基于整合臨床和動物實驗的小分子篩選平臺揭示經典方劑茵陳蒿湯治療黃疸證顯效狀態下的活性化合物及潛在作用靶點

熊輝, 張愛華, 郭雅靜, 周小航, 孫暉, 楊樂, 方衡, 閆廣利, 王喜軍,b,c,*

a National Chinmedomics Research Center&National TCM Key Laboratory of S erum Pharmacochemistry, Department of Pharmaceutical Analysis, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

b S tate Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of S cience and Technology, Macau 999078, China

c National Engineering Laboratory for the Development of S outhwestern Endangered Medicinal Materials, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023, China

1.引言

由于中藥和人類疾病的復雜性，目前還沒有有效的研究策略來揭示中藥方劑化學成分與藥效之間的關系。與傳統的藥效追蹤分離相比，中藥血清藥物化學是揭示中藥方劑活性成分的有效工具，因為只有從血清中發現的成分才有可能成為潛在的藥效物質[1]。網絡藥理學被認為是深度挖掘中藥方劑整體性和系統性本質的有效技術，其核心思想是闡明活性成分、分子靶標與疾病特征之間的生物學語言。與組學技術相結合，可以更有效地提高未知和已知靶點鑒定的準確性[2]。代謝組學作為系統生物學的重要組成部分，主要用于探索整個生物系統中受干擾的生物標志物及其代謝通路的變化規律，特別適用于揭示生物體的臨床表型。因而代謝組學在新藥開發方面具有巨大潛力[3]。血清藥物化學、代謝組學和網絡藥理學的整合分析可以將活性化合物和靶標與內源性代謝物相關聯，有利于挖掘出活性化合物的功能靶標[4]。

膽汁淤積性黃疸是由于肝內外膽管梗阻或肝細胞受損導致膽汁酸異常積聚而引起的臨床病癥，主要表現為黃疸[5]。茵陳蒿湯首載于東漢張仲景《傷寒論》，是治療膽汁淤積性黃疸的經典方劑，全方由大黃（DH）、茵陳（YC）、梔子（ZZ）三味藥組成[6]。大量臨床和動物研究表明，茵陳蒿湯在利膽去黃、抗肝損傷、抗肝纖維化、抗炎、胰腺保護和抗腫瘤等方面療效顯著[6-7]。雖然茵陳蒿湯在治療膽汁淤積性黃疸的相關動物模型和臨床研究中的療效已得到廣泛證實，且無明顯毒副作用，但中藥復雜性和多樣性的問題嚴重阻礙了對其活性成分和保肝機制的研究，這極大地制約了對其先導化合物的發現。

本研究開發了基于中藥血清藥物化學、代謝組學技術、網絡藥理學方法和實驗驗證于一體的破譯中藥方劑活性成分和核心靶標的新策略，研究設計的思路如圖1 所示。首先招募了226名受試者和60只小鼠，從臨床和動物兩個方面通過非靶標代謝組學技術揭示疾病生物標志物并評價方劑療效。其次通過中藥血清藥物化學方法發現茵陳蒿湯的體內活性成分，并借助包括數據庫挖掘、Metabo‐Analyst 3.0軟件Pathway Analysis模塊（MetPA）和獨創通路分析軟件（IPA）組學平臺的綜合網絡分析方法確定了潛在作用靶點。鑒于小鼠和人類生物過程之間的高度相似性，進一步整合臨床和動物數據揭示茵陳蒿湯的活性化合物、作用靶標和疾病核心生物標志物。最后，對關鍵靶標進行實驗驗證，證明該研究策略的可行性。這種方法有助于挖掘中藥生物活性化合物，并發現其治療疾病的新靶點。

2.實驗方法

2.1.藥物和試劑

所有藥材均購自哈爾濱同仁堂藥店。包括：α-奈異硫氰酸酯（美國Sigma-Aldrich）；乙醇和橄欖油（國藥化學試劑北京有限公司）；多藥耐藥相關蛋白2（ABCC2）、法尼醇X 受體（FXR）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）、多藥耐藥相關蛋白3（ABCC3）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A1（UGT1A1）試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；直接膽紅素（DBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（TSOD）和天冬氨酸轉氨酶（AST）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；總膽汁酸（TBA）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）（江蘇南京建成生物工程研究所）。

圖1.整合血清藥物化學、代謝組學和網絡藥理學的研究策略。ROC：受試者工作特征曲線；IPA：基于云計算的一體化生物通路分析軟件；UGT1A1：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A1；CYP7A1：膽固醇7α-羥化酶；FXR：法尼醇X受體；ABCC：多藥耐藥相關蛋白；TCMSP：中藥系統藥理學數據庫和分析平臺；有數據支持的疾病基因數據庫（DigSee）、人類基因數據庫（GeneCards）和藥物靶標數據庫（TTD）均是疾病靶點數據庫。

2.2.實驗動物與給藥方案

無特定病原體（SPF）雄性Balb/c小鼠[體重為（20±2）g]購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。將60 只動物分為兩類數據集。其中數據集1包括對照組和黃疸組，數據集2包括對照組、黃疸組和茵陳蒿湯組。每組12只小鼠。對于黃疸組合茵陳蒿湯組，每只小鼠按每10 g 體重給藥0.1 mL灌胃，連續14天每天早上給予0.013 g·mL?1的干姜溶液和下午給予12.5%（體積分數）的乙醇溶液，第15天給予1.5 mg·mL?1的ANIT 橄 欖 油 溶 液，第16 天 給 予1.0 mg·mL?1的ANIT橄欖油溶液?？瞻捉M按每10 g體重給藥0.1 mL灌胃，連續14天給予生理鹽水，第15、16天給予橄欖油。茵陳蒿湯組從第17 天開始按照每千克體重給藥10 mg 灌胃，連續7 天給予茵陳蒿湯溶液（5 g·mL?1），而對照組按每10 g體重給藥0.1 mL灌胃，給予蒸餾水[8]。所有實驗操作經黑龍江中醫藥大學動物倫理委員會批準，并按照《赫爾辛基宣言》原則進行。

2.3.臨床受試者與給藥方案

2016—2018 年在黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院共納入黃疸患者106 例，健康受試者120 例。納入病例標準：血清TBIL 水平約為171 μmol·L?1，同時血清ALP、γ-GT和DBIL水平也升高，臨床可以明顯觀察到皮膚組織黃染。排除病例標準：妊娠及哺乳期婦女、參加其他藥物試驗或資料不全等影響療效性和安全性判斷者、腎或造血系統等嚴重原發性疾病者、精神病者。茵陳蒿湯由黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院熬制包裝。黃疸患者連續15 天口服茵陳蒿湯治療，每天兩次，每次100 mL。受試對象分為兩類數據集：數據集1包含120例健康受試者和72例黃疸患者；數據集2包含120例健康受試者、72例黃疸患者和34例接受茵陳蒿湯治療的患者。

2.4.樣品制備

小鼠摘眼球取血，臨床受試者靜脈取血，新鮮血液樣品靜置30 min 后離心（4 ℃，3000 r·min?1，15 min），取上清液?80 ℃貯存[9]。樣品分析前室溫解凍，取小鼠200 μL血清加600 μL 甲醇，渦旋30 s，靜置30 min，于4 ℃、13 000 r·min?1離心5 min，移取上清液2 μL用于血液代謝分析。

臨床血清樣本2 mL，加入40 μL磷酸溶液，渦旋30 s混勻，上樣到預先活化和平衡好的固相萃取柱上，用1 mL 水淋洗，棄去淋洗液，再以2 mL 甲醇進行洗脫，收集洗脫液并于45 ℃氮氣下吹干，用150 μL甲醇復溶殘渣，離心15 min（13 000 r·min?1，4 ℃），上清液過0.22 μm 濾膜后，進樣5μL 供血中移行成分分析。小鼠血清樣本處理方式與臨床血清樣本一致。

2.5.臨床生化指標和組織病理學評價

按試劑盒說明檢測ALP、ALT、AST、DBIL、TBIL、γ -GT、 TBA、 GSH-Px、 MDA、 T-SOD、 UGT1A1、CYP7A1、FXR、ABCC3、ABCC2 的值。小鼠采血后肝組織用蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡下進行組織病理學觀察。

2.6.代謝組學分析

檢測系統為Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀（Wa‐ters 集團公司，美國）和SynaptTMG2Si-HDMS 質譜儀（Waters集團公司，美國）。小鼠和臨床受試者血清樣品分別在ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters 集團公司，美國）和ACQUITY UPLC HSS C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）（Waters 集團公司，美國）上分離。代謝組學分析參數（見附錄A中表S1至表S3），包括色譜條件（柱溫、流速、梯度洗脫程序、進樣量）以及質譜條件（離子源溫度、脫溶劑溫度、樣品錐孔電壓、毛細管電壓），確保結果的穩定、準確和可重復。小鼠和臨床受試者血液代謝分析的柱溫分別設定為40 ℃和45 ℃，進樣量均為2 μL。

2.7.代謝物及代謝通路分析

代謝物鑒定方法與先前研究[9]報道的一致。通過多元統計方法結合精確的分子量、分子式[接近于零的i-FIT值，小于百萬分之五（5 ppm）偏差]、二級碎片以及人類代謝組數據庫（HMDB）、ChemSpider、京都基因和基因組百科全書（KEGG）和Metlin 數據庫進行代謝物表征。為了挖掘黃疸相關的核心代謝通路，利用MetaboAnalyst 3.0軟件Pathway Analysis模塊對回調血液標記物涉及的代謝通路進行富集分析，將其可視化并功能注釋。

2.8.茵陳蒿湯血中移行成分分析

血樣在ACQUITY UPLC HSS C18 色譜柱上分離，流速0.4 mL·min?1，柱溫45 ℃。其他色譜和質譜參數見附錄A 中表S4 和表S5 [9]。借助Progenesis QI 軟件結合MassLynx 4.1軟件中元素組成模塊及二級碎片對血中移行成分進行表征。

2.9.小分子整合分析

首先利用中醫藥系統藥理學數據庫分析平臺（TC‐MSP）、SwissTargetPrediction和SuperPred數據庫搜索入血成分靶點信息，并利用人類基因數據庫（GeneCards）、藥物靶標數據庫（TTD）、人類孟德爾遺傳病的數據庫（OMIM）[10-11]搜索與膽汁淤積性黃疸疾病相關靶點，將作用靶點名稱進行規范，合并去重。把藥物成分與疾病的交集基因通過Cytoscape 3.0 軟件繪制成“活性成分-靶點-疾病”關系網絡圖。為了便于合理解釋生物過程、分子功能和細胞成分中所涉及的功能靶標，借助基因間功能關聯關系的數據庫（STRING）進行基因本體論（GO）富集分析和KEGG通路富集分析，預測其作用機制。進一步整合MetaboAnalyst 3.0和IPA代謝組學分析平臺，挖掘已鑒定生物標志物涉及的代謝通路，分析包括基因、蛋白質、生物標志物在內的各種小分子互作網絡。通過網絡藥理學和血清藥物化學相結合方式捕捉入血成分富集的代謝靶標和代謝通路，整合代謝組學數據分析平臺的分析結果，最終構建茵陳蒿湯活性成分-靶點-代謝物相關聯的核心機制網絡圖。

2.10.數據分析

結果用統計產品與服務解決方案軟件（SPSS）處理，以±SD表示，多組間比較使用單因素方差處理，兩組之間的比較用t檢驗進行分析，P<0.05時為差異顯著。

3.實驗結果

3.1.臨床化學及組織病理學

與健康對照組比較，黃疸組年齡、性別和體重指數、肝功能檢查的各項指標[包括前白蛋白原（PA）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）和總蛋白（TP）]均無顯著差異，而ALP、ALT、AST、TBIL、DBIL、間接膽紅素（IBIL）、CHE、γ-GT 存在極顯著差異（P<0.01），說明臨床所采集的黃疸病例均滿足診斷標準，可用于本實驗研究。數據集2包含120例健康受試者、72名黃疸患者和34名接受茵陳蒿湯治療的黃疸患者。經茵陳蒿湯治療后，患者ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL 表達水平呈明顯下降趨勢（P<0.01或P<0.05），皮膚黃染有所緩解。進一步建立黃疸相關模型組小鼠，可以觀察到，與對照組比較，模型組小鼠血清AST、DBIL、TBIL、ALP、ALT、γ-GT、TBA含量明顯升高（P<0.01或P<0.05），而T-SOD含量明顯下調（P<0.05）；肝組織中MDA 含量上調不明顯，GSH-Px 含量明顯下調[P< 0.01；見附錄A 中圖S1（b）和表S7]。組織病理學結果顯示，模型組小鼠肝細胞出現大面積水腫現象，肝小葉結構紊亂，肝細胞已高度水腫至氣球樣病變，局部伴有炎細胞浸潤現象[見附錄A 中的圖S1（c）]。與模型組相比，茵陳蒿湯組小鼠壞死面積明顯減小，水腫程度減少，肝臟各組織結構（小葉、肝板、血竇、小葉中央靜脈、葉間靜脈、動脈、膽管）清晰，未見明顯異常，偶見少量炎細胞分布其中[見圖S1（c）]。這些結果說明茵陳蒿湯治療黃疸療效顯著。

3.2.代謝軌跡和輪廓分析

EZinfo軟件通常用于對數據進行非監督型主成分分析（PCA），以便獲得不同組代謝軌跡的直觀聚類信息。如圖2所示，從小鼠和人的二維PCA和三維PCA得分圖中觀察到黃疸組和對照組之間的代謝輪廓明顯分離，這從血清基峰色譜圖中得到進一步證實（見附錄A中的圖S1）。為了進一步評價茵陳蒿湯的療效，本研究發現，無論臨床黃疸患者還是黃疸模型小鼠給予茵陳蒿湯治療后均出現了出現明顯的回調趨勢，表明茵陳蒿湯可以有效恢復黃疸病的病理進程（見附錄A中的圖S3）。

3.3.代謝物鑒定和代謝途徑分析

進一步進行偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），獲得正負離子掃描模式下的得分圖、差異權重貢獻值（VIP）散點圖和S-Plot圖，篩選出在兩組間表達存在顯著性差異（P<0.05）且對分組貢獻度（VIP>1.0）大的內源性離子作為候選離子。最終根據數據庫和二級碎片信息，確定小鼠12 個生物標志物（正負離子模式分別為4 個和8 個），以及來自臨床受試者的14 個生物標志物（正負離子模式分別為7 個和7 個）（見附錄A 中的表S9）。如圖3 和圖4所示，為了直觀地闡述茵陳蒿湯如何影響代謝變化并明確回調的核心生物標記物，進一步繪制了生物標志物相對強度的散點圖和熱圖。同時為了驗證已鑒定代謝物的分類能力，以這些代謝物為評價基礎，從192名受試者中隨機選擇60 個臨床樣本進行代謝輪廓分析。結果顯示數據集被分為兩個聚類，其中32個樣本被歸為組1，28個樣本被歸為組2。通過觀察兩組中每個樣本的信息，發現組1和組2中的樣本分別是健康組和黃疸組受試者，本研究初步驗證了篩選標記物的適用性（見附錄A中的圖S4）。

為了減少用于臨床診斷和分析應用的代謝物數量，以接收者操作特征曲線下的面積（AUC）大于0.9為篩選原則，本研究對臨床受試者14個生物標志物和小鼠的12個

生物標志物進行了指標數降低。按照AUC 值排序，在臨床受試者中排名靠前的?；悄懰?、膽紅素葡糖醛酸苷、膽紅素和膽綠素被認為是核心生物標志物[見附錄A 中的表S10和圖S5（a）]；在模型小鼠中排名靠前的是磷脂酰膽堿（16∶0/16∶0）、膽紅素、磺甘膽酸鹽（2?）、溶血磷脂膽堿[18∶1(9Z)]、膽綠素和?；悄懰醄見附錄A 中的表S11和圖S5（b）]。巧合的是膽紅素、膽綠素和?；悄懰嵩谂R床受試者和小鼠樣本中均被發現。聚焦臨床核心標記物膽紅素、膽綠素、膽紅素葡萄糖醛酸苷、?；悄懰?，借助MetaboAnalyst 3.0 軟件Pathway Analysis 模塊進行通路富集分析，發現這些標記物主要涉及卟啉和葉綠素代謝以及初級膽汁酸生物合成。本研究進一步借助KEGG數據庫構建代謝通路和生物標志物的關聯網絡，如圖5所示。

圖2.小鼠和臨床受試者非靶標血液代謝組學的多變量分析輪廓圖。負離子模式（a、c）和正離子模式（b、d）下小鼠二維和三維PCA得分圖；負離子模式（e、g）和正離子模式（f、h）下臨床受試者二維和三維PCA得分圖。PC：主成分。

3.4.潛在靶標預測

為了進一步挖掘黃疸病的潛在功能機制，本研究借助IPA組學分析平臺對黃疸模型小鼠和黃疸患者內在功能變化及典型通路（見附錄A 表S12 和S13）進行分析，識別出核心生物標記物?；悄懰?、膽酸、膽紅素葡萄糖醛酸苷、膽紅素和膽綠素參與膽汁淤積相關的膽汁酸生物合成、血紅素降解、白細胞介素-10 信號傳導和法尼醇X 受體/維甲酸X 受體（FXR/RXR）的激活，并構建了生物標志物預測網絡。根據典型代謝通路和關聯網絡模塊分析結果（見附錄A 中的圖S6、S7），本研究發現UGT1A1、ABCC3 等下游蛋白參與血紅素降解通路，調節膽紅素的表達，下游蛋白ABCC3、FXR 以及上游蛋白CYP7A1 參與初級膽汁酸生物合成和FXR/RXR 的活化，調節?；悄懰岬谋磉_。給藥治療后，發現茵陳蒿湯能激活FXR、ABCC3 和UGT1A1，抑制CYP7A1 的活性，表明這三類通路在調節膽汁酸平衡中起著至關重要的作用（見附錄A中的圖S8、S9）。代謝組學結合IPA 平臺分析，可以推斷茵陳蒿湯可通過調節膽汁酸的初級生物合成、血紅素降解和FXR/RXR途徑，阻止小鼠和人類黃疸病的發生發展。

3.5.茵陳蒿湯血中移行成分分析

數據導入Progenesis QI軟件進行預處理，通過主成分分析和有監督的OPLS-DA篩選變量（圖6）。一般模型組中不存在但給藥組中存在的變量被視為潛在的入血成分。結合先前茵陳蒿湯體外成分分析結果，在臨床受試者中共表征了26 種原型成分和三種代謝物，在模型小鼠中共表征了33種原型成分和三種代謝物（見附錄A中的表S14、S15）。

圖3.臨床受試者數據集2各組血液代謝物含量的變化圖。（a）健康受試者、黃疸患者和茵陳蒿湯治療患者三組之間生物標志物相對強度散點圖；（b）健康受試者、黃疸患者和茵陳蒿湯治療患者三組之間生物標志物相對強度熱圖。結果用xˉ±SD表示。*P<0.05和**P<0.01與健康受試者相比；#P<0.05和##P<0.01與黃疸患者相比。S1P：鞘氨醇-1-磷酸酯；PC：磷脂酰膽堿；TG：甘油三酯。

圖4.小鼠數據集2各組血液代謝物含量的變化圖。（a）對照組、模型組和茵陳蒿湯組三組之間生物標志物相對強度散點圖；（b）對照組、模型組和茵陳蒿湯組三組之間生物標志物相對強度熱圖。結果用xˉ±SD表示。*P<0.05和**P<0.01與對照相比；#P<0.05和##P<0.01與模型組相比。

3.6.網絡藥理學靶標分析

本部分整合網絡藥理學和血清藥物化學的方法，首先通過數據庫搜索入血成分作用靶標以及黃疸疾病相關靶標，兩者取交集，在小鼠和人類中鑒定出79個共同靶標。為了闡明茵陳蒿湯的潛在功能機制，構建了方劑-單味藥-化合物-靶點-黃疸病網絡，如圖7所示，詳細信息見附錄A 中的表S16、S17。進一步提取共同靶標用于GO 和KEGG富集分析，按照?lgP的降序排序以區分差異。使用在線繪圖網站Omishare 工具可以看到排名靠前的位置（見附錄A 中圖S10）。小鼠和臨床受試者GO 富集分析的結果顯示，主要定位在生物過程中，如對化學物質的反應、對化學刺激的細胞反應和對脂質的反應；細胞成分中細胞部分和細胞外區部分的?lgP評分和基因數量最高；分子功能分析中酶結合和蛋白質結合突出。根據KEGG途徑富集分析的氣泡圖，本研究發現排名靠前的主要代謝通路包括膽汁分泌、卟啉和葉綠素代謝以及初級膽汁酸生物合成。動物和臨床試驗結果可相互驗證。

3.7.整合分析

通過對基于血清藥物化學的網絡藥理學和血液代謝組學數據之間的交叉分析，推測卟啉和葉綠素代謝、膽汁分泌和初級膽汁酸生物合成可能是膽汁淤積性黃疸病的發病機制及茵陳蒿湯的作用機制。從人體和動物兩個維度，聚焦生物標志物和上游靶點，進而提取了兩類受試對象共同的核心靶點，包括ABCC2、ABCC3、UGT1A1、FXR 和CYP7A1。與核心靶標相關的活性成分包括京尼平苷、濱蒿內酯、異鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黃酸、綠原酸和山奈酚。與上述相關的膽紅素、膽綠素、膽紅素葡萄糖醛酸苷和?；悄懰岽x物可作為膽汁淤積性黃疸病核心生物標志物，由此構建了茵陳蒿湯的功能機制圖，如圖8 所示。以膽紅素、膽綠素、膽紅素葡萄糖醛酸苷和?；悄懰嵩趦鹊?種臨床關鍵代謝物為基礎模型進行內部驗證，從226 名受試者中隨機抽取60 名受試者進行PCA 分析。結果表明構建的模型可以有效區分健康受試者和黃疸患者整體代謝輪廓[見附錄A中的圖S11（a）]。此外，ROC分析顯示AUC值等于0.996，表明所選代謝物的模型可用作診斷黃疸病方法的有效補充[見附錄A中的圖S11（b）]。

3.8.靶標驗證

為了對預測靶標進行驗證，本研究采用了酶聯免疫吸附測定試劑盒對靶蛋白表達水平進行檢測。與健康對照組相比，黃疸患者血清中ABCC2、ABCC3、UGT1A1 和FXR 表達水平顯著降低，CYP7A1 表達水平顯著升高（P<0.01 或P<0.05）。給藥治療能回調相應靶蛋白的表達。因此可以推斷茵陳蒿湯可通過調節CYP7A1、ABCC2、ABCC3、UGT1A1 和FXR 的活性來促進膽汁分泌和抑制膽汁酸生物合成，達到治療黃疸病的效果。

圖5.臨床黃疸患者和黃疸模型小鼠相關代謝通路網絡圖。藍色框內代表的是黃疸小鼠主要代謝通路，包括脂質代謝（a）和膽汁酸代謝（b）。橙色框內代表黃疸患者主要代謝通路，包括脂質代謝（c）和膽汁酸代謝（d）。利用MetaboAnalyst 3.0軟件Pathway Analysis分析了存在于黃疸小鼠（e）和臨床黃疸患者（f）體內的代謝通路概況。方框內ID號代表本項研究中檢測到的代謝標志物的KEGG號，其中，紅框中的ID號代表差異表達的代謝物，其他框內的ID號代表在本項研究中未被檢測到的代謝物。箭頭上的符號代表KEGG提供的關鍵酶；紅色方框旁邊的箱型圖呈現了對照組（紅色）和黃疸組（綠色）之間的相對差異強度。LacCer：乳糖酶基（神經）鞘氨醇；CoA：輔酶A。

圖6.基于血清藥物化學方法建立的UPLC-MS色譜圖及其多變量分析輪廓圖。（a）小鼠茵陳蒿湯組和黃疸組的色譜圖；（b）小鼠茵陳蒿湯組和黃疸組之間的S-plot圖；（c）小鼠中已鑒定化合物15.55_283.0253在茵陳蒿湯組和黃疸組之間相對含量的趨勢圖；（d）小鼠茵陳蒿湯組和黃疸組之間的PCA得分圖；（e）臨床茵陳蒿湯組和黃疸組的色譜圖；（f）臨床茵陳蒿湯組和黃疸組之間的S-plot圖；（g）臨床樣本已鑒定化合物15.55_283.0253在茵陳蒿湯組和黃疸組之間相對含量的趨勢圖；（h）臨床茵陳蒿湯組和黃疸組之間PCA得分圖。P[1]：S-plot圖中的第一主成分；P(corr)[1]：S-plot圖中第一主成分的偏相關系數。

4.討論

膽汁淤積性黃疸患者肝細胞內的膽汁流阻滯，導致有毒膽汁酸積聚，從而加重黃疸癥狀。研究發現通過抑制膽汁生成、刺激膽汁分泌可改善肝細胞功能，減輕機體膽汁酸代謝紊亂[12-15]?；诖?，茵陳蒿湯可通過調節膽汁酸的生成和分泌來發揮治療作用。大量研究發現，茵陳蒿湯能明顯改善黃疸癥狀，相關黃疸生物標志物也有所回調。本課題組前期通過IPA軟件和PCMS代謝組學分析平臺挖掘出了茵陳蒿湯的潛在靶點和活性成分。然而，茵陳蒿湯治療膽汁淤積性黃疸的潛在機制尚未清楚闡明[16-17]，這些結果只是在相關動物模型中探究出來的，需要進一步結合臨床加以驗證。為此本文從臨床和動物兩個角度建立整合中藥血清藥物化學、網絡藥理學和代謝組學的研究策略對其進行探究。疾病的表型是機體內源性異常紊亂整體作用的結果，因而疾病表型的研究需要從系統水平上進行全面的多角度分析，進行深度數據挖掘，才能逐步被轉化為點對點的靶向驗證。

基于臨床和動物的多層次分析，本研究建立了一個茵陳蒿湯潛在功能機制的網絡圖（圖8）。有趣的是，通過對兩類研究對象的富集分析，推斷ABCC2、ABCC3、CYP7A1、UGT1A1 和FXR 可能是茵陳蒿湯的作用靶點，其生物活性成分可調節多條信號通路，從而在黃疸病的治療中表現出協同增效的作用。這些發現闡明了茵陳蒿湯治療膽汁淤積性黃疸的新的分子機制。此外，從代謝組學角度，對這兩類受試對象進行多步實驗進行了系統驗證，發現膽紅素、膽綠素和?；悄懰峥勺鳛樵\斷膽汁淤積性黃疸病理變化的新型潛在生物標志物。?；悄懰崾悄懼置诘闹匾盘柗肿?，被認為是膽汁淤積性黃疸期間膽汁酸排泄異常的臨床診斷指標，同時具有免疫調節和抗炎作用[18]。在這些鑒定的生物標志物中膽紅素和膽綠素也在臨床黃疸診斷中發揮重要作用[19]。膽紅素是膽綠素通過膽綠素還原酶合成的代謝產物，在膽汁淤積性黃疸期間，膽汁酸的積累導致線粒體功能障礙和膽紅素葡萄糖醛酸化阻滯，會刺激膽綠素轉化為膽紅素，以發揮抗氧化和細胞保護作用[20]。幾項研究表明，與黃疸疾病相關的代謝物，包括犬尿烯酸和D-葡萄糖醛酸在動物血清和尿液中均被檢測到異常表達[14,21]。當前研究明確了膽紅素、?；悄懰?、膽紅素葡萄糖醛酸苷和膽綠素在預測和診斷臨床黃疸疾病的作用。當然其他相關代謝物包括L-同型半胱氨酸、膽酸、溶血磷脂酰膽堿[18∶1(9Z)]和溶血磷脂酰膽堿[16∶1(9Z)]在人和小鼠之間存在差異，這可能歸因于物種之間的內在差異。

圖7.茵陳蒿湯入血成分和黃疸病共同作用靶標網絡圖。（a）小鼠黃疸病和入血成分的特有和共同靶標。網絡圖呈現36個茵陳蒿湯入血成分（橘色），以及與茵陳蒿湯（紅色）關聯的三種單味藥（淺藍色）和與膽汁淤積性黃疸（紅色）相關的323個特有靶標（藍色），兩者有79個共同靶標（綠色）。（b）臨床黃疸病和入血成分的特有和共同靶標。網絡圖呈現29個茵陳蒿湯入血成分（橘色），以及與茵陳蒿湯（紅色）關聯的三種單味藥（淺藍色）和與膽汁淤積性黃疸（紅色）相關的323個特有靶標（藍色），兩者有79個共同靶標（綠色）。

圖8.整合代謝組學、血清藥物化學和網絡藥理學的研究策略，發現茵陳蒿湯潛在靶標和活性化合物。（a）茵陳蒿湯治療黃疸病的功能機制圖；（b）新穎的靶標和潛在活性化合物之間的靶向關系。

整合中藥血清藥物化學、網絡藥理學和代謝組學研究，不僅進一步驗證了茵陳蒿湯的療效，而且有助于更好地挖掘其功能機制?；诖?，本研究通過實驗發現了一種新的代謝機制參與茵陳蒿湯的治療。臨床黃疸受試者和黃疸小鼠鑒定的代謝物均顯示膽汁酸和脂質代謝紊亂，這與膽汁酸生物合成和膽汁分泌失調有關。實驗結果顯示黃疸患者或黃疸小鼠膽汁酸水平高于對照組，說明膽汁酸生物合成和膽汁分泌異常與膽汁淤積性黃疸密切相關。大量研究表明，抑制膽汁酸合成，促進膽汁分泌有利于改善膽汁淤積性黃疸病的癥狀[22]。網絡藥理學進一步證明，茵陳蒿湯參與調節膽汁酸的分泌和合成，涉及的作用靶標包括ABCC2、ABCC3和CYP7A1。多藥耐藥相關蛋白（MRP）家族，屬于三磷酸腺苷結合盒轉運體（ABC）的一類有機陰離子轉運體超家族，包括ABCC2、ABCC3等，負責葡萄糖醛酸苷的轉運[23-24]。ABCC2 又稱多藥耐藥相關蛋白2（MRP2），參與肝細胞內膽紅素、膽汁酸硫酸鹽等多種兩親性陰離子的分泌，以維持膽汁酸穩態，在膽汁分泌中起著舉足輕重的作用[25]。CYP7A1 是膽汁酸生物合成經典途徑中的限速酶，具有調節膽固醇穩態和膽汁酸合成的功能。與大量黃疸模型實驗結果一致，與對照組相比，黃疸組ABCC2 的表達水平顯著降低，CYP7A1 的表達水平顯著升高，茵陳蒿湯治療后有所回調，這一結果在本實驗的動物和臨床數據中得到進一步支持[26]。由于ABCC2 的激活，二價膽鹽在膽管側膜細胞的分泌能力增強，這可以解釋為什么茵陳蒿湯組血清膽汁酸水平下調。ABCC3 通常不在正常肝細胞膜中表達，一旦發生膽汁淤積，肝細胞基底膜中ABCC3的表達水平明顯升高。此外，由于ABCC3轉運底物與ABCC2轉運底物具有廣泛的同源性，一般認為ABCC3的高表達水平可補償ABCC2，以減輕膽汁淤積性黃疸期間膽堿誘導的肝毒性損傷[27]。這進一步說明了ABCC3在保護膽汁淤積性黃疸中的重要作用，正如本研究從不同組間ABCC3 蛋白表達水平的比較中所證實的那樣。

由于膽汁生成、分泌和排泄障礙導致膽汁酸量積聚，形成肝內膽汁淤積。相應地，膽汁流不能正常輸送到十二指腸，而流回血液，增加了血液中膽汁酸的水平。膽汁酸含量過高會激活FXR，直接降低CYP7Al活性，從而抑制膽汁酸生物合成[28-29]。FXR 是激素核受體超家族的一員，通過誘導特殊靶基因的表達，在膽汁酸的合成、轉運和分泌中發揮關鍵作用。激活FXR 能抑制膽汁酸生物合成，并促進膽汁酸分泌到膽管，從而保護肝細胞免受膽汁酸的損傷[30-31]。當前實驗結果證實茵陳蒿湯可通過激活FXR 來協同調節CYP7A1 活性，從而改善膽汁淤積性黃疸的癥狀并恢復膽汁酸紊亂。到目前為止，眾多的證據表明膽汁酸的改變可以激活或抑制FXR 來調節CYP7A1活性[32-33]。此外，與黃疸組相比，在茵陳蒿湯治療后的黃疸受試者中觀察到了CYP7A1 下調和FXR 上調的相反變化，說明兩者之間存在一定的關聯。

黃疸病內源性病理機制復雜，本研究發現茵陳蒿湯通過調節卟啉和葉綠素代謝，可減輕小鼠和人類黃疸的嚴重程度（因為膽汁淤積性黃疸病的病理變化主要是由膽紅素功能障礙引起的）。進一步分析發現，茵陳蒿湯同時調節卟啉和葉綠素代謝中的膽紅素、膽綠素和膽紅素葡萄糖醛酸苷表達。UGT1A1 作為卟啉和葉綠素代謝的關鍵限速酶，能促進肝臟中膽紅素葡萄糖醛酸苷的形成以及ABCC2或ABBC3介導的膽汁分泌[34-35]。從這個角度來看，UGT1A1 和ABC 轉運蛋白在肝臟膽紅素代謝異常的功能調節中發揮核心作用。抑制UGT1A1可以阻止膽紅素和葡萄糖醛酸的結合，從而導致膽紅素水平升高。靶向卟啉和葉綠素代謝的藥物將阻斷它們的過表達，可作為治療黃疸病的候選藥物[36]，因此UGT1A1可能成為發現黃疸藥物的有效靶點。茵陳蒿湯治療后顯著增加UGT1A1的活性，促進膽紅素的下調和膽紅素葡萄糖醛酸苷的上調，同時，ABCC2或ABCC3介導的膽紅素葡萄糖醛酸苷分泌的改善對于黃疸病癥狀的緩解也至關重要。

總之，茵陳蒿湯通過增強FXR、UGT1A1、ABCC2和ABCC3 的活性以及抑制CYP7A1 的活性來發揮治療膽汁淤積性黃疸的作用。當然需要進一步研究去評價茵陳蒿湯的活性成分，包括京尼平苷、濱蒿內酯、異鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黃酸、綠原酸和山奈酚在核心代謝通路上發揮的作用。其中京尼平苷和濱蒿內酯治療黃疸相關疾病的有效性已經得到了驗證[37-39]。該研究對于開展中藥方劑體內活性小分子的發現及其治療靶點的研究具有重要參考價值。

5.結論

本研究建立了一種新穎的用于發現茵陳蒿湯的潛在靶點和活性小分子的研究策略，并有效解析了人類和小鼠膽汁淤積性相關黃疸病的代謝紊亂規律。值得注意的是，本研究發現茵陳蒿湯8 個關鍵成分可以靶向調控核心靶標CYP7A1、ABCC2、ABCC3、UGT1A1 和FXR，參與調節膽汁酸的初級生物合成、卟啉和葉綠素代謝以及膽汁分泌代謝途徑。該策略為有效發現中藥的活性化合物和治療靶點提供方法學支撐。

致謝

本文獲得國家自然科學基金重點項目（81430093、81830110、81861168037）和黑龍江頭雁創新團隊項目資助。

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Hui Xiong, Ai-Hua Zhang, Ya-Jing Guo, Xiao-Hang Zhou, Hui Sun, Le Yang, Heng Fang, Guang-Li Yan, and Xi-Jun Wang declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A.Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.12.016.