黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的系統藥理學分析

董書偉　樊靈芝　李磊　王海峰　朱海鯨　翟軍軍　屈雷　王勝義

董書偉（1980-），博士，副教授，主要從事牛羊疾病防治及中獸藥研究工作，曾赴德國、愛爾蘭、匈牙利和肯尼亞等國家開展牛病科研合作學術交流活動。先后主持國家自然科學基金項目、甘肅省科技計劃項目及榆林市科技計劃項目等科研項目4項;作為主要完成人參與國家級或省部級科研項目8項。以第一作者或通訊作者在《BMC Veterinary Research》《中國農業科學》《畜牧獸醫學報》《南方農業學報》等國內外核心期刊上發表學術論文20篇，參編出版著作2部，申請國家專利20項，成功研制出國家三類新獸藥3個;獲農業農村部農牧漁業豐收獎二等獎1項、甘肅省科技進步獎三等獎1項;被中國畜牧獸醫學會評為2015年度優秀牛病科研工作者。

摘要：【目的】利用系統藥理學構建黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的活性化合物—靶點—通路—疾病相關蛋白的關系網絡模型，闡述黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的分子機制，為犢牛腹瀉防治藥物研發提供理論依據?！痉椒ā扛鶕诜枚龋∣B）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，利用中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）檢索黃白雙花口服液中每味中藥（黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅）的活性化合物及與其相對應的作用靶點，導入Cytoscape繪圖軟件中建立活性化合物與其對應靶點的互作網絡圖;通過基因數據庫（Gene Cards）檢索犢牛腹瀉的有關靶點基因，使用維恩圖求取二者的交集，得到犢牛腹瀉與黃白雙花口服液共同的靶點基因組合，然后導入String數據庫中以獲得相關蛋白相互作用網絡圖;將黃白雙花口服液作用于犢牛腹瀉的靶點基因導入DAVID數據庫中，分別進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析?！窘Y果】從黃白雙花口服液中篩選出43種活性化合物，分別對應131個相關靶點基因。黃白雙花口服液與犢牛腹瀉交集的蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖包括128個節點及205條相互關系，其中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、促分裂素原活化蛋白激酶1（MAPK1）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）的出現頻率較高。利用DAVID數據庫對黃白雙花口服液與犢牛腹瀉交集靶點的蛋白進行GO功能富集分析，最終富集到204條GO功能條目（FDR<10-2），其中細胞組成條目8條、分子功能條目12條、生物過程條目184條;黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的相關蛋白主要富集于19條信號通路上（FDR<10-2）?！窘Y論】黃白雙花口服液主要以黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇及山奈酚等活性化合物成分，通過ATK1、MAPK1、IL-2、IL-6和IL-8等靶點，經Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、T細胞受體信號通路和B細胞受體信號通路等，發揮抗菌消炎、抑制細胞損傷及調節免疫力等作用，以達到治療犢牛腹瀉的目的。

關鍵詞： 黃白雙花口服液;系統藥理學;犢牛腹瀉;活性化合物;靶點;信號通路

中圖分類號： S858.23? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）01-0001-10

Abstract：【Objective】Based on systematic pharmacology， a network of active compound， target， pathway and di-sease-related protein of Huangbaishuanghua oral liquid was established to elucidate the molecular mechanism of treatingdiarrhea in calves， and to provide the theoretical basis for research and development of drugs for the prevention and treatment of diarrhea in calves. 【Method】According to oral utilization（OB）≥30%? and drug-likeness（DL）≥0.18， using traditional Chinese medicine pharmacology （TCMSP） database retrieval and double liquid medium every taste traditional Chinese medicine（Coptidis Rhizoma，Pulsatilliae Radix，Lonicerae Japonicae Flos，Scutellariae Radix，Radix Sanguisorbae and Mume Fructus） of the active compounds and corresponding targets， imported into Cytoscape drawing software to establish active compounds and their corresponding targets interactions network diagram. The target genes of calf diarrhea were retrieved through Gene Cards database， and the intersection of the two was obtained by Venn diagram. The target gene combination of calf diarrhea and Huangbaishuanghua oral liquid was obtained， and then imported into the String database to obtain the network diagram of the interaction of related proteins. The target genes of Huangbaishuanghua oral liquid on diarrhea of calves were imported into DAVID database for GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis， respectively. 【Result】Forty-three active compounds were screened from Huangbaishuanghua oral Liquid， corresponding to 131 related target genes， respectively.Huangbai Shuanghua Oral Liquid and calf diarrhea intersection protein-protein intera-ction network diagram includded 128 nodes and 205 relationship， among them， serine/threonine protein kinase 1（AKT1）， interleukin 2（IL-2） and interleukin 6（IL-6） and interleukin 8（IL-8）， promote the mitogen activated protein kinase 1 （MAPK1） and aspartic acid with cysteine proteinase 3（CASP3） had high occurrence frequency. The GO function enrichment analysis of the proteins at the intersection target of Huangbaishuanghua oral liquid and diarrhea of calfs was conducted using DAVID database. Finally， 204 GO functional items（FDR<10-2） were enriched， including 8 cell composition items， 12 molecular function items and 184 biological process items. The related proteins of Huangbaishuanghua oral liquid in the treatment of diarrhea in calves were mainly enriched in 19 signaling pathways（FDR<10-2）. 【Conclusion】Huangbaishuanghua oral liquid mainly use quercetin， β-phytosterol， stigstanol and kaempferol from Coptidis Rhizoma，Pulsatilliae Radix，Lonicerae Japonicae Flos，Scutellariae Radix，Radix Sanguisorbae and Mume Fructus. Through ATK1， MAPK1， IL-2， IL-6 and IL-8 and other targets， it can play antibacterial and anti-inflammatory roles， inhibit cell damage and regulate immunity through Toll-like receptor signaling pathway， NOD receptor signaling pathway， T cell receptor signaling pathway and B cell receptor signaling pathway， to achieve the purpose of treating calf diarrhea.

Key words： Huangbaishuanghua oral liquid; systematic pharmacology; calf diarrhea; active compound; target; signal pathway

Foundation item： Youth Fund Project of Natural Science Foundation of China（31502113）; Yulin University High Level Talents Research Project （18GK10）

0 引言

【研究意義】犢牛腹瀉是由病原微生物感染、消化不良及飼養管理不當等多種復雜因素引發的一種常見疾?。↙ee et al.，2019），其主要臨床表現為排稀薄或水樣糞便，呈黃色或白色，有惡臭，甚至含有黏膜或便血等（武瑞萍，2017），且傳染性強（楊保軍，2010），通常發病率高達68.6%、死亡率為8.89%（田密，2019），給養殖戶帶來巨大經濟損失。因此，研究犢牛腹瀉防治技術對保障養牛業持續健康發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】引起犢牛腹瀉的主要病原有輪狀病毒（Rotavirus）、牛諾如病毒（Bovine norovirus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、隱孢子蟲（Cryptosporidium）和籃氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）（Chae et al.，2019;師志海等，2020），其中又以隱孢子蟲感染最嚴重（Riggs and Schaefer，2020）。目前，抗生素仍是臨床獸醫治療動物疾病的常用藥物（Kr?mker and Leimbach，2017），但長期使用抗生素極易導致耐藥菌株的出現及動物體內抗生素殘留（Gudiol，2010），進而危及動物和人類的健康。中藥不僅具備抗菌消炎及調控機體自身免疫等作用，還具有療效好、低毒、低殘留、環保和不易產生耐藥性等優點（王文曉等，2020）。焦桂蘭等（2001）將川黃連、紫花地丁、灶心土、白術、藕節、澤夕和茯苓配成方劑，研成細末后用溫水沖服，在36例犢牛腹瀉中的治愈率達97.2%。江偉等（2010）選用成藥白頭翁散及白頭翁、黃連、秦皮、板藍根、蒲公英、石榴皮和訶子等7味中藥提取物進行藥敏試驗，結果顯示白頭翁散的抑菌效果明顯，是治療犢牛腹瀉穩定性較高的藥劑。李繼昌等（2011）采用烏梅、黃梅和白術等中藥制備而成的烏連顆粒劑治療細菌性犢牛腹瀉，結果顯示其治愈率為88.46%，具有良好的治療效果。倫艷霞等（2013）將金銀花、黃芩、連翹、烏梅和白術等9味中藥組成復方治療犢牛腹瀉，結果表明該中藥復方制劑對犢牛腹瀉的療效要優于西藥乙酰甲喹。根據中獸醫基礎理論和辨證施治原則，可將犢牛腹瀉分為熱痢和寒痢。針對熱痢，以白頭翁和黃連為君藥、金銀花和黃芩為臣藥、烏梅和地榆為佐藥、葛根為使藥，諸藥合用，能達到清熱燥濕、涼血止痢、澀腸止瀉及健脾和胃的功效，制備成口服液，臨床治療犢牛腹瀉的治愈率達83.6%，有效率為96.4%（董書偉等，2010）。經藥效學研究證實，該中藥制劑具有抗炎、鎮痛、止瀉和調節免疫等作用（王勝義等，2011）;經毒理學研究發現，該中藥制劑為實際無毒，且對其主要有效活性成分進行定性和定量分析，制定質量標準及篩選出最佳制備工藝（王勝義，2010），最終成功研制出防治犢牛腹瀉的純中藥制劑——黃白雙花口服液，并榮獲國家三類新獸藥證書（中華人民共和國農業部公告 第1959號）。黃白雙花口服液的臨床應用效果顯著，市場反應良好，但發揮作用的分子機理尚不清楚，進而影響其推廣應用?！颈狙芯壳腥朦c】系統藥理學是綜合系統生物學與中藥藥理學的新方法和新理論（Yu et al.，2017;王艷艷等，2019），通過生物信息學分析中藥有效成分與藥物靶點和疾病靶點間的關系，并建立相互作用的網絡圖，以闡明中藥在疾病治療過程中發揮作用的分子機制。系統藥理學具有整體性、系統性的特點，與中醫藥辨證論治的整體思想不謀而合，能在詮釋中藥活性化合物和作用靶點、闡明作用機制、預測新的并發癥、發現中藥組效關系及尋找新藥等方面發揮重要作用（Zhang et al.，2013;趙雨靚等，2020）。因此，通過系統藥理學分析可闡明黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的作用機制?！緮M解決的關鍵問題】以黃白雙花口服液和犢牛腹瀉為研究對象，利用系統藥理學構建黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的活性化合物—靶點—通路—疾病相關蛋白的關系網絡模型，進一步闡述其發揮作用的分子機制，也為犢牛腹瀉防治新藥的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

黃白雙花口服液主要原料包括黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅等，在蘭州黃河中藥材市場購買原材料后，按一定比例混合，加水浸泡，煎熬3次后濃縮至每毫升含1 g原材料，然后灌入備好的安瓿瓶中，每瓶100 mL，置于陰涼處封存備用，并根據質量標準進行檢測（王勝義，2010）。

1. 2 所用數據庫

利用在線數據庫及相關軟件進行系統藥理學分析，主要包括系統藥理學數據庫（http：//tcmspw.com，TCMSP）、Uniprot數據庫、DAVID數據庫、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數據庫、蛋白質互作網絡數據庫（String）、基因數據庫（Gene Cards）、中國知網（CNKI）、萬方數據庫（Wanfang Data）及Cytoscape繪圖軟件。

1. 3 復方中藥活性化合物—靶點網絡圖構建

利用TCMSP數據庫檢索黃白雙花口服液中每味中藥（黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅）的所有活性化合物，并篩選出與活性化合物相對應的靶點，參數設置為口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18。將符合條件的每味中藥活性化合物及其所對應靶點下載后，導入Cytoscape繪圖軟件，建立活性化合物與對應靶點的互作網絡圖。OB是藥物篩選非常重要的要素，活性化合物的OB越高，說明其越具有進一步治療疾病的可能性（黃超，2015）;DL是判斷成藥可能性的重要依據（Vinotha and Sundar，2019）。

1. 4 蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖構建

將上述篩選到的藥物靶點上傳至Uniport數據庫，物種選擇為Bos Taurus，得到中藥活性化合物作用于犢牛體內的所有靶點，并利用Gene Cards數據庫檢索犢牛腹瀉的有關靶點基因。將Uniport數據庫檢索得到的黃白雙花口服液相關活性化合物靶點與Gene Cards數據庫檢索得到的犢牛腹瀉相關基因，使用維恩圖求取二者的交集，以獲得犢牛腹瀉與黃白雙花口服液共同的靶點基因集。將得到的相關靶點基因導入String軟件，物種選擇為Bos Taurus，即得到黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉相關蛋白的相互作用網絡圖。

1. 5 靶點基因GO功能富集及KEGG通路富集分析

將黃白雙花口服液作用于犢牛腹瀉的靶點基因導入DAVID數據庫中，物種選擇為Bos Taurus，分別進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，篩選結果后導出（FDR<10-2）。

2 結果與分析

2. 1 復方中藥活性化合物—靶點網絡圖

在TCMSP數據庫中篩選出43種符合條件的活性化合物，并得到其對應靶點，將得到的數據導入Cytoscape繪圖軟件，建立化合物與對應靶點間的網絡圖（圖1），共發現32種活性化合物節點、229個靶點節點和679條邊，每種活性化合物平均與21.2個靶點存在互作關系，每個靶點平均與7種活性化合物存在互作關系，說明黃白雙花口服液在治療犢牛腹瀉過程中存在多成分、多靶點的特征，連接較多靶點及活性化合物的節點分子在治療犢牛腹瀉疾病中發揮重要作用;也存在多個靶點對應1種活性化合物，體現了復方中藥多途徑的作用機制。從活性化合物的角度來看， Degree>10的活性化合物有11種，靶點Degree>50的活性化合物有3種（表1）。其中，槲皮素的連接度最高，能與342個靶點相連接，其次是β-谷甾醇和豆甾醇等。從靶點的角度來看，連接活性化合物Degree>5的靶點有32個，分別是雌激素受體（ESR1）、去甲腎上腺素轉運體（SLC6A2）、一氧化氮合酶2（NOS2）及α1腎上腺素（ADRA1B）等（表2）。

2. 2 復方中藥成分作用于犢牛腹瀉的蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖

將通過Gene Cards數據庫檢索得到與犢牛腹瀉相關的2804個靶點基因與Uniport數據庫中黃白雙花口服液的200個相關活性化合物靶點，使用維恩圖求取二者的交集，共得到131個相關靶點基因（圖2）。利用String數據庫建立復方中藥各活性化合物靶點的蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖（分值大于0.9），結果（圖3）顯示該網絡圖包括128個節點和205條相互關系，其中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、促分裂素原活化蛋白激酶1（MAPK1）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）的出現頻率較高，故推測這些蛋白在黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉過程中發揮重要作用。

為了更直觀地反映黃白雙花口服液與犢牛腹瀉的交集靶點與活性化合物間的關系，將其在String數據庫和TCMSP數據庫中的蛋白質與復方中藥活性化合物的相互作用關系導入Cytoscape繪圖軟件，即得到活性化合物與交集靶點的關系網絡圖（圖4）。

2. 3 GO功能富集分析結果

利用DAVID數據庫對交集靶點的蛋白進行GO功能富集分析，得到204條GO功能條目（FDR<10-2）。其中，細胞組成條目8條（圖5），包括細胞外區域部分（Extracellular region part）、細胞外空間（Extracellular space）、細胞質（Cytosol）和細胞成分（Cell fraction）等;分子功能條目12條（圖6），包括配體依賴性核受體活性、類固醇激素受體活性、藥物結合、血紅素結合、四吡咯結構結合、同一蛋白質結合（Identical protein binding）、酶結合（Enzyme binding）、脂質結合（Lipid binding）和蛋白質聚合活性（Protein dimerization activity）等;生物過程條目184條，具體為細胞增殖（Regulation of cell proliferation）、細胞程序化死亡調控（Regulation of programmed cell death）、細胞死亡調控（Regulation of cell death）、對有機物質的響應（Response to organic substance）及對細胞程序死亡的負調控（Negative regulation of programmed cell death）等，圖7是前10種生物過程條目。

2. 4 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集分析結果（表3）表明，黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的相關蛋白主要富集在19條信號通路上（FDR<10-2），包括膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌和p53等癌癥相關通路（Pathways in cancer），還涉及炎癥相關的Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、免疫相關的T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）及B細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）等。

3 討論

本研究利用TCMSP數據庫，根據OB和DL篩選出黃白雙花口服液中6味中藥活性化合物的作用靶點，并通過String、Cytoscape和DAVID數據庫構建黃白雙花口服液活性化合物—靶點網絡圖及復方中藥成分與犢牛腹瀉的蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖，解析黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的作用分子機制，也進一步印證中藥復方“多成分—多靶點—多通路”治療疾病的理論。

黃連和白頭翁是黃白雙花口服液中的君藥，治腹瀉的主證。黃連含有槲皮素、氫化小檗堿和黃連素，其中，槲皮素具有抗氧化、抗細胞凋亡及免疫調節等作用（Li et al.，2016;Mlcek et al.，2016），氫化小檗堿能有效抑制大腸桿菌和腸球菌類病原菌的生長，同時具有抗腫瘤等多種藥理活性作用（黃祖良等，2002;Zou et al.，2017）;黃連素的主要作用是抗炎、降血糖和降血脂（Ma et al.，2017）。白頭翁含有β-谷甾醇和豆甾醇，均屬于類固醇，類似于甾體類激素，具有良好的抗炎作用，還可降低血液膽固醇、抗氧化、免疫調節及促生長等（Antwi et al.，2018;汪帥等，2019）。此外，黃白雙花口服液中的金銀花、黃芩、地榆和烏梅等原料含有山奈酚、異鼠李素和黃芩素等活性化合物。山奈酚不僅能抑制凋亡相關蛋白及信號通路蛋白的表達（Wu et al.，2018），還具有抗癌、治療糖尿病和骨質疏松等藥理作用（趙妍，2013）;異鼠李素具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等作用（Gao et al.，2017）?？梢?，黃白雙花口服液主要是利用上述各種化合物的活性作用，通過多靶點、多通路發揮抗菌消炎、抗氧化及免疫調節等作用，以達到治療犢牛腹瀉的目的。

本研究通過分析黃白雙花口服液中與腹瀉相關基因的相互作用網絡，結果發現AKT1、MAPK1、IL-2、IL-6和IL-8為關鍵蛋白，故推測黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉是通過這些蛋白發揮作用。AKT1可通過調節葡萄糖的攝取和轉運以抑制細胞凋亡及促進細胞增殖（Yamashita et al.，2001）;MAPK1為MAPK信號通路中重要的蛋白家族成員，對細胞增殖與分化均起關鍵作用（Yoon and Seger，2006）。因此，推測黃白雙花口服液可能是通過調控AKT1和MAPK1蛋白表達，抑制胃腸道黏膜上皮細胞凋亡，并促進其增殖，從而修復黏膜損傷。IL-2、IL-6和IL-8是炎癥過程的趨化因子，是機體抵御炎癥的調節因子。本研究中的KEGG通路富集分析結果也表明，黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉的相關基因主要富集在Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和癌癥相關通路上，推測黃白雙花口服液也參與調控機體的炎癥反應。Toll樣受體是一類模式識別受體，可對相應的病原體進行識別和結合，并向胞內傳遞信號，誘導IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ等多種炎癥因子表達，在病原體入侵早期階段即啟動天然免疫;在感染后期階段，還可促進樹突狀細胞的分化，啟動獲得性免疫，共同參與抗感染過程（徐?；ê蛯O蓬明，2020）。T細胞受體能特異性識別MHC細胞表面提呈的抗原肽，并向細胞內部傳遞信號，誘導酪氨酸激酶活化，促進信號傳遞復合物組裝，活化下游MAPK、PKC及鈣離子等信號途徑，最終調控效應蛋白分子表達，激活機體的天然免疫（梁靜靜等，2016）。B細胞受體介導B細胞的活化，激活機體的體液免疫及分泌特異性抗體，從而中和病原微生物。因此，在黃白雙花口服液治療犢牛腹瀉過程中，T細胞受體信號通路和B細胞受體信號通路分別參與機體天然免疫及體液免疫的激活過程。

綜上所述，黃白雙花口服液中的活性化合物是通過抑制胃腸道黏膜損傷，參與機體炎癥反應和調控免疫機能等生物學過程，從而達到治療犢牛腹瀉的目的，即黃白雙花口服液是通過多靶點、多通路來發揮藥理作用，與前期的藥理學研究結果（王勝義等，2011）相吻合。

4 結論

黃白雙花口服液主要以黃連、白頭翁、金銀花、黃芩、地榆和烏梅中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇及山奈酚等活性化合物成分，通過ATK1、MAPK1、IL-2、IL-6和IL-8等靶點，經Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、T細胞受體信號通路和B細胞受體信號通路等，發揮抗菌消炎、抑制細胞損傷及調節免疫力等作用，以達到治療犢牛腹瀉的目的。

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（責任編輯 蘭宗寶）