黃芪-莪術對人乳腺癌的抑制作用及其機制

鄧 櫻,唐潤偉,衛 菊,樂 楓,劉云龍,錢耀明

(上海市第一人民醫院中醫外科,上海 200080)

乳腺癌(breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發病率在逐年上升[1,2]。目前中醫藥是治療乳腺癌的有效輔助手段,對于無法從常規腫瘤放化療的治療手段中獲益的病人,中醫藥保守治療是重要選擇。中醫認為乳腺癌的病因是內傷清志、痰瘀互結、正氣虧虛,治療以疏肝解郁、化痰散淤、調補氣血為主[3]。黃芪、莪術是傳統中醫治療乳腺癌的對癥藥物,中藥黃芪有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌的作用,莪術主治氣血凝滯、心腹脹痛等疾病[4,5]。近年研究報道,黃芪與莪術通過參與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉移,以及抗血管生成等多種代謝機制影響腫瘤的生存與進展[6-8]。因此,本研究通過建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,選用補氣活血中藥黃芪、莪術對乳腺癌移植瘤裸鼠進行治療,觀察治療效果;且由于在前期研究當中我們發現黃芪注射液及其有效成分對乳腺癌細胞增殖和Akt磷酸化有一定的影響[9],猜測其對于乳腺癌細胞增殖抑制與PI3K-Akt信號通路密切相關,因此在本研究中我們重點關注黃芪、莪術對PI3K-Akt信號通路的影響,從而希望通過分子生物學角度探索黃芪、莪術聯合治療乳腺癌的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及動物

人乳腺癌MDA-MB-231細胞,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。MDA-MB-231細胞使用L15培養基(Leibovitz’s L-15 Medium,Thermo Fisher Scientific,USA)和10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,Thermo Fisher Scientific,USA)培養,每隔2 d傳代一次。雌性SPF級裸鼠共18只,每組3只,周齡6-8周,購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

蘇木素(上海展云化工有限公司),伊紅(上海展云化工有限公司),4%多聚甲醛(無錫菩禾有限公司),PBS(無錫菩禾有限公司),中性樹膠(中國上海懿洋儀器有限公司),TUNEL檢測試劑盒(上海凱基有限公司KGA7033),0.25%胰蛋白酶(上海碧云天有限公司),Trizol(賽默飛世爾科技),DEPC處理水(無錫菩禾有限公司),SYBR Green PCR試劑盒(Thermo F-415XL),逆轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技#K1622),BCA蛋白定量試劑盒(BIOSHARP生物科技公司),30%丙烯酰胺(29 ∶1)(上海國藥集團化學試劑有限公司),1.5 mol/L Tris-HCl pH=8.8電泳緩沖液(上海國藥集團化學試劑有限公司),1.0 mol/L Tris-HCl pH=6.8電泳緩沖液(上海國藥集團化學試劑有限公司),10% SDS(上海國藥集團化學試劑有限公司),10%過硫酸銨(SIGMA,美國),TEMED(SIGMA,美國),4×蛋白上樣緩沖液(寶日生物技術有限公司),蛋白預染Marker(賽默飛世爾科技),5% BSA(BIOSHARP生物科技公司),Tween-20(Amresco Ltd,美國),發光液(Millipore,美國)。

1.3 實驗儀器

游標卡尺,超凈工作臺(蘇州安泰科技有限公司),光學顯微鏡(OLYMPUS,IX71,日本),低溫冷凍離心機(Sigma Ltd,3K15,美國),ABI 7500 Fast Real-Time PCR system PCR儀(安捷倫有限公司,美國),PVDF膜(Millipore,美國),電泳儀(mini protean 3 cell,美國BIO-RAD有限公司),電轉儀(PS-9,大連競邁科技有限公司),酶標儀(賽默飛世爾科技,MK3),移液器(賽默飛世爾科技),一體式化學發光成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司,Chemi Scope 5300 Pro)。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥物制備 中藥材均購買于中國中藥有限公司。其中黃芪為豆科植物蒙古黃芪的根,產地為我國黑龍江省依蘭縣;莪術為姜科植物莪術的根莖,產地為我國廣西壯族自治區。中藥黃芪、莪術經過浸泡,用傳統水煎法提取其中的有效成分,黃芪、莪術提取物濃度均為0.4 g/ml,根據動物公斤體質量劑量換算系數換算法:以臨床實際用藥劑量作為參考量,即黃芪、莪術均30 g,以成人標準體質量70 kg計算,根據鼠劑量=人劑量×9.01,即裸鼠劑量約為3 900 mg/kg,每只裸鼠按照20 g標準體質量計算,即單只小鼠的應用量為78 mg,取整80 mg,灌胃量定為0.2 ml。

1.4.2 模型建立及分組給藥 在SPF環境下觀察裸鼠1周,狀況良好,準備接種細胞;75%酒精消毒裸鼠注射部位皮膚,在裸鼠右側腋下注射含1.8×106個MDA-MB-231細胞的細胞懸液;刺入點距注射點約1 cm,形成一隆起皮丘,防止液體漏出。消毒皮膚,觀察成瘤情況。數日后,當成瘤80 mm3左右開始灌胃給藥,每只裸鼠每日1次,每組給藥4周。之后將裸鼠稱重,處死,取出移植瘤,稱瘤重;計算抑瘤率。根據不同給藥情況將試驗裸鼠分為6組,比較黃芪、莪術單用和聯用的抑制作用,并分析二者不同比例下抑制效應差異,為保證應用劑量的安全性,本研究以基礎劑量(80 mg)的2倍進行不同比例的對照分析,故研究分組設計為:模型組、黃芪組、莪術組、黃芪莪術2 ∶1組(黃芪 ∶莪術濃度為0.8 g/ml ∶0.4 g/ml)、黃芪莪術1 ∶1組(黃芪 ∶莪術濃度為0.4 g/ml ∶0.4 g/ml)、黃芪莪術1 ∶2組(黃芪 ∶莪術濃度為0.4 g/ml ∶0.8 g/ml)。模型組給予等量的0.9%生理鹽水。以黃芪莪術2 ∶1組為例,其中黃芪、莪術提取物濃度分別為0.8 g/ml和0.4 g/ml,其余組別以此類推。

1.4.3 HE染色檢測黃芪-莪術對腫瘤組織形態學影響 取出裸鼠身上的人乳腺腫瘤,用病理切片機切片。用蒸餾水沖洗切片;滴加蘇木素染色,染色5 min左右。蒸餾水洗至組織呈藍紫色;滴加1%鹽酸乙醇分化2 s,待組織變紅;蒸餾水洗至組織呈藍紫色;伊紅染色,染色6 s;用蒸餾水沖洗切片;用無水乙醇脫水;滴加中性樹膠,封片;鏡下觀察并拍照(×200)。

1.4.4 TUNEL檢測黃芪-莪術對人乳腺癌細胞凋亡的影響 對石蠟包埋的乳腺腫瘤病理組織切片進行PBS沖洗。在切片上滴上100 μl含2 000 U的蛋白酶K反應液,在37 ℃室溫放置20 min。滴加3% H2O2封閉,室溫放置20 min。配制TdT酶反應液,即配即用;樣本周圍用吸水紙吸干,每個樣本上滴加50 μl TdT酶反應液,放入濕盒中,37 ℃避光反應60 min;每個樣本上滴加50 μl反應終止液,室溫放置20 min;配制Streptavidin-HRP工作液,即配即用,避光保存;1×PBS漂洗切片3次;樣本周圍用吸水紙吸干,每個樣本滴加50 μl DAB顯色液,室溫放置5 min;蘇木素復染5 min,蒸餾水沖洗后浸入1%的鹽酸甲醇分化5 s,立即用蒸餾水沖洗,分別用70%,85%,95%的酒精脫水,用二甲苯浸2次,每次10 min,晾干后封片。在光學顯微鏡下觀察、拍照。每組隨機選擇并統計3個視野下凋亡細胞數量,進行計量分析。

1.4.5 RT-PCR檢測PI3K-Akt通路以及抑癌基因PTEN mRNA水平 將乳腺腫瘤組織剪碎,Trizol裂解液法提取RNA。配置反轉錄反應體系:5×逆轉錄buffer 4 μl,RNA酶抑制劑1 μl,下游通用引物1 μl,dNTPs 1 μl,逆轉錄酶MMLV 1 μl,DEPC處理水8 μl,RNA模板4 μl,總體積20 μl。利用以上反應體系在反應條件為42℃ 40 min;85 ℃ 5 min逆轉錄RNA成cDNA。將制備好的cDNA進行PCR擴增,擴增體系如下:SYBR Green Mix 10 μl,上游引物0.4 μl,下游引物0.4 μl,ddH2O 7.2 μl,cDNA模板2 μl,總體積20 μl。擴增條件:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s)40個循環。用ABI Prism 7500 SDS Software軟件進行數據分析。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.4.6 Western blot檢測PI3K-Akt通路以及抑癌基因PTEN蛋白水平 將乳腺腫瘤組織剪碎后加入適量的RIPA裂解液,加入適量的PMSF,置于冰上裂解25 min;12 000 r/min,4 ℃,離心10 min。制備蛋白樣品,進行SDS-PAGE,轉膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,孵育一抗4 ℃孵育過夜。一抗為:p-AKT(1 ∶5 000,anti-mouse,Proteintech),PTEN(1 ∶1 000,anti-rabbit,Proteintech),GAPDH(1 ∶5 000,anti-mouse,Proteintech)。孵育一抗后的膜用TBST洗滌,按1 ∶5 000稀釋二抗并在37 ℃孵育膜1 h。用TBST洗滌。二抗為:山羊抗小鼠(中杉金橋)和山羊抗兔(中杉金橋)。發光液(A液、B液)1 ∶1配置,用移液器吸取合適量的發光液至PVDF膜,在ECL發光儀上曝光并采集圖像。

1.5 統計學方法

采用Graphpad Prism 8和SPSS 19.0統計軟件進行數據處理。每個試驗重復3次,最終數值以平均數±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪-莪術對裸鼠乳腺腫瘤生長的抑制作用

裸鼠成瘤結果顯示,黃芪和莪術介入后瘤塊體積顯著小于模型組(P<0.05,見表2),黃芪組腫瘤體積小于莪術組,兩種藥物以不同比例混合給藥后,瘤塊體積進一步縮小(P<0.05,見表2,圖1,2),其中黃芪莪術2 ∶1組的腫瘤體積最小,抑瘤率最大,為82.7%。6個組的腫瘤體積都呈上升趨勢,腫瘤體積增長最多,從植入乳腺癌MDA-MB-231細胞第7天到第49天,腫瘤體積從零增加到(3 140.33±149.9)mm3。6個組的腫瘤增長由快到慢的順序是:模型組>莪術組>黃芪組>黃芪莪術1 ∶2組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術2 ∶1組。

表2 各組裸鼠成瘤抑制率

2.2 黃芪-莪術對乳腺腫瘤細胞凋亡的影響

HE染色可見各組細胞核內的染色質與胞質內的核糖體呈藍紫色,而細胞質和細胞外基質中的成分呈紅色。HE結果顯示,黃芪組和莪術組腫瘤細胞排列松散,收縮成圓形;兩種藥物混合組瘤塊細胞排列更疏松,壞死更嚴重。其中黃芪莪術2 ∶1組乳腺腫瘤細胞排列最松散(見圖3)。黃芪組的腫瘤細胞排列比莪術組松散。6組腫瘤細胞排列松散程度由高到低的順序是:黃芪莪術2 ∶1組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術1 ∶2組>莪術組>黃芪組>模型組。

與模型組比較,*P<0.05;與莪術組相比,#P<0.05;與黃芪莪術1 ∶1組比較,&P<0.05圖2 黃芪-莪術對裸鼠乳腺癌成瘤體積的影響Figure 2 The effect of Huangqi and Ezhu on tumor volume in breast cancer nude mice

圖3 黃芪莪術組對乳腺癌腫瘤組織的形態學影響 (HE×200,bar=20 μm)Figure 3 The morphology of Huangqi and Ezhu in breast tumor tissue (HE×200,bar=20 μm)

TUNEL檢測試劑盒能對處在凋亡期具有斷裂DNA的細胞進行染色。從TUNEL結果來看,黃芪組和莪術組腫瘤細胞凋亡個數顯著高于模型組;兩種藥物混合給藥組腫瘤細胞凋亡個數進一步增加,其中黃芪莪術2 ∶1組的乳腺腫瘤細胞凋亡個數最多,而莪術組腫瘤細胞凋亡個數略小于黃芪組(見圖4和表3)。6組細胞凋亡個數由多到少的順序是:黃芪莪術2 ∶1組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術1 ∶2組>黃芪組>莪術組。

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與莪術組相比,#P<0.05;與黃芪莪術1 ∶1組比較,&P<0.05圖4 黃芪莪術對乳腺腫瘤細胞凋亡的影響 (TUNEL,×100)Figure 4 Effect of Huangqi and Ezhu on breast tumor cell apoptosis (TUNEL,×100)

表3 各組乳腺癌腫瘤細胞凋亡情況

2.3 黃芪-莪術對PI3K-Akt通路和PTEN基因表達水平的影響

RT-PCR實驗結果顯示,與模型組相比,黃芪組、莪術組PI3K、Akt1、Akt2表達量顯著降低,PTEN表達量顯著升高;黃芪莪術混合組的PI3K、Akt1、Akt2表達量降低更為顯著,PTEN表達量升高也更為顯著。其中,黃芪莪術2 ∶1組PI3K、Akt1和Akt2基因表達水平相對于模型組降低的最多,PTEN基因表達水平相對于模型組升高的最多。6組乳腺腫瘤基因PI3K、Akt1、Akt2的表達水平由高到低的順序是:模型組>莪術組>黃芪組>黃芪莪術1 ∶2組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術2 ∶1組(見圖5,表4)。而PTEN基因的表達水平由高到低的順序是:黃芪莪術2 ∶1組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術1 ∶2組>黃芪組>莪術組>模型組(見圖5,表4)。

Western blot結果顯示,黃芪莪術2 ∶1組的p-Akt基因的表達水平相對于模型組降低的最多,PTEN基因的表達水平相對于模型組升高的最多(見圖6)。6組p-Akt的表達水平由高到低的順序是:模型組>莪術組>黃芪組>黃芪莪術1 ∶2組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術2 ∶1組。6組PTEN的表達水平由高到低的順序是:黃芪莪術2 ∶1組>黃芪莪術1 ∶1組>黃芪莪術1 ∶2組>黃芪組>莪術組>模型組(見圖6,表5)。

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 RT-PCR檢測乳腺癌腫瘤細胞中PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因的表達水平Figure 5 The expression levels of PI3K,Akt1,Akt2 and PTEN in breast cancer cell by RT-PCR assay

表4 RT-PCR檢測各組乳腺腫瘤細胞中PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因的mRNA表達水平

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 Western Blot檢測乳腺癌腫瘤細胞中p-Akt和PTEN的蛋白表達水平Figure 6 Protein levels of p-Akt and PTEN in breast cancer cells by Western Blot

表5 Western Blot檢測乳腺腫瘤細胞中p-Akt和PTEN的蛋白表達水平

3 討論

隨著科技和社會的發展,人們生活和工作壓力的增加,乳腺癌的發病率逐漸升高,現在已成為僅次于宮頸癌的女性第二大癌癥。乳腺癌是乳腺上皮細胞在多種致癌因子的作用下,發生增殖失控的現象[10]。早期乳腺癌常表現為乳房腫塊、乳頭溢液、腋窩淋巴結腫大等癥狀。晚期乳腺癌可發生癌細胞遠處轉移,出現多器官病變,威脅患者生命[11]。中醫對乳房腫塊的診斷是局部氣血淤積,通路不暢[12]。早期乳腺癌的初步治療是心情、生活方式調整治療,配合化學藥物治療、靶向藥物治療、內分泌藥物治療;如果得不到緩解或就診時經專家會診建議手術治療,則應手術治療,術后輔助藥物治療或放射治療[13,14]。

黃芪、莪術是治療乳腺癌的中藥復方癌復康的關鍵配伍藥物,具有益氣補血、消腫化瘀、抗癌解毒的功效,能顯著改善乳腺癌患者術后化療的生存質量[15]。宋魏等[16]對黃芪解毒方對胃癌SGC-7901細胞的作用進行了研究,得出黃芪解毒方能有效抑制胃癌SGC-7901細胞增殖,促進其凋亡,并能下調C-myc基因的表達。臧文華等[17]對黃芪、莪術聯合順鉑治療人肝癌裸鼠模型進行了研究,得到黃芪、莪術配伍能下調TF、HGF、FVII基因的表達,對腫瘤新生血管生成有抑制作用。姚遠等[18]對黃芪、莪術不同提取物治療肝癌進行研究,得出黃芪-莪術95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統水煎4種提取物均能抑制小鼠H22荷瘤生長。

我們前期研究發現,黃芪注射液及其有效成分可能通過下調Akt磷酸化從而抑制乳腺癌細胞增殖[19]。本研究結果顯示,黃芪、莪術對乳腺癌細胞裸鼠成瘤都有顯著的抑制作用。而黃芪對乳腺腫瘤的消除能力大于莪術,并且對促癌PI3K/Akt信號通路的抑制作用顯著優于莪術。但是黃芪-莪術聯合給藥對乳腺癌的抑制能力增強,明顯大于黃芪、莪術單獨給藥。且在調整黃芪莪術聯合濃度為2 ∶1時,腫瘤體積最小,促進乳腺腫瘤細胞凋亡,PI3K、Akt1和Akt2基因表達水平相對于模型組降低幅度最大,抑癌基因PTEN基因表達水平相對于模型組升高的最多。這說明黃芪 ∶莪術濃度為2 ∶1時,對乳腺癌的抑制最強,在配伍時應該按照此比例,黃芪是主要治療藥物。黃芪莪術2 ∶1組乳腺腫瘤細胞排列最松散。說明黃芪的作用很可能是切斷腫瘤細胞之間的聯系,使細胞膜之間的黏附性降低。而莪術的作用需要后續深入研究。

目前有多項研究表明磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路的異?；罨艽龠M乳腺癌細胞的增殖和遷移,抑制癌細胞的凋亡[19]。激活PI3K能促使質膜上產生的第二信使PIP3與含有PH結構域的信號蛋白Akt和PDK1結合,促進PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308,使得Akt活化?；罨腁kt能通過磷酸化作用激活或抑制其下游的靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等,從而調節細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等,引發癌癥[20,21]。PTEN是一個PIP3-磷酸酶,它的功能與PI3K相反。PTEN能通過去磷酸化將PIP3轉化為PI-4,5-P2,從而減少Akt的活化,阻止所有由Akt調控的下游信號的傳導,抑制PI3K-Akt信號通路[22]。

我們的研究將黃芪、莪術對乳腺癌的治療作用與PI3K/Akt信號通路聯系起來,黃芪、莪術的提取物對PI3K/Akt通路有顯著抑制作用,并能促進PTEN基因的表達,從而抑制關鍵因子PIP3,阻斷PI3K/Akt通路向下游傳導。但對于黃芪、莪術聯合給藥是否抑制了PI3K/Akt通路中的其他因子及其具體機制,以及對乳腺癌的其他相關信號通路的抑制作用及其機制仍有待研究。黃芪、莪術聯合給藥對乳腺癌的抑制作用最強的絕對比例仍有待繼續探究,但我們的研究中2 ∶1的比例較優,應在未來研究中對比例進行細化。

黃芪、莪術因具有散瘀疏氣的作用而對腫瘤有一定的療效。在黃芪:莪術濃度為2:1時,對乳腺癌的治療效果最好,并且其對乳腺癌的治療作用很可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路,并激活PTEN基因而達到的。在乳腺癌的輔助治療中,可以用中藥黃芪莪術2 ∶1進行配伍治療。