全氟與多氟烷基物質的生殖毒性研究進展

張善宇，姚謙，施蓉，田英

上海交通大學公共衛生學院環境與健康系，上海 200025

全氟與多氟烷基物質（per- and polyfluoroalkyl substances，PFAS）是一類由氟原子和特定官能團結合在碳鏈骨架上所構成的人造有機化合物，化學性質穩定，被廣泛應用于工業生產，因此在水、空氣、土壤等多種環境介質中均有檢出。PFAS 半衰期長，容易在生物體內蓄積，產生多種毒性作用，其中全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）、全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）、全氟壬酸（perfluorononanoic acid，PFNA）在環境中約占PFAS 總含量的80%，有較強的生物活性，也是研究最多的物質。從2008年開始，歐盟、日本、美國相繼制定了有關PFAS 使用的相關標準，美國于2015年全面淘汰PFOA，但PFOA的全球產量仍逐年攀升，中國也是全球PFAS 的主要生產地之一。近年來，多項研究發現人群生育力下降與環境有害物質暴露有直接聯系，人群和動物研究也發現PFAS 暴露與不良生殖狀態有關，因此，綜述PFAS 的生殖毒性對于進一步了解其毒性效應，以及深入探索其毒性機制有重要的意義。

1 PFAS污染現狀與人群暴露特征

PFAS 性質穩定，遷移能力強，已在世界各處的多種環境介質中廣泛檢出。由于PFAS 的碳鏈越短，水溶性越強，所以在水體中，短鏈PFAS 的含量較高，如全氟丁烷磺酸鹽（perfluorobutane sulfonate，PFBS）和全氟丁酸（perfluorobutyric acid，PFBA）。阿姆斯特丹的環境水樣中，PFBA 和PFBS 質量濃度（后稱濃度）的算術均數分別為33、35 ng·L-1，且較難通過水處理工藝去除。美國一個PFAS 工廠附近的河流中，總PFAS 濃度均值達到1 863 ng·L-1，主要污染物是全氟-2-（全氟甲氧基）丙酸和六氟環氧丙烷二聚酸［1］。在空氣中，Yao等［2］在天津收集了不同場所（如酒店、電影院等）的室內空氣和灰塵，檢測發現主要PFAS 為含氟調聚物醇，由此估計人體每天通過空氣吸入和粉塵吸入的總PFAS 質量分數分別為1.04～14.1、0.10～8.17 ng·kg-1。此外，PFAS 容易在土壤中蓄積，以垃圾填埋場和氟化物工廠附近的土壤污染最為嚴重［3］。PFAS 可以通過土壤向農作物遷移，研究人員用含PFAS 的土壤種植玉米，發現玉米秸稈和玉米中的PFAS 濃度均大幅升高［4］，其他植物中也均有不同程度的PFAS 檢出［3］。由此可見，人群會多途徑暴露于PFAS，帶來嚴重的健康威脅。

人血液、尿液、精液、卵泡液、指甲、頭發等生物樣本中均能檢出PFAS。PFAS 代謝轉化緩慢，不易排出體外，因此血液是常用的檢測PFAS 的生物樣本。但由于短鏈的替代物水溶性增加，更有利于排出體外，所以尿液可能是未來檢測短鏈PFAS 的更好的樣本。不同地區的人群之間PFAS 暴露水平差異較大，西方國家主要以PFOS 暴露為主，而中國上海和山東以PFOA高暴露為特點［5］。男性的PFAS 暴露水平比女性高［6］，母親體內的PFAS 還可以通過胎盤和母乳進入新生兒體內，對新生兒的生長發育造成影響［5］。目前用于工業生產的PFAS 已多達千種，但能夠被實驗室檢測到的PFAS 不到百種，因此持續關注這一類物質的影響尤為重要。

2 PFAS 的雌性生殖毒性

2.1 PFAS對女性生殖功能影響的流行病學研究

PFAS 暴露與女性生育力降低，卵巢疾病的發生風險增加有關。加拿大一項大樣本隊列研究發現，血漿中的PFOA 和全氟己烷磺酸（perfluorohexane sulfonic acid，PFHxS）濃度每增加1 個標準差，生育力就會降低11%和9%，不孕的風險增加31%和27%，而PFOS則沒有明顯的相關性［7］。Wang 等［8］對180 例因多囊卵巢綜合征而不孕的女性進行病例對照研究，發現全氟十二酸（perfluorododecanoic acid，PFDoA）血漿濃度與多囊卵巢綜合征相關的不孕風險增加有關。Zhang 等［9］在原發性卵巢功能不全的病例對照研究中也發現，暴露于PFOA、PFOS 和PFHxS 與女性發生原發性卵巢功能不全風險增加有關。

女性的生殖功能與卵巢狀態息息相關，而女性的月經周期是卵巢狀態的直接體現。PFAS 與月經周期紊亂有關，如初潮時間推遲，月經量減少，周期時間延長等。美國俄亥俄州的一項2 931 名8～18 歲女性的橫斷面研究發現，PFOA和PFOS高暴露女性比低暴露女性的月經初潮時間分別延遲了130、138 d［10］。丹麥的出生隊列研究發現，宮內PFOA 高暴露組比低暴露組月經初潮時間推遲5.3月，但PFOS 則無類似發現［11］。但是，英國一項巢式病例對照研究發現初潮年齡提前與接觸PFAS 沒有關聯［12］。此外，PFAS 還與月經周期不正常有關。Lyngs? 等［13］對格陵蘭、波蘭、烏克蘭共1 623 名女性研究發現：PFOA 高暴露與更長的月經周期有關。隨后，Zhou 等［14］在上海的橫斷面研究（950 名女性）發現，PFOA、PFOS、PFNA、PFHxS暴露與月經周期不規律、更長以及月經量減少有關。對美國國家健康和營養調查參與者的研究發現，較高的PFAS 濃度與更年期提前有關，與血清中PFHxS 低濃度組的女性相比，中濃度組和高濃度組的自然絕經風險是其1.42 倍和1.70 倍［15］。八碳健康項目中的42～65 歲女性絕經的風險隨著PFOA 和PFOS 水平的增加而增加［16］。但Dhingra 等［17］采用回顧性隊列，研究了2005—2006年招募的女性，發現PFOA 暴露與更年期提前之間無關聯。

女性的卵巢狀態受到性激素的直接調控，PFAS作為環境內分泌干擾物，對性激素有明顯的影響。八碳健康項目顯示PFOS 暴露與42～65 歲沒有使用避孕藥歷史的女性血清中雌二醇（estradiol，E2）水平呈負相關［16］；挪威的一項橫斷面研究在25～35 歲健康且未孕的女性中發現，血清PFOS 水平與血清E2和孕酮（progesterone，P4）水平呈負相關［18］。同樣地，Zhang等［9］發現PFOS 暴露可能會導致原發性卵巢功能不全病人的E2和催乳素水平降低，卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，FSH）水平增加。Mccoy 等［19］在50 名進行輔助生殖的女性體內發現PFOS 濃度與E2水平呈負相關。此外，Heffernan 等［20］在無多囊卵巢綜合征的健康女性中觀察到，PFOS 暴露與游離雄激素指數呈負相關。然而，上述研究中均未觀察到PFOA與性激素水平的關聯。相反地，Lewis 等［21］在2011年和2012年美國國家健康和營養調查的12～80 歲女性中，發現PFOA、PFOS 與血清睪酮（testosterone，T）水平無相關性。Kritensen等［11］在丹麥出生隊列研究中發現宮內PFOA和PFOS暴露對后代成年女性體內的多種生殖激素均無影響。與成年人相比，青少年可能更容易受到PFAS的干擾：中國臺灣青少年女性（12～17歲）血清PFOA、PFOS 和全氟十一酸與血清性激素結合球蛋白、FSH、T 呈負相關［22］。類似地，6～9 歲女孩PFOS暴露與更低的血清T 濃度相關［10］。丹麥歐登塞兒童隊列中發現孕早期母體血清PFDA 濃度升高與4月齡女嬰血清脫氫表雌酮降低有關［23］。

由此可以看出，盡管人群資料中顯示PFAS 與女性生殖功能的關聯并不一致，但在PFAS 與E2降低的相關性上結果較為一致，這可能也是PFAS 推遲月經初潮和提前更年期的原因之一。但PFAS 與人群不同性激素水平的關聯可能因人群遺傳背景、PFAS 暴露水平、生理狀態等因素而呈現出不同的趨勢。

2.2 PFAS雌性生殖毒性的動物研究

在實驗模型中也證實了PFAS 對雌性生殖功能的不利影響，主要涉及PFOS、PFOA、PFBS、PFNA 以及PFDoA。

PFOS 是環境中含量最為豐富的PFAS，也是目前被研究得最多的PFAS 之一。Feng 等［24］給予成年雌鼠PFOS 暴露（0.1 mg·kg-1·d-1）4 個月，發現排卵前卵泡減少，閉鎖卵泡增加，間情期延長，這可能是由于類固醇急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）組蛋白乙?；瘻p少，下調Star基因表達，使得E2合成減少；同時發現下丘腦Kisspeptin神經元數量減少，前室旁核中Kiss1mRNA水平降低。Wang等［25］研究也證明了成年雌鼠暴露于10 mg·kg-1·d-1PFOS兩周會延長間情期和減少排卵，這是由于PFOS 抑制了雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）誘導的Kisspeptin 神經元活化。新生大鼠（出生后1～5 或26～30 d）暴露于PFOS 或PFOA，下丘腦中Kisspeptin 信號被破壞，Kiss1、Kiss1r和ERαmRNA 表達下調，新生大鼠卵泡減少，陰道開放和初次發情時間均提前［26］。此外，PFOS 體外染毒還會抑制體外培養的豬卵母細胞的活力（半數致死濃度=32 μmol·L-1）和成熟（半數致死濃度=22 μmol·L-1），進一步研究發現，22 μmol·L-1PFOS 破壞卵母細胞和顆粒細胞間的縫隙連接，但連接蛋白43（connexin 43，Cx43）、Cx45和Cx60的基因表達并沒有改變［27］。

PFOA 與PFOS 對雌性生殖功能的影響在某些方面有一定的相似性。例如，1.2 μmol·L-1的PFOA 或PFOS均會抑制黃體生成素（luteinizing hormone，LH）刺激的豬卵巢膜細胞中雄烯二酮和P4分泌，以及FSH 刺激的顆粒細胞中E2、P4分泌［28］。除此之外，PFOA 還會誘導氧化應激反應：Chen 等［29］在母鼠孕1～7 d 或孕1～13 d 給予10 mg·kg-1PFOA，發現PFOA 抑制孕鼠卵巢抗氧化酶活性，增加活性氧產生，以及P53 和Bax 蛋白表達，從而抑制黃體的功能。胎鼠卵母細胞暴露于28.2、112.8 μmol·L-1PFOA 會破壞卵丘細胞-卵母細胞復合物中細胞間隙連接，產生活性氧并引起卵母細胞凋亡和壞死［30］。

PFBS作為長鏈PFAS的替代物，近年來得到廣泛的使用，雖然PFBS在體內的半衰期短，但其毒性仍然值得關注。小鼠全孕期給予PFBS（200或500 mg·kg-1·d-1），雌性后代青春期陰道開放和初發情期延遲，間情期延長，成年時卵巢縮小和重量減輕，卵泡數量減少，E2、P4濃度降低。研究者認為這是由低甲狀腺素血癥介導的［31］。Cao 等［32］研究發現成年雌性小鼠暴露于PFBS（200 mg·kg-1·d-1）兩周會誘導甲狀腺激素缺乏，下調顆粒細胞和卵丘細胞中AKT-mTOR 信號，從而抑制細胞增殖，促進細胞自噬，破壞卵泡發育和卵巢激素的生物合成。

與PFOS、PFOA 和PFBS 相比，PFDoA 和PFNA 的生殖毒性報道較少。斷乳的青春期前雌性大鼠暴露于PFDoA（3 mg·kg-1·d-1，28 d）后下調了卵巢絨毛膜促性腺激素受體（lutropin/chorionic gonadotropin receptor，LHCGR）、Star和膽固醇側鏈裂解酶的mRNA 表達，導致E2的產生減少，卵巢中的ERα和ERβmRNA 水平也降低［33］。Hallberg 等［34］用10 mg·L-1PFNA 體外處理牛卵母細胞22 h，隨后進行體外受精并觀察胚胎發育情況，發現胚胎發育受到負面影響，表現為脂質分布異常，這可能與PPAR 異常激活導致的脂質代謝紊亂有關。

就目前已有的研究而言，PFOS 和PFOA 可以通過干擾下丘腦-垂體-性腺軸和阻礙卵丘-卵母細胞間的通訊誘發生殖毒性，PFOA 還可以誘導氧化應激反應。PFBS 誘發的生殖毒性主要是通過低甲狀腺素血癥介導，而關于PFDoA 和PFNA 的研究較少，可能與性激素合成以及脂質代謝異常有關。

3 PFAS的雄性生殖毒性

3.1 PFAS對男性生殖影響的流行病學研究

PFAS 與男性生殖影響的人群研究不多，并且結果并不一致。廣州的一項橫斷面研究發現男性精液中多種PFAS 濃度與精子活力呈負相關［35］。Louis 等［36］在美國收集了501 對計劃懷孕的夫妻中男性血液和精液樣本，檢測發現包括PFOS 和PFOA 在內的6 種PFAS濃度與精液質量下降有關，如精子頭部面積和周長降低、雙頭精子和未成熟精子比例升高等。丹麥奧胡斯隊列中169 名男性后代（19～21 歲），其母親孕30 周血中PFOA 水平與后代較低的精子濃度和總精子計數相關［37］。多項研究表明，男性體內PFAS水平與T濃度降低［38-40］、LH和FSH濃度升高有關［37，41-42］。但也有研究結果顯示PFAS對精液質量無明顯的影響［39，42-43］，Vested等［37］研究結果也僅顯示精子質量與PFOS 相關，而不是PFOA。此外，還有學者認為，PFAS 會影響精子DNA的甲基化水平［44］，干擾精子減數分裂和DNA 完整性等［45］。這些結果的差異可能是研究人群的遺傳背景、暴露水平不同，樣本的代表性，研究方法不同等因素造成的。

3.2 PFAS對雄性生殖毒性的動物研究

PFAS 對動物的生殖毒性研究主要集中于PFOS、PFOA、PFDoA和PFNA這4種物質。

研究表明，大鼠宮內暴露PFOS 會降低胎鼠睪丸組織T 水平，降低胎鼠Leydig 細胞數量，損傷胎鼠的生殖系統［46］。PFOS 還會影響成年雄性大鼠下丘腦-垂體-睪丸軸，如下丘腦去甲腎上腺素濃度增加，GnRH濃度降低，LH 和T 受到抑制，FSH 受到刺激，此外還觀察到促性腺激素細胞變性、睪丸水腫等形態學改變［47］。Wan 等［48］發現PFOS（40 或80 μmol·L-1）會干擾Sertoli 細胞緊密連接的滲透性屏障，導致細胞質溶膠中的肌動蛋白微絲破裂，從而干擾細胞連接蛋白（ZO-1、N-cadherin）的定位，10 μmol·L-1的白藜蘆醇（抗氧化劑）預處理可以防止PFOS 引起的毒性。Li等［49］認為這可能是由于PFOS 下調Cx43 蛋白所導致的，Cx43 過表達可以阻止PFOS 的作用。Qiu 等［50］發現PFOS 會劑量依賴性地增加小鼠血睪屏障的通透性，增加p38/ATF2磷酸化和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達，降低血睪屏障接頭蛋白Occludin和Cx43的表達；體外Sertoli細胞模型也與體內結果相似，抑制p38、MMP9 和敲低ATF2均會減弱PFOS 對Sertoli 細胞的影響。小鼠青春期PFOS暴露下調Leydig 細胞中Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1的mRNA 和蛋白質水平，PFOS 在體外濃度≥50 nmol·L-1時抑制未成熟的Leydig 細胞中T 分泌，≥500 nmol·L-1時會下調Lhcgr，抑制Bcl-2，增加Bax水平，從而導致Leydig 細胞凋亡［51］。此外，PFOS 體外處理小鼠Leydig細胞會誘導活性氧產生并降低線粒體膜電位，通過抑制Bcl-2和上調Bax誘導細胞凋亡［52］。

成年雄性小鼠給予PFOA（1.25、5或20 mg·kg-1·d-1）處理28 d，PFOA 以劑量依賴的方式積累在附睪中，并導致附睪重量減少，多不飽和脂肪酸組成改變，附睪中的蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）信號激活，說明附睪是PFOA 的潛在靶標［53］。Lu 等［54］的研究發現，5 mg·kg-1·d-1的PFOA 處理28 d 會改變小鼠睪丸內吞相關蛋白的表達模式，改變小鼠睪丸miRNA譜。PFOA 下調Leydig 干細胞特異性基因（Lhcgr、清道夫受體B1 基因、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd11b1和Cyp17a1）的表達水平及其蛋白水平，降低血清T水平，減少增殖細胞核抗原陽性Leydig干細胞數量［55］，說明PFOA 會抑制SLC 細胞增殖。此外，小鼠體內PFOA 暴露或體外PFOA 處理mLTC 細胞系均會刺激Leydig 細胞特異性表達的糖皮質激素結合球蛋白（corticosteroidbinding globulin，CBG），而CBG 參與誘導類固醇生成蛋白，包括StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-羥類固醇脫氫酶，從而促進P4的增加［56］。但Zhao 等［57］認為PFAS對小鼠Leydig 腫瘤細胞孕激素產生的抑制作用可能部分歸因于活性氧水平的增加和線粒體膜電位的降低，還發現PFAS 的碳鏈越長，抑制率越高，半數抑制濃度排序為PFBA（C4）＞全氟己酸（C6）＞全氟庚酸（C7）＞PFOA（C8）＞PFNA（C9）=全氟癸酸（C10）＞全氟十一酸（C11）＞PFDoA（C12）=全氟十四酸（C14）［57］。

未成年大鼠（出生后21～35 d）暴露于0、5、10 mg·kg-1·d-1的PFDoA，PFDoA 降低血清中T、LH、FSH濃度，下調類固醇合成相關基因表達，但不影響Leydig細胞數量和增殖，進一步研究發現，PFDoA 降低NAD-依賴性去乙?；窼irtuin-1 和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α 蛋白水平，降低AMPK和AKT2磷酸化［58］。10 μmol·L-1PFDoA體外處理Leydig祖細胞會降低細胞活力，刺激細胞內活性氧生成并誘導Leydig細胞凋亡［58］。Shi等［59］給予成年大鼠PFDoA 灌胃（1、5、10 mg·kg-1·d-1）14 d，PFDoA 降低睪丸絕對重量和血清T 水平，中、高劑量組Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1和Hsd17b3的表達下調，高劑量組血清LH 水平降低，總膽固醇水平升高，不影響FSH水平；此外，中、高劑量組Leydig細胞、Sertoli細胞、生精細胞表現出凋亡特征。成年雄性大鼠長期（110 d）暴露于PFDoA（0.02、0.2、0.5 mg·kg-1·d-1）會降低睪丸StAR、CYP11A1蛋白水平，但不影響類固醇5α-還原酶1、3-α 羥基類固醇脫氫酶和CYP19A1［60］。0.2、0.5 mg·kg-1PFDoA 還會通過增加脂質過氧化和降低超氧化物歧化酶活性來誘導睪丸組織發生氧化應激，并通過抑制H-ATP酶和細胞色素C 氧化酶來破壞線粒體呼吸［61］；進一步研究發現細胞分裂周期基因2 的磷酸化活性降低可能與PFDoA 誘導的睪丸毒性有關［62］。使用小鼠原代Leydig 細胞和mLTC-1 細胞，發現PFDoA 通過增加活性氧水平抑制Star啟動子活性及其mRNA 和蛋白表達［63］。

給予懷孕Parkers 小鼠（孕12 d 至分娩）PFNA（0、2、5 mg·kg-1·d-1）并留取雄性后代至出生后第3天，發現PFNA通過下調睪丸Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b3、Wt1和Nr5a1表達抑制T合成，并降低出生后3 d雄性后代的胰島素樣因子3 的表達［64］。Singh 等［65-67］在隨后的進一步研究中發現，短期（出生后25～38 d）和長期（出生后25～114 d）的PFNA 暴露，均會誘導Parkers小鼠睪丸發生氧化應激反應，抑制抗氧化反應以及類固醇激素合成，從而抑制生殖細胞增殖，促進細胞凋亡。Feng 等［68］研究證明，5 mg·kg-1·d-1PFNA 處理大鼠兩周會降低血清T 水平，升高E2水平，生精細胞有顯著的凋亡特征，且認為這種凋亡可能與Fas 死亡受體依賴性凋亡途徑有關。

由此可見，PFAS 可以通過不同機制在雄性動物體內誘發生殖毒性。主要機制涉及誘導細胞氧化應激反應，影響腦-垂體-性腺軸，影響支持細胞緊密連接蛋白，以及多途徑影響類固醇合成酶等，導致雄性生殖系統細胞凋亡，血睪屏障通透性增加，睪酮水平降低等。然而，動物研究主要集中在PFOS、PFOA、PFNA、PFDoA 4種物質上，沒有考慮化學物之間的聯合作用。

4 總結與展望

目前，PFAS 普遍存在各種環境介質中，人群通過多種途徑接觸PFAS。盡管我國生態環境部在2019年3月發布公告，禁止PFOS 及其鹽類和全氟辛基磺酰氟除可接受用途外的生產、流通、使用和進出，該措施仍未嚴格限制PFOS 的生產使用，且沒有關于PFOA 的相關限制舉措，所以人群對于PFAS 的認知水平非常有限。在人群流行病研究中，盡管研究結果并不完全一致，但大多數研究發現PFAS 會對女性生殖功能產生不利影響，包括擾亂月經周期，干擾激素正常水平，增加不孕風險；對于男性，研究表明PFAS 與男性精子質量下降、T 水平降低有關。但目前的研究大多限于幾類常用的PFAS，對于PFAS 的替代產品的研究較少，也沒有考慮PFAS 共暴露的影響，并且大樣本隊列研究均來自國外，國內的相關研究還較為有限。因此，在以后的研究中應該更加關注本國的污染情況以及人群的暴露水平，擴大研究多種類的PFAS 以及新型替代物與人群生殖功能的關聯，同時探索PFAS 共暴露對生殖健康的影響。

在動物研究中，機制的探討主要涉及誘導細胞氧化損傷，影響下丘腦-垂體-性腺軸，通過多種途徑影響類固醇激素的合成等，但由于動物實驗往往是單物質暴露（多是PFOS 和PFOA），以及PFAS 在體內發揮毒性作用的閾值沒有明確的界定，所以不同研究的劑量有所區別。因此，在往后的研究中應擴大劑量范圍，深入研究效應機制，探討是否具有聯合毒性作用、多代效應以及可行的干預保護措施。