小鼠出生后早期耳蝸柯蒂氏器巨噬細胞形態的變化

楊衛平許陽胡博華楊仕明

1中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科醫學部（北京 100853）

2國家耳鼻咽喉疾病臨床醫學研究中心（北京 100853）

3聾病教育部重點實驗室（北京 100853）

4聾病防治北京市重點實驗室（北京 100853）

5解放軍總醫院呼吸科（北京 100853）

6美國紐約州立布法羅大學聽力及聾病研究中心(NY 14214 USA）

耳蝸柯蒂氏器是聽覺器官的聲電轉換器，負責聲音的感知，主要由毛細胞和支持細胞組成。毛細胞對各種損傷因素極為敏感，細胞損傷引起耳蝸的炎性和免疫反應[1-3]。

免疫細胞是免疫系統的一個重要組成成分。在穩態情況下，耳蝸的組織巨噬細胞分布于耳蝸不同區域，包括螺旋神經節、螺旋韌帶、螺旋緣、骨螺旋板、血管紋等[4-6]。在耳蝸的感覺上皮，免疫細胞存在于耳蝸基底膜的鼓階面[7-9]。噪聲暴露后1天，循環的單核細胞浸入耳蝸基底膜鼓階面組織，3～7天浸入細胞數量達到高峰。這些細胞轉變為巨噬細胞，參與各種炎性和免疫活動[10]。

耳蝸柯蒂氏器表達多種免疫介質，推論其具有較強的免疫功能[11]。然而在生理條件下，耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器是否存在組織巨噬細胞仍不明確。O'Malley等發現，在耳蝸柯蒂氏器Hensen細胞下存在巨噬細胞免疫蛋白標記物[12]。但其他研究者報道，耳蝸柯蒂氏器缺少免疫細胞[13,14]。耳蝸柯蒂氏器是聽覺的主要器官，揭示免疫細胞對耳蝸柯蒂氏器的免疫作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗選用C57BL/6J小鼠，雌雄各半，出生后1～4 周齡 (出生后 6～7d，10d，14d，17d，21d，28d)每組動物至少4～5只。種鼠購買于美國緬因州巴港杰克遜實驗室，小鼠繁殖、飼養于美國紐約州立布法羅大學實驗動物中心，動物的使用和實驗程序得到布法羅大學動物管理委員會的批準。

1.2 CD45和F4/80免疫標記耳蝸基底膜

CO2吸入麻醉后處死動物，取出小鼠雙側耳蝸，于10%福爾馬林緩沖液4℃固定耳蝸過夜，在10 mM磷酸鹽緩沖液（PBS）中分離耳蝸基底膜。用0.5%Triton X-100和10%驢或山羊血清白蛋白在室溫下作用1 h后，用山羊CD45多克隆抗體（1:200，AF114，RD Inc.，USA）或大鼠抗F4/80單克隆抗體（CI:A3-1）（1:150，ab6640，Abcam Inc.，USA）孵育組織，4℃過夜。二抗孵育組織，CD45染色：Alexa-Fluor?488驢抗山羊IgG(1:200,10 mM PBS稀釋，Invitrogen），F4/80染色：Alexa-Fluor?488或594驢抗鼠IgG（1:100，10 mM PBS稀釋，Invitrogen)，10 mM PBS清洗組織。

1.3 細胞質膜和細胞核染色

用3,3′-二十八碳雜菁高氯酸鹽（DiO，Invitrogen，Inc.）染色細胞質膜。將DiO溶解在N，N-二甲基甲酰胺（DMF，Fisher Scientific，D119-500）中配制DiO染色液（10 μM）。將固定后分離的耳蝸基底膜組織置于DiO溶液中，室溫孵育2 min，PBS沖洗。用碘化丙錠（PI）標記細胞核[2]。

1.4 耳蝸基底膜組織觀察與圖像采集

按照熒光顯微鏡觀察和計算機圖像分析方法[15]，對樣本進行拍照，處理圖像，測量耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞直徑。

1.5 統計學處理

SigmaStat Version3.5軟件(美國)用于分析統計的數據。比較不同周齡小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞直徑采用t檢驗分析，各組數據以表示，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 耳蝸基底膜的中階面存在CD45陽性反應細胞

為確定耳蝸基底膜中階面是否存在CD45陽性反應細胞，及免疫細胞形態、分布特點，我們首先對4周齡小鼠耳蝸感覺上皮組織進行了CD45染色。結果發現，在耳蝸基底膜的中階面存在CD45陽性標記細胞。這些細胞在頂回的頂部呈不規則形，細胞體積較大，約50～70 μm(圖1A，左1-2)，細胞質伸出突起多呈鈍圓形。其它部位多數細胞細長，類似E或F形（圖1A，左3-4)，其長軸與耳蝸長軸平行，開口于耳蝸外側壁或蝸軸，細胞體積自耳蝸基底膜的頂回到底回逐漸減小。細胞沿耳蝸基底膜長軸排列為一排，間隔約為30～40μm，細胞間隔自耳蝸基底膜的頂回到底回逐漸增大（圖1B)。

為對比耳蝸基底膜中階面與鼓階面組織巨噬細胞形態和分布的區別，我們同時觀察了耳蝸基底膜鼓階面的CD45陽性細胞形態。這些細胞分散排列在全耳蝸基底膜，耳蝸的頂回呈樹枝狀，中回呈樹干狀，底回呈變形蟲狀，細胞形態與分布與我們之前的報道相同[7]。

圖1 CD45陽性標記的4周齡小鼠耳蝸基底膜中階面細胞的形態和分布。A:典型細胞形態。B:細胞在耳蝸基底膜的分布。箭頭示CD45陽性標記細胞。標尺：40μm。Fig.1 The morphology and distribution of CD45 positive cells in the scala media side of the basilar membrane of 4-week-old mice.A:Typical images of cell morphology.B:Distribution of cells in the basilar membrane of the cochlea.Arrows indicate the CD45 positive cells.Bars:40μm.

2.2 耳蝸基底膜中階面CD45陽性細胞為巨噬細胞

為鑒別耳蝸基底膜中階面CD45陽性細胞，揭示CD45陽性細胞是否表達巨噬細胞專有蛋白，我們對部分耳蝸基底膜組織進行了CD45和F4/80雙重染色。發現CD45陽性細胞存在F4/80免疫反應（圖2A-C)，表明CD45陽性細胞為巨噬細胞表型；為證明CD45陽性細胞是否存在質膜，我們采用CD45和DiO(一種親脂的示蹤劑）雙重染色部分耳蝸基底膜。發現DiO免疫熒光反應定位于CD45陽性細胞（圖2D-F)，表明CD45陽性細胞具有膜結構；為鑒定CD45陽性細胞是否存在細胞核，我們對部分耳蝸基底膜進行了CD45和PI雙重染色。發現CD45陽性細胞PI染色陰性（圖2G-I)，證明這些細胞缺少細胞核。以上結果表明，4周齡小鼠耳蝸基底膜中階面存在無核的巨噬細胞。

圖2 耳蝸基底膜中階面CD45陽性細胞的鑒別。A：CD45染色，B：F4/80染色，C：CD45與F4/80雙重染色；D：CD45染色，E：DIO染色，F：CD45與DIO雙重染色；G：CD45染色，H：PI染色，I：CD45與PI雙重染色。箭頭示耳蝸基底膜中階面巨噬細胞。標尺:10 μm。Fig.2 Identification of CD45 positive structures in the scala media side of the basilar membrane of cochlea.A:CD45 immunolabeling.B:F4/80 immunoreactivity.C:Merged image of CD45 and F4/80 immunolabeling.D:CD45 immunolabeling.E:DiO immunoreactivity.F:Merged image of CD45 and DiO immunolabeling.G:CD45 immunolabeling.H:PI staining.I:Merged image of CD45 and PI staining.Arrows indicate the CD45 positive structures.Bars:10μm.

2.3 柯蒂氏器巨噬細胞定位于耳蝸基底膜的Hensen與Claudius細胞之間

耳蝸柯蒂氏器細胞具有獨特的形狀和位置，為揭示CD45陽性細胞與耳蝸柯蒂氏器細胞的空間分布關系，我們用CD45和DiO雙重標記耳蝸基底膜細胞。熒光顯微鏡下觀察到Hensen細胞呈大而無規律形，Claudius細胞呈多邊形，CD45陽性細胞定位于Hensen細胞與Claudius細胞連接處（圖3)。

圖3 CD45和DiO雙重染色定位耳蝸基底膜中階面巨噬細胞。箭頭示巨噬細胞。標尺:10 μm。Fig.3 Double staining with CD45 and DiO for location of macrophages in the scala media side of cochlear basilar membrane.Arrow indicates macrophage.Bar:10 μm.

2.4 耳蝸基底膜中階面巨噬細胞與鼓階面巨噬細胞定位無相關性

為揭示耳蝸基底膜中階面巨噬細胞與鼓階面巨噬細胞的定位關系，我們對耳蝸基底膜CD45染色發現，定位于耳蝸基底膜中階面無核的CD45陽性巨噬細胞（圖4箭頭所示)與定位于耳蝸基底膜鼓階面CD45陽性巨噬細胞（圖4三角所示)的分布不相關。

圖4 CD45染色的耳蝸基底膜中階面和鼓階面巨噬細胞的分布。箭頭示中階面柯蒂氏器巨噬細胞，三角示鼓階面巨噬細胞。標尺:40 μm。Fig.4 The distribution of macrophages in the scala media side and scala tympani side of the basilar membrane of cochlea stained by CD45.Arrows indicate macrophages in the scala media side,and triangles indicate macrophages in the scala tympani side.Bar:40 μm.

2.5 耳蝸柯蒂氏器的無核巨噬細胞自出生后有核巨噬細胞轉變而來

為揭示耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器無核巨噬細胞的來源，我們檢查了出生后1～2周的小鼠耳蝸。在這個發育階段，CD45染色的耳蝸基底膜頂部、中部和底部都能夠檢測到巨噬細胞。CD45與PI雙重染色發現，出生后1～2周的小鼠柯蒂氏器巨噬細胞存在細胞核（圖5A)。

為揭示有核巨噬細胞在耳蝸的存在時間，我們檢查了出生后2～3周小鼠耳蝸。發現出生后第17天小鼠耳蝸柯蒂氏器巨噬細胞部分存在細胞核，而另一部分細胞的細胞核消失（圖5B)。表明小鼠耳蝸柯蒂氏器無核巨噬細胞源自出生后有核巨噬細胞,出生2周后開始出現細胞核消失。

圖5 CD45與PI雙重標記的小鼠出生后早期耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞。A：出生后10 d柯蒂氏器巨噬細胞，B:出生后17 d柯蒂氏器巨噬細胞，單箭頭示耳蝸柯蒂氏器無核的巨噬細胞，雙箭頭示耳蝸柯蒂氏器有核的巨噬細胞。標尺:20 μm。Fig.5 Macrophages in the organ of Corti of cochleae during early postnatal mice staining with CD45 and PI.A:Macrophages at postnatal day 10.B:Macrophages at postnatal day 17.Arrow indicates an anucleated macrophage.Double arrows indicate ucleated macrophages.Bar:20 μm.

2.6 小鼠出生后早期耳蝸柯蒂氏器巨噬細胞形態和分布的變化

顯微鏡下觀察CD45染色的耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器巨噬細胞發現，出生后6 d小鼠巨噬細胞輪廓清晰，1～2周齡巨噬細胞形態多樣，細胞體積較大，多個指狀或錐形突起，細胞核呈卵圓形，耳蝸基底膜頂回的柯蒂氏器巨噬細胞稍大于中回和底回。細胞自耳蝸基底膜頂回到底回分布均一（圖6A-F）。

3周齡小鼠耳蝸基底膜頂回柯蒂氏器巨噬細胞呈不規則形，其體積、形態與1～2周齡小鼠中回細胞相似。中回和底回柯蒂氏器巨噬細胞多數呈細長形，偽足較1～2周齡小鼠細胞數量少，突起細而短（圖6G-I）；4周齡小鼠耳蝸柯蒂氏器巨噬細胞體積存在差異，耳蝸基底膜頂回頂部細胞比較大，突起短。中回細胞細長，底回細胞變細、變短,或者消失（圖6J-L）。

不同周齡小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞長軸平均直徑比較發現，3～4周齡小鼠柯蒂氏器巨噬細胞自耳蝸基底膜的頂回、中回到底回逐漸變小(58.7±10.7 μm,48.2±8.9 μm,42.6±5.6 μm)，其細胞直徑均小于出生后1～2周小鼠(69.8±7.3 μm,59.2±13.2 μm,57.8±11.2 μm)，兩者存在明顯差異P＜0.05（P=0.006,P=0.043,P=0.001，t檢驗，圖6M）。

圖6 出生后早期小鼠耳蝸柯蒂氏器巨噬細胞形態變化。A-L：CD45染色的柯蒂氏器巨噬細胞，箭頭示典型的細胞形態，標尺:50μm。M：出生后不同周齡小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞長軸直徑比較。*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001。每組8個耳蝸。Fig.6 Changes of morphology of macrophages in the organ of Corti of cochleae during early postnatal mice.A-L:Macrophages staining with CD45.Arrows indicate typical images of macrophages.Bar:50μm.M:Comparison of the average length of the long-axis of macrophages in the organ of Corti in different weeks of early postnatal mice.*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001.n=8 cochleae for each group.

3 討論

本研究主要發現：1）出生后早期小鼠耳蝸基底膜的中階面柯蒂氏器存在形態多樣的組織巨噬細胞。2）當柯蒂氏器發育成熟時，這些巨噬細胞出現發育性死亡，遺留下無核的巨噬細胞殘體。3）小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞的形態和分布特點與耳蝸基底膜鼓階面巨噬細胞不同。

本實驗觀察到出生后早期小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器下Hensen與Claudius細胞之間存在巨噬細胞，這些細胞出生時已經發育成熟，但其壽命很短，伴隨感覺上皮的成熟出現發育性退化。O'Malley等曾采用免疫組織化學方法在52～88歲無增齡相關耳蝸病變人的火棉膠包埋顳骨組織切片中觀察到，耳蝸柯蒂氏器Hensen細胞下存在巨噬細胞標記物[12]，我們的發現與O'Malley關于柯蒂氏器巨噬細胞定位相同。不同的是我們觀察到小鼠出生后17天開始出現柯蒂氏器巨噬細胞核消失，而O'Malley等發現，老年人耳蝸存在柯蒂氏器巨噬細胞。該研究結果不一致的解釋：1）被收集的個體組織存在差別，我們的實驗對象為出生后早期小鼠耳蝸，O'Malley等觀察的是52～88歲人類顳骨。2）研究方法不同，我們采用的是巨噬細胞蛋白標記物和細胞核DNA染料雙重染色耳蝸基底膜，O'Malley等僅采用巨噬細胞蛋白標記物染色耳蝸基底膜，不能觀察到細胞核的變化。

我們前期報道了小鼠耳蝸基底膜鼓階面巨噬細胞的形態、分布特點[7]，本研究觀察了小鼠耳蝸基底膜中階面巨噬細胞的形態、分布特點，及出生后早期形態學變化。發現耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細胞與耳蝸基底膜鼓階面巨噬細胞存在以下異同點：1）兩者都屬于耳蝸基底膜組織巨噬細胞，中階面柯蒂氏器巨噬細胞存在于毛細胞下的支持細胞間隙，鼓階面巨噬細胞存在于基底膜鼓階面的表層[7]。2）柯蒂氏器巨噬細胞源自耳蝸基底膜胚胎衍生的細胞，出生后一周細胞輪廓清晰；基底膜鼓階面巨噬細胞源自耳蝸基底膜胚胎衍生的細胞及耳蝸血管內單核細胞的滲入[7]。3）柯蒂氏器巨噬細胞伴隨耳蝸發育成熟而死亡，基底膜鼓階面巨噬細胞終生存在[15]。4）柯蒂氏器巨噬細胞出生后1～2周，體積大，突起長，形狀多樣性。生后3～4周細胞殘體除耳蝸基底膜頂回頂部細胞呈不規則形狀外，其余部分形似E和F形；耳蝸基底膜鼓階面的巨噬細胞出生時呈現單核細胞形狀，這些細胞在生后發育中歷經了專一位點分化，并將其形態保持至成年。頂回巨噬細胞呈樹枝狀，中回細胞呈短突起的樹干狀，底回細胞進一步分化為變形蟲形[7]。5）柯蒂氏器巨噬細胞與鼓階面巨噬細胞定位不相關?？碌偈掀骶奘杉毎远伝啄ろ敾氐降谆貑涡信帕?，基底膜鼓階面巨噬細胞分散排列。6）噪聲暴露后滲入的單核細胞僅存在于基底膜鼓階面[7]。鑒于以上比較分析，推論耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器巨噬細胞與鼓階面巨噬細胞可能存在不同的生物學功能。

耳蝸組織巨噬細胞除產生炎性因子[16]，抗原的呈遞外[10]，吞噬作用是巨噬細胞的重要功能之一，耳蝸組織巨噬細胞吞噬和清除衰老、損傷細胞碎片[17]。小鼠出生時耳蝸膜迷路的大部分結構已經形成，但發育并未成熟，其發育過程延續至出生后2周[18]。在這一階段，感覺上皮歷經幾個重要的結構修飾，包括除去感覺上皮多余的細胞，螺旋血管的重建，柯蒂淋巴腔的形成，及感覺細胞與神經元連接的細微變化，這些結構的重塑需要從耳蝸清除多余的細胞。耳蝸感覺上皮的成熟過程自耳蝸基底膜底回到頂回發展，與耳蝸功能的成熟過程相一致。本實驗發現，出生后6天柯蒂氏器巨噬細胞分化形態成熟，可能存在功能。此外，柯蒂氏器巨噬細胞臨近的組織歷經了發育結構的變化，而柯蒂氏器巨噬細胞保持自身活力直到感覺上皮發育結束，柯蒂氏器發育成熟后，這些巨噬細胞出現發育性死亡。值得注意的是柯蒂氏器巨噬細胞發育性退變過程從底回到頂回，其與耳蝸基底膜感覺上皮的成熟從底回到頂回的發展過程相一致。這些發現提示，柯蒂氏器巨噬細胞可能參與了耳蝸基底膜感覺上皮的發育過程。