳儀、xMark型全波長酶標儀（美國Bio-Rad公司）;Allegra 64R型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）;XB220A型分析天平（瑞士Precisa公司）;GBOX型成像分析系統（美國Syngene公司）;Vortex-Genie2型漩渦混合器（美國Scientific Industries公司）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素原料藥（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS161108-01，純度：>98%）;聚氧乙烯蓖麻油（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號：C107105）;0.9%氯化鈉注射液（河南科倫藥業有限公司，批號：C16091602-1，規格：500 mL ∶ 4.5 g;作生理鹽水用）;鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國Proteintech公司，批號：HRP-60004）;鼠源核因子κB p65（NF-κB p65）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（美國CST公司，批號分別為6959、7074）;兔源腫瘤壞死因子α（TNF-α）多克隆抗體、兔源白細胞介素6（IL-6）多克隆抗體、通用型組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號分別為GB13188-1、GB11117、G1101）;總膽固醇（TC）、TG、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A111-1-1、A110-1-1、C010-2、C009-2）;BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學發光液、M-PERTM哺乳動物蛋白抽提試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為23227、34580、78501）;蛋白酶抑制劑（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：40417）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（美國EpiZyme Scientific公司，批號：18D250）;四甲基乙二胺（TEMED，美國Amresco公司，批號：110-18-9）;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、油紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G1121、G1260）;其余試劑為分析純或實驗室常用規格，水為去離子水。

1.3 動物

SPF級野生型C57BL/6J小鼠，雄性，6周齡，體質量20～25 g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物使用許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。蛋氨酸-膽堿充足（MCS）和MCD飲食均由江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司提供。所有小鼠均飼養于SPF屏障環境中。本研究操作均符合湖北中醫藥大學動物實驗的相關規定。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將28只小鼠隨機分為4組，即正常對照組、模型組和雷公藤紅素低、高劑量組，每組7只。對照組小鼠給予MCS飲食，其余各組小鼠給予MCD飲食以復制NASH模型;與此同時，雷公藤紅素低、高劑量組小鼠按0.5、1 mg/（kg·d）（以聚氧乙烯蓖麻油為溶劑，劑量設置參考本課題組前期預實驗結果）灌胃相應藥物，正常對照組和模型組小鼠均灌胃聚氧乙烯蓖麻油。灌胃體積均為0.1 mL/g，每日1次，連續4周。

2.2 樣本采集

末次給藥后，各組小鼠均禁食、不禁水12 h，摘取一側眼球取血。血樣于冰浴中靜置0.5 h后以2 000 r/min離心5 min，分離血清，備用。取血后頸部脫臼處死小鼠，剝離完整的肝臟，用生理鹽水洗凈后，觀察并記錄肝臟的外觀形態。隨機選取肝組織適量，置于組織固定液中固定，剩余肝組織置于-80 ℃冰箱保存，備用。

2.3 肝組織病理學觀察

取固定于組織固定液中的肝組織適量，經常規石蠟包埋后切片（厚度約4 μm），分別用HE、油紅O染色后，置于顯微鏡下觀察其病理學變化。

2.4 血清和肝組織生化指標檢測

取血清樣品和凍存的肝組織樣品各適量，按照試劑盒方法（酶法）以酶標儀檢測各組小鼠血清中AST、ALT水平以及血清和肝組織中TC、TG水平，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6蛋白表達情況的檢測

采用Western blotting法檢測。取凍存的肝組織適量，加入適量蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲（頻率：20 kHz，功率：750 W）10 s破碎，冰浴裂解0.5 h，以1 000 r/min離心8 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。取蛋白于95 ℃加熱變性5 min，取變性后的蛋白樣品120 μg行SDS-PAGE后，轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h;分別加入NF-κB p65、TNF-α、IL-6一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于 4℃孵育過夜;用TBST溶液清洗8 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000）和GAPDH抗體（稀釋度為1 ∶ 8 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗8 min×3次，經ECL化學發光液顯色后，于成像分析系統上成像并使用Image J 1.8.0軟件分析。以目標蛋白與內參（GAPDH）條帶的灰度值比值作為目標蛋白的表達水平。上述操作重復3～5次。

2.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行統計分析。所有數據均以x±s表示，組間比較采用非配對t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 雷公藤紅素對小鼠肝臟形態及肝組織病理學變化的影響

正常對照組小鼠肝臟表面光滑，鮮紅，有光澤;HE染色顯示，肝細胞排列整齊且形態正常;油紅O染色未見脂滴聚集。模型組小鼠肝臟體積明顯縮小，表面粗糙，顏色泛黃，無光澤，綴有褐色斑點;HE染色顯示，其肝組織中可見炎性細胞浸潤，同時可見許多大的脂肪空泡聚集，脂肪化嚴重;油紅O染色顯示，其肝組織中有大量脂滴聚集。與模型組比較，經雷公藤紅素預處理后，各藥物組小鼠肝臟表面光滑、紅潤，無褐色斑點;HE染色顯示，其肝組織炎性細胞浸潤和脂肪空泡均有所減少或縮小;油紅O染色顯示，其肝組織中脂滴覆蓋面積有所縮小，詳見圖1。

3.2 雷公藤紅素對小鼠血清AST、ALT水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組小鼠血清中AST、ALT水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.3 雷公藤紅素對小鼠血清和肝組織中TC、TG水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG水平均顯著降低（P<0.01），肝組織中TG水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組小鼠血清中TC、TG水平均顯著升高，肝組織中TG水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且其血清TC、TG水平和肝組織TG水平分別有隨劑量增加而升高或降低的趨勢，詳見表2。

3.4 雷公藤紅素對小鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組小鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α的蛋白表達水平以及雷公藤紅素高劑量組小鼠肝組織中IL-6的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表3。

4 討論

NAFLD是一種常見的慢性肝臟疾病，大約有1/3的單純脂肪變性的NAFLD患者會發生NASH[11]。目前，NASH的造模方法各異，不同的動物模型中NASH的發病機制略有不同，生理病理特征也相差甚遠，但都能模仿NASH患者部分顯著性生理或病理學改變[12]。本研究采用了MCD飲食方法來建立小鼠NASH模型，此法誘發的病理改變與人類NASH相似[4]。與其余飲食模型相比，MCD模型更能模仿人類嚴重NASH的病理學改變，且造模2～3周即可形成NASH[11]。關于MCD飲食模型的“二次打擊學說”認為，蛋氨酸和膽堿的缺乏會導致極低密度脂蛋白（VLDL）的合成和分泌受損，而VLDL是將肝細胞內TG運出的主要載體物質，因此使得TG滯留在肝細胞中沉積，構成了“第一次打擊”，從而誘發肝脂肪變性[13];與此同時，蛋氨酸和膽堿的缺乏也會導致肝內抗氧化屏障受損，促使脂質過氧化發生，從而加劇氧化應激反應，進一步使肝細胞結構和功能受損，構成了“第二次打擊”[14-15]。許多研究表明，NF-κB炎癥信號通路在NASH的發展過程中發揮了重要作用，其激活也加速了脂肪肝向NASH的轉變[16-19]。本研究在小鼠體內成功復制了NASH模型，HE、紅油O染色均顯示，模型組小鼠肝臟體積明顯縮小，表面粗糙且顏色泛黃，肝組織中可見炎性細胞浸潤和脂肪堆積。與此同時，模型組小鼠肝組織中TG水平的顯著升高提示其肝細胞內TG的聚集，炎癥因子NF-κB p65、TNF-α、IL-6的高表達提示NF-κB炎癥信號通路的激活，血清中高水平的AST、ALT反映了較為嚴重的肝損傷。但本研究發現，模型組小鼠血清中TC、TG水平均有所下降，與人類NAFLD代謝表型不符，這也提示MCD飲食模型存在一定的缺陷。

雷公藤紅素作為中藥雷公藤的活性成分，由于其突出的抗腫瘤和抗炎作用成為近年來的研究熱點[20]。有研究表明，雷公藤紅素能通過影響脂代謝和NF-κB炎癥信號通路來防治蛋白激酶B（Akt）/肝細胞生長因子受體c-Met共表達誘導的小鼠肝細胞癌（HCC），而NASH是HCC的重要誘發因素之一[21-22]，據此筆者推測雷公藤紅素可能具有防治NASH的作用?；诖?，本研究以MCD飲食小鼠為研究對象，初步考察了雷公藤紅素對NASH相關指標的影響。結果顯示，與模型組比較，雷公藤紅素各劑量組小鼠肝臟表面光滑、紅潤，肝組織內脂肪泡面積縮小，炎性細胞浸潤和脂質聚集均有所減少;與模型組比較，雷公藤紅素各劑量組小鼠血清中TC、TG水平均顯著升高，血清中AST、ALT水平和肝組織中TG水平均顯著降低，肝組織中炎癥因子NF-κB p65、TNF-α、IL-6（低劑量組除外）的蛋白表達水平均有不同程度的下調。這提示雷公藤紅素能改善肝細胞內TG堆積，抑制炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表達，減輕肝損傷。

綜上所述，雷公藤紅素能改善MCD飲食致NASH模型小鼠的肝損傷，其作用與減少肝組織中TG堆積、抑制炎癥相關因子表達有關。本研究為該化合物防治NASH提供了理論依據。由于目前尚無療效確切的藥物用于防治NASH[1]，故暫未找到兼具抗炎、降脂作用的單一藥物作為陽性對照來綜合比較雷公藤紅素的效果;此外，后續亦有待對該化合物防治NASH的具體分子機制進行更為深入的探討。

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（收稿日期：2020-05-27 修回日期：2020-08-31）

（編輯：張元媛）