植物生物刺激劑對茶樹重要酶系統和生化成份的調節

李榮林 艾仄宜 楊亦揚 李 歡 穆 兵 陳正濤 史海華 楊建華 吳 威

(1.江蘇省農業科學院休閑農業研究所，南京 210014；2.溧陽玉蓮生態農業發展有限公司，溧陽 213333； 3.蘇州新豐現代農業園，215111)

茶樹以嫩梢為主要收獲對象，嫩梢早發，多發，持嫩期長，節間短，茶多酚含量適宜，酯型兒茶素相對較多，氨基酸含量較高是大多數茶類對鮮葉品質的一般要求; 光合效率高、抗逆能力強是茶樹生長良好的重要參考指標。對茶樹危害嚴重的病、蟲有數十種之多，為避免化學農藥過量使用造成的不良后果，發展綜合防治技術提高茶樹自身抗病蟲能力尤為必要，近年來茶樹化學生態學研究受到重視[1]。然而通常情況下由于品種本身的局限以及環境因素的影響，植物的生長性能和抗逆能力很難達到理想狀態，因此使用適當的手段調節和刺激植物的生長發育，調節植物代謝過程成為作物學和作物生理研究的重要方向之一[2]。

使用植物生長調節物質調控茶樹的生長很早就有實踐，相關研究也從未間斷[3-5]，近年使用植物生長刺激素直接調控鮮葉品質，調控茶樹光合能力、抗旱能力、抗蟲能力，以及促進茶樹扦插短穗發根和生長的研究依然受到關注。例如魏吉鵬、韓文炎等研究認為施用外源水楊酸甲酯有利于緩解茶樹高溫脅迫，增強茶樹光合能力[6]。桂連友、苗進研究了茉莉酸甲酯誘導茶樹防御茶尺蠖和茶小綠葉蟬的效果及機制[7-8]，孫曉玲等研究指出茉莉酸甲酯誘導可增加茶樹揮發物的種類[9]，任恒澤等認為適當以生根劑處理有利于促進茶樹扦插短穗生根和發芽[10]，施江、林智等研究發現茉莉酸甲酯處理后的茶樹所得鮮葉制成的紅茶和烏龍茶品質更優[11]。

在茶樹上使用的植物生物刺激劑的類別，過去局限于傳統的植物激素[3-5]，近來對水楊酸和茉莉酸關注較多[9-11]。植物生物刺激劑早期確實只包含常見的植物激素，目前概念也沒有完全統一，但傾向于將植物生長促進劑、生長調節劑、抗性誘導劑、土壤改良劑等一切具有某種調節植物體內生理過程能力的制劑(包括微生物)都稱作植物生物刺激劑[12-13]，簡單地說植物生物刺激劑(Plant biostimulants)是指用于植物并可以提高植物營養效率、增強植物應對生物或非生物脅迫的能力或改善作物品質性狀的任何化學物質或微生物。從這個理念出發我們認為無論是為了直接促進新梢生長以提高茶葉產量和品質，還是出于生態平衡和食品安全考慮去增強茶樹的抗病蟲能力，那些具有調節植物生長發育潛力的物質如氨基多糖、超敏蛋白、β-氨基丁酸、龍膽酸等，或是具有刺激茶樹生成更多的綠葉揮發物而其本身是茶樹揮發物的一部分的物質如青葉醇(順-3-己烯醇)、芳樟醇(里那醇)、橙花叔醇、法尼烯等[14-17]，它們對茶樹或其它植物生理生化的多重影響也值得深入研究。

已知水楊酸、茉莉酸對多種植物具有生理活性，羅漢果上施用茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)有利于果實中羅漢果苷和羅漢果醇的積累[18]，水楊酸通過誘導PPO， POD活性升高可使番茄等多種植物抗蟲能力提高[19]。甲殼素由天然幾丁質(chitin)經過脫乙酰作用而得，不僅具有廣泛的生物活性，而且具有生物相容性、血液相容性、微生物易降解性等優良性能，安全性非常高[20-21]。超敏蛋白源于微生物發酵，生物安全性、環境安全性良好，對多種植物病毒病具有很好的誘抗效果[22]。β-氨基丁酸也是一種環境友好的植物免疫誘導劑，可誘導植物抗蟲和抗病[23-24]，蕓苔素更是普遍認可的植物生長調節劑，具有促進植物生長，增強植物對生物和非生物脅迫防御能力等優良性能[25]。上述物質在茶樹上雖有應用，但它們對茶樹生理調節的綜合能力及其相互之間的比較研究不多。本試驗選擇水楊酸、茉莉酸甲酯、超敏蛋白、β-氨基丁酸、甲殼素、蕓苔素進行探討。

1 材料與方法

1.1 設備

Eppendorf 5702離心機(德國Eppendorf儀器有限公司)， 液相色譜串聯質譜分析儀：Angilent 1290 UPLC色譜系統， ABsciex 4500質譜檢測器(美國安捷倫儀器有限公司)。TSQ 8000 EVO氣相色譜串聯質譜分析儀(美國熱電儀器有限公司)， 島津2020紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限公司)。

1.2 供試茶樹

龍井43號，3年生，盆栽(花盆口徑33 cm， 高30 cm)，室外自然生長，定期澆水、施肥。

1.3 植物生物刺激劑

氨基丁酸、水楊酸、茉莉酸、甲殼素購于上海Marktin生化制劑有限公司，超敏蛋白購于湖南農大哥科技開發有限公司，蕓苔素購于四川蘭月科技有限公司。

蕓苔素使用濃度為10 mg/L， 其余物質使用濃度為200 mg/L(均以有效成分含量計算)，每種制劑溶液使用量200 mL， 溶液中含1%乙醇，于4月初均勻噴灑于6株茶苗上，對照噴施1%乙醇溶液。24 h后采集1芽2-3葉，樣品立即投入液氮中，然后在-80 ℃保存，供測試用。

1.4 酶活性測定

以文獻[ 26-27]方法為基礎，稍加調整。

1.4.1酶提取 取約1.0 g樣品放入25 mL離心管中，加1g交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，預冷的磷酸緩沖液(PBS)10 mL(多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)提取時用pH 6.5的PBS，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和過氧化氫酶(CAT)提取時用pH 7.8的PBS)，用勻漿器勻漿，然后4 ℃，6000 g離心15 min，上清液即為所需酶液。

1.4.2多酚氧化酶活性測定 用鄰苯二酚比色法，酶活力定義為每克樣品吸光度每分鐘增加0.1為1個酶活力單位。

1.4.3過氧化物酶活性測定 用愈創木酚比色法，酶活力定義為每克樣品吸光度每分鐘增加0.1為1個酶活力單位。

1.4.4苯丙氨酸解氨酶活性測定 用290 nm紫外法，每克樣品吸光度每分鐘增加0.01為1個酶活力單位。

1.4.5過氧化氫酶活性測定 用240 nm紫外法， 以每克樣品每分鐘內吸光度減少0.1為1個酶活單位。

1.4.6超氧化物歧化酶活性測定[27]用鄰苯三酚自氧化法，30s讀數1次，以初始反應的自氧化速率代表酶活性，定義0-3 min內反應產物在420 nm的吸光度每1分鐘的增加值為1個酶活單位。

1.4.7兒茶素組成測定 樣品勻漿，甲醇(含0.1%甲酸，V/V)提取，固液比1∶10，按國標方法(GB/T 8313)進行分析。

1.4.8氨基酸組成測定[28]樣品勻漿，甲醇(含0.1%甲酸，V/V)提取，固液比1∶10，用質譜法測定。Waters T3 色譜柱，A相 0.1%甲酸；B相 乙腈(含0.1%甲酸)；柱溫40 ℃；進樣量1 μL；流速0.3 mL/min，梯度如下：0-3 min 1% B；3-6 min 1%-4% B；6-7.5 min 4%-90% B；7.5-9.3 min 90% B；9.3-9.4 min 90% B-1% B； 9.4-12 min 1% B。質譜檢測條件: 離子化模式ESI+，檢測方式：多反應檢測(MRM)，Curtain Gas:35；Ionspray Voltage:5500；Temperature:450 ℃；Ion Source Gas1:40 ℃；Ion Source Gas2:40 ℃。

1.4.9揮發物分析[29- 30]新鮮葉片液氮磨細，取約2.5 g樣品置于20 mL固相萃取瓶內(不加水或溶劑)，插入吸附頭(ACAR/PDMS/DVB，預先在250 ℃老化1 h)60 ℃萃取1 h， GC-MS分析。氣相色譜條件：色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；載氣為高純氦氣(純度99.999%)；載氣流速為1.2 mL/min；采用不分流進樣；進樣口溫度為250 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min升到100 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升到160 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升到280 ℃，保持1 min。質譜條件：離子源為EI源，傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：300 ℃；電子能量：70 eV；掃描范圍(m/z)：33-800 amu，采用全掃描采集模式。

檢索譜庫NIST11。

1.5 統計分析軟件

SPSS22，EXCEL2013。

2 結果與分析

2.1 酶活性分析

每一種物質處理都能引起1-2種酶活性的明顯上升，超敏蛋白引起SOD活性顯著上升，PPO、POD酶活性下降明顯，PAL活性也有下降，但不明顯。水楊酸甲酯誘導了除PAL以外的其它4種酶活性的顯著上升，水楊酸甲酯、甲殼素處理引起PPO、SOD活性的上升較明顯，茉莉酸甲酯處理SOD活性極顯著上升，水楊酸甲酯、茉莉酸甲酯、蕓苔素處理引起POD活性上升，水楊酸甲酯、蕓苔素、氨基丁酸處理引起CAT活性增強。

2.2 氨基酸組成分析

茉莉酸酯、水楊酸處理新梢氨基酸總量提高29.18%-33.61%，甲殼素處理后氨基酸總量下降5.72%，而氨基丁酸處理的總氨基酸減少了51.28%。對個別氨基酸而言，蕓苔素處理下有多種氨基酸含量略有下降，但茶氨酸上升較多，因此氨基酸總量上升，β-氨基丁酸處理的樣品精氨酸增加了42.78%。而在超敏蛋白處理下茶氨酸含量下降較多，但其他氨基酸大部分有所上升，因此氨基酸總量也趨于上升。

表1 植物生物刺激劑處理下的茶樹新梢酶活性變化(U)

表2 植物生物刺激劑處理與新梢氨基酸組成變化(mg/100 g鮮重)

2.3 兒茶素組成分析

所有處理都使兒茶素總量上升，除蕓苔素處理增加13.88%，其余增加了46.23%～114.6%，其中非酯型兒茶素總量增長幅度22.87%-143.4%，酯型兒茶素總量增加幅度為13.87%-114.6%，增幅最高的是EGCG，水楊酸甲酯和超敏蛋白處理分別增加101.0%-107.2%，茉莉酸甲酯處理的EGCG增加了92.45%，甲殼素處理增加了64.96%， β-氨基丁酸處理增加了45.66%，只有蕓苔素處理EGCG增加4.52%。

表中峰面積數據是將樣品質量歸一化，按1g計算所得。本試驗條件下茉莉酸處理后揮發物總量與對照相比微有增加(+2.11%)，水楊酸處理總量減少22.72%，其它處理減少3.79%-13.43%。以單一組分而言，青葉醇及其酯類(2-Hexen-1-ol，4-Hexen-1-ol， acetate)、青葉醛(2-Hexenal)是增加的或基本不變，所有處理己烯己酸酯(4-Hexen-1-ol， acetate)總量都增加，處理后的含量是對照的2-3倍。

表3 植物生物刺激劑處理的新梢兒茶素組成變化(鮮重%)

大多數揮發性組分在處理后它在揮發物總量中所占比例變化較小，也有少數變幅較大。(Z)-4-Hexen-1-ol， acetate在對照組里占總量的比為3.714%，在蕓苔素處理組占總量7.708%， 而在其它各組中該物質在揮發物總量中所占比例為9.509%-11.65%。又如， (Z)-2，6-Octadien-1-ol， 3，7-dimethyl-(nerolidol橙花叔醇)是茶樹揮發物中占比最高的物質，在對照組占總量的35.94%，然而各處理組該成份所占比例為22.34%-27.60%，平均25.03%，雖然與對照相比變異較大，而在各處理之間差異較小。1，6-Octadien-3-ol， 3，7-dimethyl-(linalool 芳樟醇)是揮發性組分中所占比例僅次于nerolidol的成分，在對照中占總量18.42%，在各處理組中占比19.34%-21.19%，不僅與對照相比變化較小，各處理之間變異也很小。也有一些物質像 cyclopropanecarboxyllic acid， tridec-2-ynyl ester；methane， isothiocyanato在各處理之間變異就較大。

用余弦分析法[30]得到各處理與對照之間的相似度是：氨基丁酸 0.9591，蕓苔素0.9620，甲殼素0.9508，超敏蛋白0.9552，水楊酸0.9163，茉莉酸0.9239，經水楊酸和茉莉酸處理后揮發物組分發生的變化更大。

3 討論

外源激素能夠引起植物的多重生理學響應，包括促進內源茉莉酸、水楊酸信號分子的合成，誘導抗性基因包括防御基因、防御物質合成基因和信號途徑基因的表達并提高植物的抗逆能力[31]。橡膠樹受茉莉酸甲酯處理后熱激轉錄因子Hsfs家族中有20個成員上調表達，進而提高橡膠的耐熱能力[32]。杭白菊經茉莉酸甲酯處理可誘導CmAOS和CmCOI1 基因表達的上調，促進內源茉莉酸的合成，顯著提高葉片保護酶、防御酶活性及次生代謝物含量，降低了丙二醛、可溶糖含量[33]，茉莉酸誘導增強茶樹抗病蟲能力的機制也和茶樹多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性上調以及黃酮類物質的積累有關[7-8]。

苯并噻二唑(BTH)和 β-氨基丁酸(BABA)可以通過激活水楊酸(SA)反應機制促進植物免疫，草莓受到BTH和BABA處理葉片蔗糖非發酵-1-相關蛋白激酶1(SnRK1)活性顯著升高，葉片凈光合速率、可溶性糖和淀粉含量以及幼苗生長量均有提高。處理4 h顯著提高了SnRK1家族基因FaSnRK1s和SnRK1下游基因FaASN1、FaUDG、FaDPS等的相對表達量[34]。外源噴施BABA可促進蠶豆過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)等酶的活性升高[35]。

將Harpin(HP)蛋白編碼基因導入大豆，檢測發現水楊酸信號途徑關鍵基因PR1、PR12表達量均表現出明顯的上調。茉莉酸信號途徑基因AOS表達量在葉片上微弱上調， PPO基因明顯上調，細胞程序性死亡基因GmNPR1和GmNPR2明顯上調，上述基因在抵抗大豆疫霉根腐病的侵染時均起到重要作用[36-37]。油菜素內酯處理過的擬南芥內源基因XTH19和XTH23表達量顯著增強，這是油菜素內酯緩解鹽脅迫下擬南芥側根發育受阻的重要原因[38]。甲殼素通過對保護酶系統的基因調節，以及對逆境脅迫下植物毒素合成的抑制提高作物抗性，改善作物品質[39]。植物經SA，JA，HP，花生四烯酸誘導處理后酚代謝途徑激活，酚含量上升[40]。

上述研究顯示，植物生物刺激劑促進作物生長，提高作物防御能力的基本機制是誘導內源激素的合成，誘導特定關鍵基因上調，基因表達上調的結果是植物多酚合成增加，植保素合成增強，保護酶系統活性顯著升高，光合能力增強等。

本研究結果表明，在植物生物刺激劑誘導下茶樹新梢酶活性得到調節，但每一種物質引起的效應不同，一般一種物質只引起1-2種酶活性的上升，這提示不同調節物質組合使用可能會效果更好。誘導處理下單一氨基酸可能有增減，但氨基酸總量基本上都是上升的，兒茶素單一組分則顯示除少數情形外大多數都趨于增加，尤其是EGCG增加較多。本試驗條件下，植物生物刺激劑處理后揮發物總量與對照相比基本沒有增加，甚而有減少(水楊酸、蕓苔素處理)，這與其它報道有所差異[7-8，11]。

茶葉生產過程相較于一般作物生產復雜程度要高許多，茶葉收獲的主要對象是新生茶梢(鮮葉)，但新梢本身必須通過復雜的加工才能成為可交換的各種商品。在這個生產體系中，首先要保證收獲足夠數量并且優質的鮮葉，即是需要追求產量又要追尋滿足一定質量條件的收獲物，鮮葉的產量和品質是茶樹品種、生長環境、栽培管理(包括病蟲危害的控制)技術實施的綜合結果。而茶葉加工工藝參數的選擇也將取決于新梢的各種物理、化學特性，成品的品質更是鮮葉基本理化特性和加工工藝的復雜統一性的體現[41-42]。在這樣的多重目標下，無論僅僅著眼于栽培管理還是著眼于加工都難以達到預期目的。以栽培管理為手段提高鮮葉產量和基礎品質，從加工著手提高品質潛力都是適當的方法，而如何直接貫通這兩個環節也顯得非常重要。

植物生物刺激劑的使用可能是重要的途徑之一。本試驗通過各種植物生物刺激劑的使用發現，首先所選植物生物刺激劑能夠提高茶樹鮮葉氨基酸含量和兒茶素含量，這2類物質是茶葉中最主要的品質成分，顯然適當使用植物生物刺激劑能夠提高鮮葉的生化品質，進而為提高成品茶品質奠定基礎。氨基酸總量提高無論從哪方面看對茶葉生產都是有益的，氨基酸含量提高是茶樹生長旺盛、茶樹抗逆能力增強的標識，提高氨基酸含量是茶樹鮮葉品質和茶葉產品品質追求的重要目標。每一種氨基酸又有其特定的生理功能，例如脯氨酸、精氨酸參與植物的抗逆活動，谷氨酸參與葉綠素合成和光合作用，蛋氨酸與植物防御氧化脅迫有關，苯丙氨酸是茶樹二級代謝物質酚類、萜類合成的重要庫源[42-43]。

對個別氨基酸的變化與植物生理反應之間的關系一一對應去研究可能會獲得更多有用信息，通過對不同激素處理下單一氨基酸變化的精細分析，并結合具體的生理調控目標可以幫助我們選擇適當的植物生物刺激劑。茶氨酸是茶樹葉片中含量最多的氨基酸，在茶樹氮代謝中起到中樞作用，在茶葉香氣的形成，茶葉的呈味反應，茶葉的健康功能等各個方向都發揮著重要作用[41-42]。氨基酸有鮮味(谷氨酸、天冬氨酸、茶氨酸)、甜味(丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸)、苦味(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸)等不同呈味反應，長期以來我們主要是關注鮮味和甜味氨基酸，認為茶葉的鮮爽、回甘特性與氨基酸有密切關系，但因為有眾多氨基酸呈現苦味特征，它們對茶葉感官品質的具體影響還不甚清楚，使用植物生物刺激劑后引起苦味氨基酸比例的顯著改變是否會影響茶葉的品質也有必要繼續探討。

除超敏蛋白外，本試驗所用植物生物刺激素各自至少能提高一種酶的活性。PPO， POD， PAL， CAT對茶樹和茶葉生產具有多重意義[44]。PPO，POD是酚類代謝的關鍵酶，昆蟲食物中的酚類經這兩種氧化酶催化生成木質素及醌類化合物，構成保護性屏障阻礙昆蟲取食，同時可以與蛋白結合抑制昆蟲的營養吸收。CAT參與植物應對昆蟲取食或非生物脅迫反應，參與植物信號分子H2O2的平衡調節。PAL是植物體內次生代謝反應的關鍵酶和限速酶，催化苯丙氨酸合成酚類化合物，并與水楊酸代謝途徑關聯形成植保素、木質素、類黃酮等抗營養物質或抑菌物質，因而在病蟲害防御中具有關鍵作用[45-46]。

在茶樹上使用青葉醇、香葉醇、芳樟醇、a-法尼烯等誘導對茶小綠葉蟬或茶尺蠖產生抗性的主要機制之一是PPO， PAL基因表達及相應酶活性的上調[7-9，15-17]。水楊酸增強茶樹抗旱能力的機制也與PPO， PAL， CAT活性上調緊密相關[6]。PPO，PAL， POD， SOD， LDH，CAT號稱為6大防御酶系[45]?；虮磉_及其調控過程非常復雜，但這是我們系統理解植物生理變化本質的重要途徑，本試驗沒有對此進行深入探究，有待今后完善。

多酚氧化酶和過氧化物酶也是紅茶品質形成所依賴的關鍵酶[42]，為獲得品質優良的紅茶，不僅希望適當提高鮮葉多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，而且希望在制茶過程中2種酶的活性一直能維持較高的水平，高活性的多酚氧化酶和過氧化物酶對于茶黃素的積累， 對于香氣的形成和轉化都是有益的。

附表1 氨基酸的多反應檢測參數(T3)

已有的研究表明，茶樹揮發物除了作為成品茶葉香氣形成的關鍵物質基礎外，還具有非常重要的生態功能，例如作為信號物質物質對鄰近植株進行預警，作為信息物質對害蟲和天敵的行為發生深刻影響[1]。作為香氣物質基礎我們希望揮發物總量、特定揮發性物質(例如芳樟醇、香葉醇、苯乙醇等)含量有所增加，本試驗中除茉莉酸酯和超敏蛋白誘導了芳樟醇的增加，其它各處理揮發物總量，芳樟醇、香葉醇含量與對照相比都有所下降，與預期結果有較大差異，需要對各物質的使用濃度、次數，使用時期以及茶樹揮發物的收集和分析方法做進一步試驗。本試驗條件下青葉醇類物質有明顯增加，制茶過程通常要用適當方法使青葉醇有所減少，但青葉醇也是茶葉新鮮香氣的重要基礎，鮮葉中青葉醇含量保持適當水平還是有益的。本研究顯示植物生物刺激劑有可能會引起茶樹揮發性組成比例的較大變化，如能清楚這些揮發物的確切生態功能或者它們在茶葉香氣構成中的作用，對茶葉香氣調控，茶樹害蟲生態控制是非常有用的。揮發性組分的變異點不同，說明各種植物生物刺激劑的基因調控節點不同，這為茶樹揮發性組分的定向調控提供了啟示，值得通過多種手段進一步研究。