NPR1結構與功能的研究進展

閆曉寒 王向堯 劉培源

摘要：病程相關基因非表達子（non-expressor of pathogenesis-related genes 1，簡稱NPR1）作為植物激素水楊酸（SA）信號的主要調節因子，參與系統獲得性抗性（systemic acquired resistance，簡稱SAR）的建立，在植物抵抗病原菌的侵染中起著重要作用。核內單體化的NPR1作為輔因子通過與轉錄因子的相互作用正向調控病程相關（pathogenesis-related，簡稱PR）基因的表達;NPR1的翻譯后修飾與降解也增加了其調節機制研究的復雜性。此外，該蛋白的作用已擴展到對植物生長發育、晝夜節律穩態、內質網分泌相關蛋白以及抗凍等的調控。以NPR1調控建立SAR過程中的機制為重點，綜述其結構特征以及各方面的重要功能，為NPR1蛋白在植物生命活動中潛在作用機制的研究提供參考。

關鍵詞：NPR1;水楊酸;系統獲得性抗性;結構與功能;PR基因

植物暴露在生物與非生物脅迫中，為維持自身的生長發育，進化形成了有效的防御機制用來感知和抵抗各種潛在的威脅。其中，為抵抗病毒、細菌和真菌等的侵染，植物形成了類似于動物的免疫系統。植物免疫系統主要包括2層防御機制，第1層是通過細胞膜上的受體識別病原相關分子模式（PAMPs）激發的免疫反應（PAMP triggered immunity，簡稱PTI）對抗病原菌入侵[1]。然而有些病原菌可產生效應因子抑制PTI，作為應對，植物進化出抗病蛋白（R蛋白），通過直接或間接的方式識別效應因子，進而引發第2層防御，即效應因子激發的免疫反應（effector triggered immunity，簡稱ETI）[2]。ETI通常會引發感染部位細胞的程序性死亡（programmed cell death，簡稱PCD）以阻止病原菌向周圍組織擴散。植物不但會在感染部位通過PTI和ETI抵抗入侵，同時也會系統性激活并建立廣譜的抵抗繼發性感染的防御機制，即系統獲得性抗性（systemic acquired resistance，簡稱SAR）[3]。

NPR1（non-expressor of pathogenesis-related genes 1，簡稱NPR1）是SAR途徑中的關鍵調控因子[4]，同時參與植物的生長發育[5-7]、晝夜節律穩態[8]、抗凍[9]以及內質網分泌相關蛋白[10-11]等的調控，在植物生命周期中發揮著重要作用，然而目前對于NPR1介導信號通路的具體機制還存在許多未知;同時，其同源蛋白NPR3、NPR4在SAR途徑中的作用也存在爭議。本文總結了多年來NPR1調控SAR建立機制的研究結果以及NPR1在其他方面的功能，試圖對NPR1的功能提供一個全面的初步認識。

1 NPR1結構組成及各部分功能

NPR1蛋白包含BTB/POZ（broad-complex，tramtrack，and bric-a-brac/poxvirus and zinc-finger）結構域、錨蛋白重復序列（ankyrin repeats，簡稱ANK）結構域以及NPR1-like結構。序列比對顯示，NPR1蛋白序列在多個物種間呈現出高度的一致性，結構的保守也預示著功能的相似（圖1）。BTB/POZ結構域介導NPR1與其他蛋白的相互作用，以擬南芥為例，NPR1通過BTB/POZ結構域介導與乙烯受體蛋白（ethylene insensitive3，簡稱EIN3）相互作用，阻礙頂端彎鉤的形成[7]。并且NPR1的BTB/POZ結構域可與自身C末端反式激活結構相互作用抑制其功能;當C末端C521和C529通過Cu2+與水楊酸（SA）結合后，引發NPR1構象改變，暴露出BTB/POZ結構域，激活NPR1與TGA轉錄復合體活性， 調控PR基因表達[4]。 但此

結構并不保守，微小的差異也為NPR1針對性參與不同生長環境下的物種獨特的信號通路調控提供了可能。ANK結構域介導NPR1與TGA的相互作用，在ANK突變體中不能形成NPR1-TGA復合體，且無法誘導PR基因[12]。

除此之外，NPR1含有保守的半胱氨酸位點、SA結合位點以及核定位序列（NLS）。擬南芥NPR1包含10個高度保守的半胱氨酸，如C82、C156、C216等。NPR1主要通過半胱氨酸形成分子間二硫鍵以低聚體的形式存在于細胞質中[13];脅迫造成SA濃度升高，導致細胞處于氧化應激狀態，進而產生大量抗氧化劑，硫氧還蛋白（TRX），尤其是TRX-h3與TRX-h5可還原NPR1位于156位的半胱氨酸（C156）促進NPR1低聚體的解聚[14-15]。單體化的NPR1通過NLS介導進入細胞核調控轉錄;同時SA誘導NPR1的C156亞硝基化，穩定了NPR1在細胞質的低聚形式，防止蛋白被過度消耗[15]。C82A/C216A雙突變的NPR1二硫鍵形成受損，一定程度上提升了PR1基因的本底表達[14]。R432被認為是SA的直接相互作用位點，NPR1R432Q突變蛋白表現出極低的SA親和力，在不影響其與TGA和NIMIN1（NIM互作蛋白）相互作用的情況下，NPR1R432Q突變植株SAR相關基因表達受損[4]，進一步說明胞內SA誘導對于NPR1發揮作用的重要意義。

2 NPR1介導的SAR的作用與機制

2.1 NPR1參與調控有效SAR的建立

NPR1是SAR途徑中的關鍵調控因子，NPR1功能缺陷植物的PR基因表達受損，并且幾乎不能建立起有效的SAR。針對擬南芥的研究顯示，為了建立有效的SAR以應對病原菌的感染，NPR1需要在細胞質和細胞核中被精細調控（圖2）。由于NPR1不能直接與DNA相互作用，因此NPR1通常被作為轉錄輔因子參與調控。核定位的NPR1單體與bZIP家族的TGA轉錄因子直接相互作用形成轉錄復合體[16]，增強了TGA轉錄因子結合DNA的能力[17]。PR1啟動子含有正、負2種as-1-like順式作用元件LS7和LS5[18]，不同TGA轉錄因子與不同的順式作用元件相互作用調控PR基因的表達，這表明NPR1也許不僅僅通過上調PR基因的表達來建立SAR。擬南芥基因組編碼的10種TGA轉錄因子中7種在SA信號轉導中起著正向或負向調控作用。TGA2、TGA5和TGA6在調節NPR1依賴基因的表達過程中功能冗余。tga6-1tga2-1tga5-1三敲除突變體在SA誘導的情況下PR基因表達量與野生型相比減少，但其本底表達相較野生型卻升高了近50倍，這表明一些TGA在正常狀態下可抑制PR基因的表達;在SA誘導下，通過與NPR1的相互作用，這種抑制作用被解除。除TGA外，TCP轉錄因子（TCP transcription factors，簡稱TFs）、WRKY與CDK8周期依賴激酶子轉錄因子也參與調控NPR1與PR基因的表達[19-20]。在擬南芥中，SA促進了NPR1與CDK8和WRKY6/18的相互作用。NPR1向自身啟動子招募CDK8和WRKY6/18;此外，CDK8也可與TGA相互作用，NPR1向PR1啟動子招募CDK8和TGA，并將RNA聚合酶Ⅱ帶入啟動子及編碼區域，正調控NPR1和PR1的表達。但NPR1-TF蛋白復合物如何促進PR基因的表達需要進一步的研究來闡明。

另一組與NPR1相互作用的蛋白為NIMIN（nim interacting）蛋白[21]，酵母三雜交結果證明NIMIN1通過直接與NPR1相互作用并與TGA形成三元復合物[22]。NIMIN蛋白序列分析表明其含有預測的EAR（基序）抑制結構域，因此可抑制NPR1轉錄活性[23]。NIMIN1、NIMIN2和NIMIN3與NPR1競爭性結合，在正常狀態下，NIMIN3與NPR1相互作用抑制PR基因的表達;NIMIN2可迅速響應早期SA濃度的改變，盡管其不參與PR基因表達的抑制;NIMIN1可與NPR1相互作用推遲PR基因的表達，防止SAR被過早激活[24]。

2.2 NPR1的翻譯后修飾對SAR的影響

NPR1的翻譯后修飾在SAR過程中同樣扮演著重要角色。擬南芥NPR1除C156的亞硝基化外，還存在泛素化（SUMO）修飾。Saleh等研究表明，SUMO3通過與NPR1的SIM基序（SUMO互作基序）直接相互作用對NPR1進行SUMO化修飾[25]。NPR1的SUMO化不但會促進NPR1的降解，同時也會改變NPR1對WRKY和TGA的親和力。此外，NPR1不同部位的磷酸化也會對SUMO化修飾產生影響。

在正常狀態下，NPR1的S55/S59被磷酸化，這抑制了NPR1的SUMO化，此時NPR1與WRKY70有較強的相互作用，抑制了PR1基因的表達，但依然有少量的NPR1被SUMO化以維持基礎抗性[25]。SA積累后，NPR1的S55/S59去磷酸化，隨后被SUMO化修飾，SUMO化后NPR1的S11/S15位點被磷酸化，在降低了NPR1與WRKY70親和力的同時提升了其與TGA3的親和力，隨后PR1基因的表達量升高，經修飾的NPR1在行使完轉錄調控作用后被送往蛋白酶體降解[25]。NPR1的S55/S59去磷酸化和NPR1的SUMO化是S11/S15發生磷酸化所必需的，S11/S15的磷酸化反過來會促進NPR1與SUMO3的相互作用使更多的NPR1發生SUMO化，這形成了一個信號放大的回路[25]。

一些激酶參與了NPR1的磷酸化修飾。SnRK2.8（SNF-1相關蛋白激酶2.8）通過磷酸化NPR1的S589和T373促進其入核，感染部位周圍的細胞通過感受SA濃度變化建立SAR，而對于遠端組織，由于SA濃度變化較小，SAR主要通過SnRK2.8對NPR1的磷酸化來建立[26]。

2.3 NPR1的降解對SAR的影響

NPR1的精確激活和終止對于維持植物免疫系統功能、機體適應性和繁殖能力之間的平衡至關重要。正常狀態下，少量單體化的NPR1在核內被降解以防止免疫系統被過度激活;在SA積累后，大量單體化的NPR1入核調控下游基因表達的同時這種降解現象依然存在，并且是建立完整有效的SAR所必需的，NPR1S11A/S15A突變的擬南芥中高水平NPR1S11A/S15A的積累可抑制SAR的建立[27-28]，這表明NPR1的降解在植物免疫應答調控中的雙重作用。NPR1的降解需要泛素連接酶Cullin3（CUL3）和信號復合體COP9的參與，與哺乳動物免疫輔助因子IκB一樣，NPR1在降解之前也需要被磷酸化修飾[29]。介導NPR1被26S蛋白酶體降解的2個磷酸化修飾位點為DS11XXXS15（IκB-like phosphodegron motif，S11/S15）。部分研究顯示，NPR1與CUL3并沒有直接相互作用，因此NPR1的降解可能需要中間蛋白 （Adapter）的介導[27，30]。

Fu等研究表明，NPR1的同源蛋白NPR3和NPR4為SA的受體，并且NPR3和NPR4作為中間蛋白介導了NPR1的蛋白酶降解，在無SA的條件下，NPR4介導NPR1與CUL3相互作用，導致NPR1被持續降解，表現為植物對病原菌的易感性增強[30]。在正常狀態下，少量SA的存在降低了NPR4與NPR1的相互作用，這使得NPR1可適當激活免疫基因的表達，以維持植物的基礎抗性。在植物細胞遭受病原菌侵染后，處于感染部位的細胞中SA濃度升高，這時NPR3被SA激活從而介導NPR1與CUL3相互作用，這導致NPR1被大量降解，造成感染部位細胞死亡，同時在感染部位周圍細胞中的SA濃度并不足以激活大量的NPR3，而NPR4又被相對高濃度的SA抑制了活性，核內大量NPR1單體通過與轉錄因子相互作用激活SAR。

3 NPR1參與調控植物生長發育

3.1 NPR1促進葉片的衰老

葉片衰老是一種程序性死亡過程，可將營養物質從衰老的葉片大量轉移到快速發育的器官，從而促進植物生長發育。NPR1介導的SA信號通路正向調控葉片的衰老（圖3），基因組研究表明，隨著葉片衰老的進程，許多轉錄因子顯著上調，如WRKYs[32]。WRKY75在葉片衰老中起正調控作用，其誘導SID2（SA合成基因）表達促進SA的生物合成;同時SA反向促進WRKY75的表達，形成信號放大回路，加速葉片衰老[33]。Chai等提出，在擬南芥葉片衰老中，MPK6介導SA誘導的WRKY6與Trx-h5的表達;WRKY6可與NPR1啟動子W-box結合提高NPR1mRNA的表達水平，同時Trx-h5的表達能促進NPR1的單體化與入核[5]。烯丙苯噻唑（PBZ）可通過SID2依賴的生物合成途徑提高內源性SA水平，外源施加PBZ的sid2和npr1突變株與野生型相比，沒有明顯的衰老癥狀;而過表達NPR1則能加劇葉片的衰老。因此，SA的積累和NPR1的存在是PBZ誘導葉片衰老所必需的。與Xing等觀點不同的是，Zhou等認為，SA誘導的葉片衰老依賴于絲裂原活化蛋白激酶（MKK4/5-MPK1/2）級聯反應，MPK1通過磷酸化NPR1并改變Trx-h3/5的表達能促進NPR1的單體化與入核，調控PR1基因轉錄[8]。NPR1調控SA誘導的葉片衰老的具體機制有待進一步驗證。

3.2 NPR1抑制頂端彎鉤形成

轉錄組學分析顯示，部分SA誘導的基因表達水平在胚軸突出后升高，在子葉完全開放時達到高峰，說明SA參與幼苗早期形態發生[34]。Huang等研究顯示，SA誘導的頂端彎鉤形成抑制部分依賴于NPR1，對擬南芥施加外源SA會造成頂端彎鉤彎曲度的降低，且隨著SA施加濃度的升高，npr1突變體與野生型均表現出抑制作用的加強，但npr1突變體相比野生型抑制較弱[7]。EIN3和EIL1（EIN3-LIKE1）在乙烯通路正向調控頂端彎鉤形成相關基因HLS1（HOOKLESS1，簡稱HLS1）等的表達[35]。NPR1介導的SA對頂端彎鉤形成的抑制依賴于EIN3/EIL1，在乙烯不敏感的2個突變株ein2-5和ein3eil1中，SA濃度的增加對于頂端彎鉤彎曲度沒有明顯改變;且npr1-1ein3eil1與ein3eil1中頂端彎鉤的彎曲度沒有明顯差異[7]。NPR1通過BTB/POZ結構域可以與EIN3含有DNA結合域的N末端相互作用，從而破壞EIN3與自身靶基因啟動子的結合，在不改變EIN3表達量的情況下抑制EIN3的轉錄活性，負向調控頂端彎鉤形成（圖3），也證實了NPR1介導SA-ET（水楊酸-乙烯）信號通路的交互作用[7]。

4 NPR1的其他功能

4.1 NPR1調節植物抗凍性

植物進化出了不同溫度環境下的適應性，鑒定擬南芥冷脅迫下表達上調的基因發現，其中含有植物抵抗病原菌相關的PR基因[36]。作為調控PR基因的關鍵蛋白，NPR1在植物抗凍中的作用同樣得到驗證（圖3）。有研究表明，冷脅迫可以誘導NPR1基因的表達和SA水平的升高，但sid2和 NahG這2種突變植株中NPR1的表達量與野生型植株相比沒有變化，說明NPR1的表達不依賴于SA[9]。與SAR過程類似的是，升高的SA作用于NPR1的單體化，單體化和入核在抗凍相關基因誘導過程中是必需的，抑制單體化或入核的trx-h3trx-h5和snrk2.8-1突變株顯示出抗凍性的降低;與NPR1調控SAR建立不同的是，抗凍調控過程中不需要NPR1的SUMO修飾以及S11/S15磷酸化。核內部分NPR1可與熱休克轉錄因子（HSFA1）結合，調控熱應激反應基因表達;同時，部分NPR1通過與未知轉錄因子結合調控冷脅迫誘導基因的表達，從而提高植物的抗凍能力。此外，冷處理可以在短時間內引起植物對病原菌Pst DC3000抗性的增加，進一步說明了NPR1介導的SA信號通路在SAR與抗凍調節過程中的協同關系[37]。

4.2 NPR1調控植物晝夜節律穩態

氧化還原狀態的改變對于植物晝夜節律和與之相協調的免疫反應有重要的影響[38]。值得注意的是，由免疫信號SA觸發的氧化還原狀態的擾動不僅不損害晝夜節律，反而導致其強化[8]。此外，最近發現植物中SA的含量也存在節律性波動且NPR1單體水平在夜間達到峰值，因此，可能是內源SA波動控制NPR1節律性入核，進而調節相關基因來維持晝夜節律穩態[39]。Zhou等研究表明，SA積累會改變胞內氧化還原環境，并在不改變夜間基因TOC1（timing of CAB2 expression 1）周期表達規律的情況下提高其表達幅度，而npr1和trxh3trx-h5這2種突變體中TOC1表達幅度降低且對SA不敏感，證實了NPR1及其核定位在調控TOC1表達過程中的作用[8]。核內NPR1可以通過TGA與TOC1啟動子結合，誘導其表達。與此同時，NPR1可以以相同的方式誘導日間基因LHY（late elongated hypocotyl）的表達，在晝夜節律調控中LHY與TOC1拮抗，這也解釋了不同時段SA誘導下晝夜節律的穩定性。晝夜節律穩態在維持植物對病原菌在不同時段敏感性方面起著重要作用，與氧化還原、植物免疫一起協同調控使植物可以在夜間優先生長，而在病原菌威脅最大的清晨增強免疫。

4.3 NPR1參與調控內質網相關蛋白的表達

通過分析擬南芥NPR1缺失突變體與過表達體基因表達差異發現，NPR1上調了幾個蛋白質分泌途徑中涉及的基因，包括BiP2、Sec61a、DAD1和CRT3等，這些基因啟動子中大多包含TL1順式元件，該元件與轉錄因子TBF1結合，調控分泌途徑相關蛋白的表達。在sec61a bip2和dad1 bip2這2個雙突變體中均表現為BHT（一種SA類似物）誘導下的PR1蛋白分泌減少和病原菌生長增多;在bip2突變體中，幾個未折疊蛋白反應（unfolded protein response，簡稱UPR）標記基因在BTH處理后被過度激活，且對npr1敏感[10]。因此，NPR1上調分泌相關基因與SAR誘導期間PR蛋白表達量的增加相適應，以保證PR蛋白被充分折疊[10]。除此之外，植物內質網應激反應造成胞內氧化還原狀態的改變，引起NPR1的單體化與入核，通過與轉錄因子bzip28/60結合，在UPR反應后期抑制相關基因的表達，防止UPR的過度激活[11]。

5 展望

NPR1是SAR信號通路調控的關鍵蛋白，在過去多年的研究中，NPR1參與植物免疫相關機制得到初步驗證，并且相關的信號通路在生長發育、抗凍、節律等多個方面的作用以及部分調控機制也逐漸被發現。然而，依然還有很多問題尚未得到解決，在擬南芥NPR1中R432被認為與SA的直接相互作用有關[4]，此外C521/C529可通過Cu2+與SA結合[12]，這就存在2種可能性，其一為R432與C521/529可能在NPR1的三級結構上組成SA的結合位點，其二為NPR1可能包含有多個SA結合位點，SA與不同的結合位點相互作用會調控不同免疫相關基因的表達，對NPR1結構的解析是回答以上問題的關鍵。

NPR1的翻譯后修飾和降解在植物調控應答信號中扮演著重要角色。NPR1在抗凍調控過程中不需要SUMO修飾以及S11/S15磷酸化，并且衰老過程區別于SAR過程中的磷酸化修飾，說明其翻譯后修飾與NPR1不同功能的發揮相關，這可能與各通路SA誘發濃度以及低聚體NPR1的亞細胞定位有關。此外，盡管Fu等提出NPR3/NPR4可根據改變SA的濃度來介導NPR1的降解[30]，但Ding等的研究表明NPR3/NPR4與NPR1并沒有直接相互作用[4]。NPR3/NPR4作為SA受體，與NPR1的功能相反，可直接與TGA相互作用抑制下游免疫相關基因的表達。鑒于翻譯后修飾對NPR1活性以及降解有著重要影響，不同的修飾是否會導致NPR1和NPR3/NPR4功能和相互作用能力的改變是下一步亟需解決的問題。

此外，同源NPR1在多種農作物中已被鑒定出來（圖1），尤其在環保意識強烈的今天，利用基因工程技術培育持久抗病的農作物新品種，以此減少農藥的使用和對環境的污染意義深遠。因此，對NPR1調控機制的深入了解或許會為提升農作物的抗病性和育種提供新的解決方案。

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