大鼠體內外細胞色素P450酶活性檢測方法的建立及應用

夏麗軍 陳偉東 劉進

[摘要] 目的 建立快速、簡便、靈敏可以同時測定大鼠體內外“雞尾酒”探針藥物和代謝產物的LC-MS/MS方法，并用于大鼠肝微粒體外代謝和大鼠體內的藥代動力學研究。 方法 所有樣品均加入乙腈進行沉淀處理，然后在UPLC CORTECS C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）色譜柱分離，質譜方法采用多反應監測模式（MRM）。液相方法采用梯度洗脫流動相乙腈-0.1%甲酸水。 結果 6種探針藥和代謝產物的體內外樣品方法學驗證符合生物樣品檢測要求。該方法成功應用于大鼠體內外“雞尾酒”實驗中。 結論 本實驗建立的“雞尾酒”方法可用于體內外快速評價藥物或中草藥對相應的CYP450亞型酶活性的影響，可以用于潛在的藥物相互作用的預測。

[關鍵詞] 細胞色素P450;大鼠肝微粒體;探針藥;UPLC-MS/MS

[Abstract] Objective To establish a rapid， simple and sensitive LC-MS/MS method for simultaneous determination of "cocktail" probe drugs and metabolites in vivo and in vitro of rats， and to apply it to studies of in vitro metabolism of rats′ liver microsomes and in vivo pharmacokinetics of rats. Methods Both in vivo and in vitro samples were treated by acetonitrile precipitation method. Probe drugs and metabolites were detected by UPLC CORTECS C18 （2.1 mm×50 mm， 1.6 μm） chromatographic column combined with UPLC-MS/MS method of multiple reaction monitoring mode（MRM）， in which acetonitrile-0.1% formic acid water was used as gradient elution method of mobile phase. Results Methodological verification of samples in vitro and in vivo of 6 probe drugs and metabolites met the requirements of biological sample detection. The method had been successfully applied to "cocktail" experiments in vivo and in vitro of rats. Conclusion The "cocktail" method established in this experiment could be used to rapidly evaluate the efficacies of drugs or Chinese herbal medicines on the activities of the corresponding CYP450 subtypes enzymes in vivo and in vitro and could be used to predict potential drug interactions.

[Key words] Cytochrome P450; Rat liver microsomes; Probe drugs; UPLC-MS/MS

細胞色素P450酶（Cytochrome P450 proteins，CYP）是體內I相代謝的主要代謝酶超家族，大約能代謝超過90%的藥物和內源性物質[1-2]，其中，經CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9，CYP2E1和CYP3A4代謝的藥物占所有經CYP代謝藥物的80%以上[3-5]。藥物、食物和中草藥等可通過抑制或誘導藥物代謝酶來改變其他藥物的代謝和藥代動力學特性，從而導致藥物之間相互作用。其中，對CYP酶的抑制作用會增加藥物不良反應的風險或降低所需的治療效果。研究者通常使用體外P450酶抑制試驗來研究經P450代謝的藥物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）或中草藥藥物相互作用（Herb-drug interaction，HDI）的可能機制。目前研究者已開發了幾種混合使用P450探針底物的混合物進行肝微粒體溫育的雞尾酒方法，可以高通量地檢測經P450酶代謝藥物相互作用的預測，但是，目前大多數文獻都是單一的體內或體外“雞尾酒”方法[6-9]，本實驗將體內和體外“雞尾酒”方法相結合，采用UPLC-MS/MS檢測方法，為預測藥物相互作用提供較全面的數據，可以用于潛在的藥物相互作用的預測。

1 材料與方法

1.1 材料來源

非那西?。≒h，批號：ILTFG-PD）和安非他酮（Bu，批號：31677-93-7）購于Tokyo Chemical Industry公司，右美沙芬（Dex，批號：D299445）、甲苯磺丁脲（Tol，批號：64-77-7）和氯唑沙宗（Chl，批號：95-25-0）購于J&K Scientific，咪達唑侖（Mdz，批號：20180207）產自江蘇恩華藥業，羥基安非他酮（OH-Bu，批號：92264-81-8） 購自加拿大TLC Pharmaceutical Standards Ltd.，羥基咪達唑侖（OH-Mdz，批號：59468-85-8）、右啡烷（Dep，批號：125-73-5）、羥基甲苯磺丁脲（OH-Tol，批號：5719-85-7）、羥基氯唑沙宗（OH-Chl，批號：475295-90-0）和對乙酰氨基酚（Ac，批號：103-90-2）購于Toronto Research Chemicals公司;色譜級甲醇、乙腈購自德國Merck公司。色譜級甲酸購自阿拉丁生化試劑公司。實驗用水為娃哈哈純凈水。大鼠肝微粒由本實驗室制備。

1.2 儀器

ACQUITY I-Class 超高效液相串聯XEVO TQD三重四級桿質譜和Masslynx 4.1軟件（美國Weters公司）;5430R低溫高速離心機（美國Eppendorf公司）;TE4101-L電子天平（北京賽多利斯儀器公司）;電熱恒溫振蕩水槽（上海森性實驗儀器有限公司）。

1.3 對照品儲備液配制

精密稱取10 mg各探針藥，然后加入10 mL甲醇，配成1 mg/mL儲備液;精密稱取1 mg各代謝產物，然后加入10 mL甲醇，配成0.1 mg/mL儲備液并避光后于4℃保存。

1.4 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CORTECS C18 column（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）;流動相為A相乙腈，B相0.1%甲酸-水，梯度洗脫流程為：0.0～0.6 min，10%～50%A;0.6～1.0 min，50%～80%A;1～2 min，80%～95%A;2.0～2.5 min，95%A;2.5～2.6 min，95%～10%A;2.6～3.0 min，10%A。流速為0.4 mL/min，柱溫保持在40℃，樣品進樣量為2 μL。

1.5 質譜條件

離子源采用ESI源并采用多離子監測模式檢測，同時采用正離子掃描模式和負離子掃描模式。其中毛細管電壓為2000 V，脫溶劑氣溫度和流量分別為500℃和1000 L/Hr，錐孔氣流量50 L/Hr，離子源溫度為150℃。各探針藥及其代謝產物的離子對相關質譜參數信息見表1。

1.6 樣本處理

1.6.1 血漿樣本處理? 精密量取100 μL血漿樣品置于1.5 mL EP管中，加入20 μL 內標地西泮（0.5 μg/mL）和200 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋1 min后在13 000 r/s離心5 min，取上清進樣。

1.6.2 孵育樣品處理? 精密量取200 μL孵育液置于1.5 mL EP管中，加入200 μL冰乙腈和20 μL內標地西泮（0.5 μg/mL）沉淀蛋白，渦旋1 min后在13 000 rpm離心5 min，取上清進樣。

1.7 方法學驗證

按照FDA[10]和EMA[11]標準，取空白基質、空白基質+對照品和檢測樣品進行專屬性考察;各探針藥及其代謝產物取合適濃度的多個點建立標準曲線;各探針藥及其代謝產物各取低、中、高3個濃度質控樣品（Quality control，QC），每個濃度5個樣品，連續分析3 d考察精密度和準確度;取正常處理的QC，空白基質預處理的QC和甲醇稀釋處理的QC考察回收率和基質效應;QC樣本在室溫24 h、4℃、反復凍融3次和-80℃等不同保存條件下考察穩定性。

2 結果

2.1 分析方法專屬性

取空白基質、空白基質+對照品、大鼠口服探針藥后0.5 h的血漿和孵育后的孵育液按“1.6樣本處理”處理，見圖1?？芍魈结標幖捌浯x產物峰型良好，無內源性物質干擾。

2.2 標準曲線的繪制

精密吸取各對照品儲備液并用甲醇稀釋，將Ph、Tol和Chl稀釋為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00和20.00 μg/mL;將Mdz、Dex和Bu稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 μg/mL;將OH-Chl、OH-Mdz和OH-Tol稀釋為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μM;將Dep、OH-Bu和AC稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μM;用空白基質將上述梯度對照品稀釋10倍，按“1.6樣本處理”處理并進樣，用Masslynx 4.1軟件導出標準曲線。見表2。各標曲線性良好，R2均>0.990。

2.3 精密度和準確度

取空白基質，按照“1.7方法學驗證”項方法分別加入探針藥和代謝產物配成最小定量下限濃度（Lower limit of quantification，LLOQ） 和低、中、高3個濃度QC，Ph、Tol、Chl濃度為2、4、40、1600 ng/mL;Mdz、Bu、Dex濃度為1、3、30、150 ng/mL;OH-Chl、OH-Mdz、OH-Tol濃度為0.05、0.15、1.50、4.50 μM;Dep、OH-Bu、Ac濃度為0.01、0.03、0.30、0.90 μM;對同一濃度進行5個樣本分析，連續檢測3 d，計算日內、日間精密度和日內、日間準確度，結果表明，LLOQ的精密度和準確度均在20%以內，3個QC的精密度和準確度均在15%以內，符合樣品分析要求。

2.4 提取回收率和基質效應

取空白基質，按照“1.7方法學驗證”方法，制備LLOQ和3個不同濃度QC，同一濃度進行5個樣品分析，得相應的峰面積平均值A1;取空白基質，按照“1.6樣本處理”方法處理，取上清，加入相應濃度探針藥和代謝產物對照品，配成LLOQ和3個不同濃度QC，同一濃度進行5個樣品分析，得相應的峰面積平均值A2，提取回收率為A1/A2。用甲醇按照“1.7方法學驗證”方法，制備LLOQ和3個不同濃度QC，同一濃度進行5個樣品分析，得相應的峰面積平均值A3，基質效應為A2/A3，結果表明，各探針藥及其代謝產物QC的LLOQ提取回收率和3個不同濃度QC的提取回收率均>85%，基質效應均為85%～115%，符合分析要求。

2.5 穩定性考察

取空白基質按“1.7方法學驗證”方法，制備LLOQ和3個不同濃度QC，考察樣品置于室溫24 h和4℃放置6 h，連續凍融3次，-80℃保存2周;每個濃度進行平行5個樣品分析，結果RSD和RE結果均在±15%之間，化合物在上述不同條件下均穩定，滿足分析要求。

2.6 大鼠體內藥動學應用

Sprague-Dawley（SD）大鼠6只，動物許可證號：wydw2019-650，體重為（220±20）g，禁食12 h后開始實驗，灌胃給予6種混合探針藥溶液，其中Tol的劑量為1 mg/kg，其余為10 mg/kg。給藥后0.083、0.250、0.500、1、2、3、4、6、8、12和24 h分別通過大鼠尾靜脈采血0.3 mL并置于肝素化EP管中。接著將樣品于4000 rpm離心10 min后吸取上清至新的EP管中，并取100 μL血漿按“1.6樣本處理”項方法處理后進行UPLC-MS/MS分析。各探針藥的藥動學參數和藥時曲線見表3、圖3。

2.7 體外混合探針孵育應用

在正式實驗前進行以下的孵育條件的優化：包含大鼠肝微粒體積的優化（2～10 μL）;體外孵育緩沖液的優化（0.1 M的磷酸鉀緩沖液，0.01 M的PBS 緩沖液和0.1 M Tris-HCl 緩沖液，pH均為7.4）;分別在10～100 min時間內進行孵育優化。最終確定孵育體系總體積為200 μL，其中包含大鼠肝微粒體（蛋白質濃度為0.4 mg/mL），磷酸鉀緩沖溶液（100 mM，pH=7.4），6種探針底物（Ph為40 μM，Bu和Chl為20 μM，Dex為10 μM，Tol為100 μM，Mdz為5 μM）。在37℃的水浴下預孵育5 min 后加入1 mM NADPH（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）啟動反應，孵育30 min。探針藥Ph、Bu、Tol、Dex、Chl、Mdz的反應速率分別為0.0438、0.0037、0.0284、0.0414、0.0628、0.0682 pmol/（min·μg）。

3 討論

3.1 探針藥的選擇

在所有CYP亞型中，CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6含量較高，分別占CYP總量的40%、20%、13%、10%、2%和2%，并可以代謝大多數臨床處方藥[12-15]。其中CYP1A2參與多種臨床使用藥物的代謝，如氯氮平、他克林、替扎尼定、茶堿以及幾種重要的內源性化合物[16-17]。CYP2B6代謝3%～8%的廣泛使用藥物，且據報道在乳腺腫瘤中也有高表達[18-19]。CYP2C9不僅有助于代謝10%～20%的常用處方藥，還有脂肪酸、前列腺素類和類固醇激素的代謝[13]。在肝臟和肝外器官中表達的CYP2D6介導大約25%的市售藥物代謝，如抗抑郁和抗精神病藥物[20]。同時，活動減少的CYP2D6與高加索人群中的帕金森病有關[20]。CYP2E1作為天然乙醇誘導酶代謝活化各種致癌物質，其活性增加與致癌過程有關[21]。此外，超過50%的藥物被CYP3A4代謝，包括抗生素、抗病毒藥物、苯二氮■類藥物、鈣通道阻滯劑、他汀類藥物和免疫抑制藥物[22-23]。

“雞尾酒”結合LC-MS/MS是現在使用最多、最廣的預測藥物相互作用的方法，每一種亞型酶均有多種探針藥，但是，許多探針藥并不是經單一酶代謝，存在特異性不強的現象，根據FDA藥物相互作用的指南[24]，本實驗選取專屬性較好的Ph（CYP1A2）、Bu（CYP2B6）、Tol（CYP2C9）、Dex（CYP2D6）、Chl（CYP2E1）和Mdz（CYP3A4）作為“雞尾酒”的探針藥，在大鼠體內、體外實驗中均體現出較強的適宜性。

非那西汀的O-去乙基化是使用雞尾酒法進行體外CYP1A2活性評估的最常用反應，也是首選探針，非那西汀低于50 μM時，對其他探針藥代謝基本無影響[25]，本實驗中，非那西汀濃度為40 μM。安非他酮是CYP2B6的首選探針藥，在多種“雞尾酒”方法中均有應用，安非他酮低于100 μM時對CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1活性無影響，高于50 μM時，對CYP 2C19、CYP2D6、CYP3A產生影響[26]，本實驗根據安非他酮的Km值，確定安非他酮的濃度為20 μM。雙氯酚酸和甲苯磺丁脲均可作為CYP2C9的探針藥，在其他“雞尾酒”方法出現的次數基本相似[27]，本實驗選取甲苯磺丁脲作為CYP2C9的探針藥，濃度為100 μM。作為CYP2D6的探針藥，丁呋洛爾和右美沙芬使用較廣，但丁呋洛爾除主要經CYP2D6代謝外，還經CYP 1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19代謝，右美沙芬較丁呋洛爾專屬性更高，右美沙芬濃度低于25 μM時對其他探針藥無影響[28]，本實驗中，右美沙芬濃度為10 μM。對于CYP2E1的探針藥，氯唑沙宗幾乎是唯一的選擇，雖然苯胺是氯唑沙宗的推薦替代方法，但基本很少用于體外雞尾酒;氯唑沙宗濃度低于50 μM時對其他亞型酶基本無影響，本實驗氯唑沙宗濃度為20 μM。CYP3A4作為肝微粒中含量最多的酶，較常見的探針藥有咪達唑侖、睪酮、硝苯地平，其中以咪達唑侖最為常用[29-30]，本實驗亦選擇咪達唑侖作為CYP3A4探針藥，濃度為5 μM。

3.2方法優化

本實驗采用UPLC-MS/MS方法同時檢測6種探針藥和6種代謝產物，為了獲取較好的峰型、較短的檢測時間及較方便的處理方法，比較了UPLC BEH C18、UPLC CORTECS C18和UPLC HSS T3三種色譜柱，其參數分別為（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）和（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;乙酸乙酯液液萃取和乙腈沉淀法前處理;甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動相，最終選擇色譜柱UPLC CORTECS C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm），其可以使峰型良好。同時選擇響應較高的乙腈-0.1%甲酸水作為流動相，乙腈沉淀法處理樣品，完全能滿足本實驗探針藥及其代謝產物的檢測。

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（收稿日期：2020-03-25）