云南春燥環境下小鼠氣道RS及IL-8含量的實驗研究

柏靜萍 宋志敏 魏寧頤 楊梅

摘要：目的?通過觀測云南春燥環境條件下小鼠氣道中粘多糖（RS）、白介素8（IL-8）含量的變化，探究春燥環境對小鼠氣道津液代謝及衛外功能的影響，并闡釋“燥勝則干”、“肺津耗傷”、“燥犯肺衛”、“肺衛失司”等中醫理論。方法?復制云南春燥環境的多重因素作用于實驗小鼠，并以桑杏湯灌胃反證模型。結果?模型組小鼠氣道RS含量相較于正常組有顯著降低（P<0.01）;加水組小鼠氣道RS含量有明顯下降（P<0.05）;桑杏湯組小鼠氣道RS相較模型組含量有顯著提升（P<0.01）;模型組、加水組小鼠相較于正常組，氣道IL-8含量明顯升高（P<0.05）;桑杏湯組小鼠氣道IL-8含量下降趨勢明顯（P>0.05）。結論?處于云南春燥環境下的小鼠氣道RS含量顯著降低、IL-8含量升高明顯，且在桑杏湯的干預下均有改善，可初步將RS、IL-8納入云南春燥動物模型的觀測及評價的指標體系之中進一步研究。

關鍵詞：云南春燥;桑杏湯;粘多糖RS;白介素IL-8

中圖分類號：R563?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2021）01-0074-04

【Abstract】Objective： To study the effect of spring dry environment on the metabolism of airway body fluid and external health functions in mice by observing the changes of mucopolysaccharide（RS） and interleukin-8（IL-8） contents in airways of the mice in the spring dry environment of Yunnan and explain the traditional Chinese medicine theories such as “dryness brings out deficiency of fluid”， “lung fluid hurts”， “dryness offends lung” and “lung health loses”. Methods： The laboratory mice were replicated to multiple factors of spring dry environment of Yunnan and the disproof model was made by gavage administration of Sangxing Decoction. Results： The airway RS content of the mice in the model group was significantly lower than that of the normal group（P<0.01）. The airway RS content of the mice in the water added group was significantly reduced（P<0.05）. Compared with that of the model group， the content of the airway RS of the mice in the Sangxingtang group significantly increased（P<0.01） and compared with that of the normal group， the airway IL-8 content of mice in the model group and the water added group significantly increased（P<0.05）. The IL-8 content in the airway of the Sangxingtang group had a significant downward trend（P>0.05）. Conclusion： The airway RS content of mice in the spring dry environment of Yunnan was significantly reduced， and IL-8 content was significantly increased， and the content of the two groups improved under the intervention of Sangxing Decoction. RS and IL-8 can be initially included in the indicator system of animal model observation and evaluation.in the spring dry environment for further study.

【Key words】spring dryness in Yunnan， Sangxing Decoction， mucopolysaccharide RS， interleukin IL-8

外燥證，是一為外邪燥氣侵襲，以目口鼻咽干澀、干咳少痰、皮膚毛發枯槁、便干結尿少等以津液匱乏之類特征為主要表現的癥候[1]。云南因其獨特的地勢特點，形成夏秋多雨、冬春干燥的氣候，加之春季風力強勁及居民擅食辛辣厚味的特點，內外合邪，形成云南特有的春燥證[2-3]。

當前，“云南春燥”相關實驗研究已初見成效，本實驗擬在前期實驗的基礎上，將小鼠置于復制云南春季“干燥多風”的氣候特點的氣候箱中，同時飼與辛辣食料，并予以方藥反證，通過觀測小鼠表征、組織及體液分子指標的變化，深入探究春燥環境對小鼠氣道津液代謝及衛外功能的影響，為建立云南春燥動物模型提供進一步的科學、客觀依據。研究內容如下：

1?材料與方法

1.1?實驗材料

1.1.1?實驗用藥?桑杏湯：桑樹葉15 g，苦杏仁15 g，梨子皮20 g，南沙參15 g，浙貝母15 g，梔子皮10 g，香豆豉10 g。該方源自《溫病條辨》，劑量依據導師楊梅教授診治云南春燥證臨床用量。所用中藥材由云南省中醫院供給，品質佳。熬制湯劑，于5倍藥材量的水浸泡藥材10 min，一煎武火煮沸轉文火續煎15 min，濾液備用;二煎原藥渣于3倍水照前法煎5 min，過濾備用。兩煎藥液混合混勻，加熱并濃縮至100 mL，置于4℃冰箱內存放。依據人與動物體表面積換算法[4]，小鼠灌胃給藥體積為15 mL/kg。

1.1.2?實驗動物?SPF（♂）KM小鼠60只，體重為（20±2）g/只。來源：昆明醫科大學實驗動物中心;生產準許證編號：SCXK（滇）K2015-0002;飼養地點：云南中醫藥大學動物房。

1.1.3?實驗試劑及儀器?RS試劑盒（江萊生物 JL39124）;IL-8試劑盒（Abbexa abx576773）;PBS（南京生興生物 SN331）;動物培養箱RGX-250（上海印溪）;Multiskan Fc酶標儀（Thermo）;HR/T16M離心機（湖南赫西）;DW-86C338（J）-80℃超低溫冰箱（海爾）;DK-S24恒溫水浴鍋（上海森信）;1290超高效液相色譜儀（Agilent）;6430LC-MS三重四級桿質譜儀（Agilent）.

1.2?實驗方法

1.2.1?動物分組?先將實驗小鼠于動物房適應性飼喂4 d后，隨機把小鼠分為正常、模型、桑杏湯及加水組4組，各15只每組。

1.2.2?干預要素?參照課題組前期實驗的干預條件[5]，將正常組、模型組、桑杏湯及加水組分別放置于培養箱中。各組實驗鼠干預條件要素設置如表1所示。

1.2.3?肺泡灌洗液取材?小鼠取材前禁水禁食10 h。頸椎脫臼法將其處死，仰臥位固定，用手術剪及彎鑷充分暴露小鼠頸部氣管，延喉頭位置向下0.5 cm處氣管做切口，行氣管插管常規操作，向肺組織內推注37℃生理鹽水1 mL，回抽此液并重復該操作2次，將采集的肺泡灌洗液離心（溫度：4℃;時間：20 min;轉速：2500 r/min）處理，取上清液，采用ELISA法檢測小鼠氣道RS、IL-8含量。

1.2.4?統計分析?實驗所得數據選用軟件SPSS 22.0進行分析統計，結果全選用均值±標準差（x±s）表示，組間差異對比選擇單因素方差分析法（One-Way ANOVA），以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2?實驗結果

相較于正常組，模型組小鼠氣道RS含量顯著降低（P<0.01），加水組小鼠氣道RS含量下降明顯（P<0.05），2組小鼠氣道IL-8含量增加明顯（P<0.05），差異具統計學意義;桑杏湯組小鼠氣道RS及IL-8含量輕微提升（P>0.05），差異不具統計學意義。

相較于模型組，桑杏湯組小鼠氣道RS含量顯著提升（P<0.01），差異極具統計學意義;其IL-8含量大幅度降低趨勢明顯（P>0.05），但差異不存在統計學意義。加水組小鼠氣道RS含量有減少（P>0.05），IL-8含量輕微降低（P>0.05），差異不具統計學意義。（見表2）

3?討論

《黃帝內經》[5]曾有論述，人有正氣，外邪不可侵，外邪侵襲必有正氣內虛。中醫正氣的內涵與現代醫學中的人體免疫如出一轍，津液也屬人體正氣重要組成成分[6]。若燥邪侵襲，從口鼻而入，斂于氣道、皮膚，氣機滯澀，肺宣發失調、津液輸布障礙，肺津耗傷，致機體御邪功能受損。故本實驗選取氣道RS及IL-8作為微觀分子觀測指標，旨在探討云南春燥環境對小鼠氣道津液代謝及肺衛御邪功能的影響。

3.1?春燥環境下小鼠氣道黏多糖RS含量變化?RS屬黏蛋白的一部分是氣道黏膜的重要分泌物，其變化代表著氣道黏液的分泌狀態，且與氣道黏液的分泌呈正相態[7]，對于氣道輸布津液具有重要意義。鑒于此，本實驗選擇RS作為氣道津液盈虧的判斷指標之一，通過觀察給與云南春燥環境條件因素干預的小鼠氣道RS含量變化，以闡明各組小鼠津液的盈虧狀況。實驗結果顯示，與正常組相比較，模型組、加水組小鼠氣道RS含量下降顯著。說明燥邪侵襲，邪正交爭于氣道，燥勝則干，肺氣失宣，損耗津液，氣道津液驟然損耗，氣道黏膜因此損傷而致RS分泌量降低，津液生成輸布受阻，氣道黏膜表面黏液失于潤澤，煎聚成痰;飲水干預后，成效不顯，說明外燥侵犯，燥邪不祛，肺津不生。桑杏湯組小鼠氣道RS含量明顯高于模型組、加水組，說明在使用方藥桑杏湯灌胃后，燥邪去而正氣安，肺氣得以正常宣發肅降，氣道黏膜分泌功能恢復，津液生成輸布正常，津生而燥解。

3.2?春燥環境下小鼠白介素8 IL-8含量變化?衛氣乃屬于人體“正氣”的組成之一，由肺氣宣發而行于外而護肌表，御外邪。肺衛的發揮與肺氣的宣發密切相關，肺氣充，衛氣達，則機體御邪抗病能力強;反之，則衛外失之御邪屏障，易感病邪?，F代有研究認為氣道的免疫防御能力同中醫的肺衛御邪功能存在緊密的聯系[9]。白介素參與人體的多種生理病理反應，是人體免疫防御系統重要組成之一。IL-8是在機體內分布較為廣泛的一種白介素，由機體炎癥狀態以及免疫應答所產生，對機體防御保護作用表現尤為出眾。其免疫功能與中醫肺宣發衛氣抗邪有諸多相合之處。本實驗通過觀測IL-8的含量變化，以判斷各組小鼠肺衛之氣強弱，從而推斷處于云南春燥環境條件下對各組小鼠衛外功能的影響。

實驗結果顯示，與正常組相比較，模型組、加水組小鼠氣道IL-8含量升高趨勢明顯，提示，燥邪襲肺，邪正相爭于氣道，肺衛失宣，傷耗津液，衛氣抗御外邪，機體處于激發免疫應答狀態，故IL-8含量增加;加水組給與飲水干預，IL-8含量未見明顯改變，免疫反應持續，說明飲水并不能祛燥邪以固肺氣衛外功能。而與模型組、加水組相比較，桑杏湯組小鼠氣道IL-8含量下降趨勢明顯，提示經方藥干預后，燥邪漸退，肺氣宣發，衛外御邪功能逐漸恢復，免疫反應下降。

綜上所述，體內津液由肺氣宣發肅降而布散全身，當“燥犯肺衛”致“肺津耗傷”之時，小鼠體液平衡狀態被打破，機體津液布散失調，其呼吸道失去潤養，故RS含量顯著減低，氣道津液丟失的同時，氣道黏膜損傷致分泌功能障礙，使其分泌物（免疫因子等）的類別及含量受到影響，“肺衛失司”，機體進入邪正交爭的狀態，免疫應答啟動，故小鼠IL-8含量上升明顯。在使用桑杏湯干預后，氣道RS含量上升，IL-8含量下降。說明在給與云南春燥環境要素干預的條件下，確可影響各組小鼠氣道津液代謝及肺衛功能。故筆者認為，可初步將RS，IL-8納入云南春燥動物模型的觀測及評價指標體系，以進一步研究。

參考文獻：

[1]陳家旭，鄒曉娟.中醫診斷學[M].北京：人民衛生出版社，2016：123，137-138.

[2]鄭進，羅艷秋，左媛媛.云南春燥概念的提出及其臨床辨治[J].中華中醫藥學刊，2009，27（5）：923-925.

[3]張艷.云南燥證證機研究[D].昆明：云南中醫學院，2015.

[4]林銀驥.云南春燥環境對小鼠表征及氣道相關蛋白影響的實驗研究[D].昆明：云南中醫藥大學，2019.

[5]陳宗瑜.云南氣候總論[M].北京：氣象出版社，2001：5.

[6]王冰.《黃帝內經素問》[M].北京：人民衛生出版社，1963：423.

[7]孫理軍.論津液的抗病作用及其免疫學基礎[J].陜西中醫，2001（12）：740-742.

[8]丁建中，龔權，朱慧玲，等.外燥對小鼠呼吸道分泌功能與抗體的影響[J].長江大學學報（自科版），2005（12）：341-342+351+330.

[9]丁建中.外燥致病機制的實驗研究[D].武漢：湖北中醫學院，2006.

（收稿日期：2020-09-28）