摻鍶磷酸鈣骨水泥材料生物學性能的動物實驗

王京旗，王 霄

(1.北京大學第三醫院口腔科， 北京 100191; 2.海南醫學院第二附屬醫院口腔科， ?？?570311)

牙周病是口腔兩大類主要疾病之一，在世界范圍有較高的患病率。重度牙周炎已成為全球第6大疾病，是導致成年人牙齒喪失的主要原因。牙周病的特征性損害是牙齒周圍牙槽骨的吸收，從而進一步導致牙齒松動、移位，甚至脫落。牙周病治療的重要目標是使被牙周病破壞的牙周附著再生，形成新的牙槽骨、牙骨質及功能性排列的牙周韌帶，更好地恢復牙齒的生理功能。而在上述牙周組織重建過程中，牙槽骨再生是最重要的，因為牙槽骨的高度決定了牙齒的松動程度。目前所使用的引導組織再生技術是在缺損的牙槽骨部位填充骨粉或相應的骨替代材料，引導骨組織的再生以及牙周組織的再生。常用的牙槽骨缺損修復材料(如骨粉)大多為顆粒狀或塊狀，而牙周炎形成的骨缺損形態極為復雜，一旦形成水平缺損則很難以顆粒狀的材料修復，并且大多數人工合成材料抗水性能不足，從而導致引導組織再生術的手術適應證很有限，限制了骨粉的應用。

傳統的磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)具有一定的可塑性，通過兩種或兩種以上磷酸鈣粉末加上調和劑，調成糊狀后置入修復部位，最終可自行轉化為與人體骨結構相似的羥基磷灰石，但在臨床使用中CPC存在一些缺點，主要表現在抗水性能不足，抗壓性能差(固化反應后可達到最大的抗壓強度只有30～40 MPa，有的僅為5 MPa)，且固化時間長，一般需要30 min才能固化成型，不便于手術操作。

本研究研發的骨替代材料是一種新型的摻鍶磷酸鈣骨水泥，通過改良材料的粉劑、液劑的成分與分布，以提高傳統CPC的物理機械性能，其中固化體抗壓強度擬提高至35 MPa及以上,凝固時間縮短(15～20 min),同時提高抗潰散性流動性及可注射性。鍶(Sr)是人體中存在的一種微量元素，Sr與Ca同族，具有許多相似的性質，已有研究表明[1-2]，鍶同時具有抑制骨吸收和促進骨形成的雙重作用。將鍶摻入磷酸鈣骨水泥中，獲得含鍶磷灰石產物，既可保持骨水泥諸多優點，又可充分發揮鍶的生物學性能，抗壓強度高，穩定性好，同時具有良好的生物相容性，可引導骨的再生。

本課題組前期已通過體外實驗證實本材料無細胞毒性[3]，具有良好的生物相容性。同時，材料的抗壓強度高，穩定性好，可以在手術中短時間內成型、固化，使材料可以穩固地存在于所需骨缺損位置，形成所需要的形態，并保持穩定，具有良好的空間維持能力和機械穩定性。本研究通過構建兔后腿股骨外側髁骨缺損動物模型，對新型磷酸鈣骨水泥CPC的生物相容性以及成骨效果進行組織學評價，從而為臨床的進一步應用提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔，雄性，6月齡，體質量3.0～3.5 kg，共30只，由北京芳緣動物養殖場提供。

1.2 主要實驗試劑

4%(體積分數)多聚甲醛購自北京索萊寶有限公司，磷酸鹽緩沖液購自福州邁新生物技術開發有限公司，山羊血清購自北京金杉中橋生物技術有限公司，COL-Ⅰ和BMP-2單克隆抗體均購自美國Abcam公司，DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶有限公司，胰蛋白酶、胃蛋白酶和鼠兔通用型二抗均購自福州邁新生物技術開發有限公司，Bio-Oss骨粉購自瑞士Geistlich公司。

1.3 主要儀器設備

ASP200 自動脫水機、石蠟切片刀片和石蠟組織切片機均購自德國Leica公司，電烤箱購自上海?，攲嶒炘O備有限公司，光學顯微鏡(BX61)和體視顯微鏡均購自日本OLYMPUS公司，電熱恒溫干燥箱購自天津泰斯特儀器有限公司，生物組織包埋機購自孝感宏業醫用儀器有限公司。

1.4 實驗設計和分組

實驗動物為新西蘭大白兔，共30只。以其雙后腿外側髁(60個)為實驗對象，隨機分為CPC組、CPC+Bio-Oss組、Bio-Oss組、空白對照組4組。在兔雙側后腿外側髁制造骨缺損模型，按組別分別植入CPC、Bio-Oss骨粉、CPC+Bio-Oss混合物(CPC與Bio-Oss質量比為4 ∶1)。實驗動物分別在手術第4周、第12周、第24周處死。

1.5 材料制備

CPC組：將新型磷酸鈣骨水泥材料按粉液質量比2 ∶1調配，注入直徑6 mm，深7 mm的圓柱形模具中(材料、模具均由北京安泰生物醫用材料有限公司提供)， 固化20 min后取出，紫外線滅菌2 min后無菌存放。

CPC+Bio-Oss組：方法同上，其中CPC與Bio-Oss質量比為4 ∶1。

Bio-Oss組：手術中Bio-Oss骨粉直接植入骨缺損。

1.6 手術方法

0.5%(質量分數)戊巴比妥耳緣靜脈注射全身麻醉，劑量0.1 mg/kg。取股骨下端外側髁為術區，待麻醉藥生效后，備皮消毒。將兔后腿彎曲，于髕骨下端1 cm處做3 cm長縱向切口，切開皮膚、皮下筋膜，分離骨膜，生理鹽水沖洗，用直徑5 mm的輪狀車針制備直徑6 mm、深7 mm圓形骨缺損，按照分組植入相應材料，與骨面平齊。分層嚴密縫合骨膜及軟組織。肌肉注射40萬U青霉素G 1 mL。

術后第4周、第12周、第24周各處死動物10只，取材(缺損植入區及周圍5 mm骨組織)進行相關檢測。

1.7 觀察指標

1.7.1組織形態學觀察 將動物處死后，剝離骨缺損區周圍軟組織，切鋸股骨下端3 cm骨組織，4%(體積分數)多聚甲醛溶液4 ℃固定1周。從固定液中取出固定組織，EDTA脫鈣液脫鈣8周后將組織分切(保留缺損植入區及周圍5 mm骨組織)，繼續脫鈣8周，進行30%～100%梯度乙醇溶液(酒精)脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制作4 μm連續組織切片， HE染色。各組各時間點光學顯微鏡下觀察切片，并在每一個切片內選擇10個區域。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus(Media Cyber-netics，美國)分析測量新骨生成率(bone ingrowth fracion, BIF，BIF=新骨面積/骨缺損面積×100%)。

1.7.2免疫組織化學染色觀察 取術后4周標本常規石蠟切片，脫蠟水化后PBS(pH=7.4)洗5 min，共3次。滴加胃酶修復液，37 ℃烤箱修復15 min，PBS洗5 min，共3次。滴加 3%(質量分數)過氧化氫，室溫下避光孵育15 min，PBS洗5 min，共3次。10%(體積分數)山羊血清37 ℃封閉30 min，擦干周圍血清。滴加BMP-2單克隆抗體(1 ∶250)，4 ℃過夜，PBS洗5 min，共3次。滴加二抗，37 ℃下孵育30 min，PBS 洗5 min，共3次。滴加新鮮配置的DAB溶液顯色，光鏡下控制顯色時間。蘇木素復染，沖洗，梯度乙醇溶液脫水，透明，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察，每一個切片內選擇10個區域，以細胞質或細胞間質出現黃染為陽性標記，利用圖像分析軟件Image-Pro Plus測定免疫組織化學染色圖像陽性區域的平均光密度(mean optical density，MOD)。

1.8 統計學分析

應用SPSS19.0統計軟件，計量資料采用單因素方差分析，組間差異多重比較采用LSD檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體標本觀察

術后定期觀察動物飲水、進食、活動，注意傷口有無腫脹、化膿、積液等炎性反應。實驗動物術后1 h蘇醒，1 d后飲水進食活動及情況正常，傷口均一期愈合，無意外死亡，未見骨折。

第4周時，肉眼觀察植骨部位未見材料暴露，軟組織未見積液、膿腫等免疫排斥及感染跡象。骨缺損邊界可辨認，有纖維包膜覆蓋，植骨處較周圍骨質略凹陷。CPC組、CPC+Bio-Oss組、Bio-Oss組均可見材料開始降解，少量新生骨覆蓋；空白對照組骨缺損區纖維包膜下尚無骨質形成。第12周時，CPC組、CPC+Bio-Oss組、Bio-Oss組材料大部分降解，大量新生骨長入；空白對照組骨缺損處肉芽組織覆蓋，周圍少量皮質骨形成，仍較周圍骨質凹陷。第24周時，CPC+Bio-Oss組、Bio-Oss組股骨外側髁骨缺損區被新生骨質完全覆蓋；CPC組骨缺損處大部分新生骨質覆蓋，骨缺損邊界模糊；空白對照組骨缺損處較周圍骨質略凹陷。

2.2 組織形態學觀察

第4周(圖1)：CPC組可見植入物與原有骨組織的交界處有少量新骨形成，殘留材料被新生骨包繞，成骨細胞活躍，呈極性成排排列，成骨細胞旁可看到粉染的類骨質；Bio-Oss組可見較多新生骨小梁向骨缺損中心區長入，Bio-Oss顆?？紫吨車梢娦律?，里側為膠原纖維結構，鈣鹽逐漸向外沉積，形成骨基質；CPC+Bio-Oss組骨缺損自邊界至中心可見不規則的骨小梁長入，稀疏，部分連接，骨小梁間可見骨髓細胞與脂肪細胞，植入物孔隙周圍出現活躍的成骨細胞，并有骨陷窩形成，骨陷窩內見骨細胞；空白對照組骨缺損邊界清晰，膠原纖維沿邊界束狀排列，可見大量纖維細胞。

第12周(圖1)：CPC組骨缺損周邊部材料降解吸收明顯，可見較多新生骨小梁，并向骨缺損中心區長入，由內向外可見纖維結締組織逐漸轉化為骨基質；Bio-Oss組可見骨粉孔隙已長入新骨，呈纖維編織狀，大量骨陷窩分布，骨陷窩內見骨細胞；CPC+Bio-Oss組骨缺損中心見更多新生骨小梁生長延伸，類骨質向成熟骨組織轉化；空白對照組骨缺損周邊可見少量無序的新生骨形成。

第24周(圖1)：CPC組缺損周邊部可見更多新生骨小梁，并向骨缺損中心區長入，新生骨組織進一步增多，但中心區仍可見小范圍的空白區；Bio-Oss組和CPC+Bio-Oss組骨缺損區已完全被新生骨組織充滿，新骨、舊骨結合線模糊，可見編織骨轉變為板層骨，骨小梁塑形改建有序排列；空白對照組骨缺損處邊界仍清晰，少量新生骨在骨缺損邊緣形成。

圖1 各組標本HE染色結果(×12.5，×200)Figure 1 Histological sections at different time points of each group bone ingrowth fraction(×12.5，×200)

整個植入期CPC組、CPC+Bio-Oss組、Bio-Oss組3組植入物與周圍骨組織結合緊密，未引起骨缺損區的炎性反應，未見骨組織壞死。

在不同時間點，CPC組、Bio-Oss組、CPC+Bio-Oss組及空白對照組的新骨生成率不同(P<0.01)，其中，CPC組、Bio-Oss組、CPC+Bio-Oss組的BIF均高于空白對照組(P<0.01)； CPC組BIF低于Bio-Oss組(P<0.01)，也低于CPC+Bio-Oss組(P<0.01)；CPC+Bio-Oss組與Bio-Oss組相比差異無統計學意義(圖2)。

*P<0.01.圖2 各組不同時間點新骨生成率比較Figure 2 Bone ingrowth fraction (BIF) at different time points of each group

2.3 免疫組織化學染色結果

免疫組織化學染色發現(圖3)，第4周CPC組、Bio-Oss組、CPC+Bio-Oss組的MOD均高于空白對照組(P<0.01)；CPC組MOD低于Bio-Oss組(P<0.01)， 也低于CPC+Bio-Oss組(P<0.01)，CPC+Bio-Oss組與Bio-Oss組相比差異無統計學意義(表1)。

表1 第4周各組BMP-2與 COL-Ⅰ免疫組織化學染色平均光密度Table 1 MOD of BMP-2 and col-Ⅰ immunohistochemical staining of histological sections at the 4th week

3 討論

骨替代材料的成骨能力表現為骨生成性、骨誘導性和骨傳導性3種特性。常用的骨替代材料包括自體骨、同種異體骨、異種骨和人工合成材料等。自體骨兼有骨誘導性和骨傳導性，并且攜有成骨作用的骨髓細胞，成骨效果最好，但是自體骨來源有限，且取骨可能增加術后感染的風險。異體骨移植存在難以成形及可能傳播疾病等問題。異種骨主要是牛松質骨，由于其結構與人類松質骨非常類似，有著很好的生物相容性和骨傳導性[4-5]。

A, immunohistochemical staining of each group at 4th week(×40，×200); B, MOD of BMP-2 in each group; C. MOD of COL-Ⅰ in each group. *P<0.01.圖3 第4周時各組BMP-2和COL-Ⅰ蛋白表達情況Figure 3 BMP-2 and COL-Ⅰ immunohistochemical staining of histological sections and at 4th week

近年來Bio-Oss骨粉作為異種骨在臨床中應用廣泛，它多取自于牛骨，為天然骨無機材料，它的化學成為碳酸鹽磷灰石結晶體，可被吸收，顆粒直徑0.25～1.00 mm，與人體骨的結構幾乎相同，能夠在各個方向上引導骨再生，具有良好的骨引導性和成骨能力[6-7]。作為國際認可的骨替代材料，很多動物實驗和臨床研究證明Bio-Oss完全符合骨引導材料的標準[8-10]，因此本實驗選擇設立Bio-Oss骨粉組，對于新型磷酸鈣骨水泥的生物學性能檢測具有重要的參考意義。但是Bio-Oss骨粉在臨床操作中也存在一些缺陷，由于其形態為顆粒狀所導致的不可塑性，難以配合牙周手術中骨缺損的不規則性，導致手術難度增加。本課題研發的新型磷酸鈣骨水泥材料CPC具有可注射性[3]，并可在一定時間內固化成形，加入一定量的Bio-Oss骨粉后依然可以保持這種材料學特性，充分發揮了骨水泥的可塑性能，可有效改善Bio-Oss骨粉在臨床操作中不便等缺陷。

本研究發現，CPC在整個植入期與周圍骨組織結合緊密，無纖維組織間隔，同時均未引起骨缺損區的炎性反應，提示CPC具有良好的生物相容性。新骨形成率即新生骨占骨缺損的面積比，是一種常用的新骨半定量分析的指標[11-12]。研究表明生物學因素在新骨形成早期起主要作用，在骨缺損愈合中，骨形成早期的調控作用影響著骨缺損的整個修復過程，進而決定著骨缺損愈合的速度與質量[13-14]。BMP-2和COL-Ⅰ與新骨形成密切相關，在新骨形成早期，BMP-2 主要在骨髓腔基質、增生的骨膜和骨缺損部位的軟組織內活性表達最高[15]。COL-Ⅰ是骨基質中最主要的纖維膠原成分，可為鈣鹽沉積與細胞附著提供支架[16]。當骨缺損出現后，BMP-2會在前3周表達逐漸增強，第3周達到峰值，第4～5周時仍保持此高度，第5周后明顯下降,直至正常水平[17-18]。而COL-Ⅰ在第2周時表達增強，在第4周時仍保持一個明顯的表達高度，第4周后明顯下降。故本研究采用此兩項指標在第4周時的表達情況反映不同組之間骨組織的新生情況。本研究發現，術后第4周、第12周、第24周CPC組、CPC+Bio-Oss組BIF均高于空白對照組(P<0.01),且第4周時CPC組、CPC+Bio-Oss組BMP-2和COL-Ⅰ表達均高于空白對照組(P<0.01)， 提示CPC、CPC+Bio-Oss組可以促進早期成骨，成骨效果穩定，長期有效。

本研究發現CPC組BIF低于Bio-Oss組(P<0.01)，也低于CPC+Bio-Oss組(P<0.01)，提示CPC成骨效果和Bio-Oss骨粉相比仍有一些差距，這可能與二者的孔隙不同有關。材料中孔隙的存在為成骨提供了適宜的空間，材料的孔隙大小應滿足骨單位和骨細胞生長所需的空間。Dahl等[19]發現當材料孔徑為5～40 μm時，允許纖維組織長入；孔徑為40～100 μm時，允許非礦化的骨樣組織長入；孔徑在150 μm以上時，可為骨組織的長入提供理想場所?？紫堵适橇硪粋€影響材料成骨效果的重要因素，孔隙率越大，材料的比表面積越大，與周圍骨的接觸面積也越大，有利于細胞的黏附和生長。本課題組研發的新型磷酸鈣骨水泥材料的孔徑為 80～150 μm，孔隙率為40%，而Bio-Oss骨粉的孔徑約750 μm，孔隙率約65%，這兩個指標的差異可能是造成CPC組BIF低于Bio-Oss組的原因。CPC+Bio-Oss組和Bio-Oss組BIF差異無統計學意義，提示加入CPC可能不會改變Bio-Oss的成骨能力，同時卻可改善Bio-Oss的理化特性，增加抗壓強度，提高可塑性與抗潰散性，適應不規則形態的骨缺損，進而提高臨床操作性能。

綜上所述，本研究通過構建兔后腿外側髁骨缺損動物模型，檢測CPC、Bio-Oss、CPC+Bio-Oss不同時期的新骨形成與第4周 BMP-2、COL-Ⅰ的表達，發現CPC與CPC+Bio-Oss具有良好的生物相容性，可以促進早期成骨，成骨效果穩定，長期有效。CPC+Bio-Oss操作簡單，可塑性強，保證材料成骨性能的同時優化了操作性能，從而為CPC在臨床中的進一步應用提供實驗依據。