增溶策略促非洛地平口服吸收的作用研究

李 強，汪文蝶，賈 悅，鄭宇釗，周建平，殷婷婕

（中國藥科大學藥學院藥劑系，南京210009）

非洛地平（felodipine）是由瑞典Astra公司開發的二氫吡啶類鈣離子通道阻斷劑［1］，普通片于1988年在丹麥首先上市，現已在多個國家用于高血壓的治療［2］。目前，非洛地平上市產品均為口服制劑，據國家食品藥品監督管理局信息，國內市場上，取得生產批文的普通片有7家，緩釋片5家，緩釋膠囊1家，控釋制劑1家。非洛地平屬于BCSⅡ（低溶解性、高滲透性）類藥物［3］，其降壓作用呈劑量依賴性，與血藥濃度呈正相關［4］。其存在首過效應，生物利用度約20%，主要經肝臟代謝腎臟排泄，血漿蛋白結合率約99%［5］。

對于口服制劑而言，溶出度、滲透性和腸吸收機制是決定其生物利用度的關鍵因素［6］。非洛地平是BCSⅡ類藥物的典型代表，其生物利用度嚴重受限于在胃腸道中的溶出度。故非洛地平在胃腸道的溶出和吸收特征直接影響其體內的藥物療效。

本研究通過粉末直壓法將3種不同粒徑原料藥壓制成非洛地平普通片，原料藥粒徑分別為200、150、25μm，并通過納米混懸技術進一步減小粒徑，制備非洛地平納米混懸劑，通過增大溶出比表面積以提高溶出速率；以及通過增溶經典策略——固體分散技術，通過使藥物處于高度分散狀態提高溶出比表面積、同時使藥物以分子或極細膠體、微晶的狀態存在以提高非洛地平的溶解度，最終造成溶出速率顯著增大。另外，本研究對比上述不同制劑在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸4個腸段的吸收特征，考察非洛地平溶出度的提高對于其在腸道的吸收速率、表觀滲透系數、腸道累積吸收量的影響，進而評價增溶策略對非洛地平口服生物利用度的促進機制。

1材料

1.1 藥品與試劑

非洛地平原料藥（98%純度，美國Ark Pharm公司）；乳糖（Super T-ab 11SD，荷蘭DFEPharma公司）；微晶纖維素（安徽山河藥用輔料有限公司）；硬脂酸鎂（湖州展望藥業有限公司）；烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司）；吐溫80（北京益利精細化工有限公司）；交聯聚維酮、泊洛沙姆188（德國BASF公司）；乙腈、甲醇（色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

RC806D溶出試驗儀（廣州航信科學儀器有限公司）；DP30A單沖壓片機（北京國藥龍立科技有限公司）；Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；RF-5301PC熒光分光光度計（日本島津公司）；Malvern Zetasizer Nano ZSE納米粒度電位儀（上海思百吉儀器有限公司）；DSC200F3差示掃描量熱儀（德國耐馳公司）。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0分析處理數據，數據統計結果為xˉ±s，組間比較采用t檢驗。P＜0.05認為具有統計學意義。

1.4動物

SPF級SD大鼠，雌性，體重（200±20）g，由南京市青龍山動物繁殖場提供，合格證號：SCXK（蘇）2019-0002。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2方法

2.1 非洛地平原料藥pH-溶解度測定

高效液相色譜條件：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相甲醇-乙腈-水（50∶15∶35），檢測波長238 nm，流量1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20μL，保留時間26 min。

取過量非洛地平原料藥于pH 1.2、2.2、4.5、5.5、6.8、7.4的純水中，37℃振蕩24 h，離心取上清液，高效液相色譜測定。

取過量非洛地平原料藥于pH 1.2、2.2、4.5、5.5、6.8、7.4的含1.0%十二烷基硫酸鈉（SDS）的溶液中，37℃振蕩24 h，離心取上清液，高效液相色譜測定。

2.2 非洛地平普通片的制備

2.2.1 非洛地平普通片制備方法 取粒徑分別為200、150、25μm的非洛地平原料藥10 mg與乳糖118 mg、微晶纖維素70 mg等量遞增預混，過80目篩網3次，加硬脂酸鎂2 mg混勻，壓片，片重約200 mg，硬度為30～35 N。

2.2.2 非洛地平普通片含量測定 將非洛地平普通片6片研細，精密稱取200 mg（約含藥10 mg），甲醇溶解，超聲，高效液相色譜測定。按外標法計算非洛地平含量和標示量。

2.2.3 非洛地平普通片體外溶出度測定 參照日本藥典，選取1.0%SDS增溶，以滿足漏槽條件。照溶出度與釋放度測定法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部0931第二法），1.0%SDS 1 000 mL為溶出介質，50 r/min轉速，于5，10，15，20，30，45，60，120，180，240，300，420 min，取適量溶液，高效液相色譜法進行測定。

2.3 非洛地平固體分散體

2.3.1 非洛地平固體分散體制備方法 按質量比1∶4∶5稱取非洛地平原料藥、吐溫80、交聯聚維酮PVPP，非洛地平原料藥、吐溫80置梨形瓶，加無水乙醇，超聲溶解至澄清，加交聯聚維酮，磁力攪拌均勻，45℃減壓旋蒸揮發溶劑，真空干燥24 h［7］。

2.3.2 非洛地平固體分散體飽和溶解度測定取過量非洛地平固體分散體于純水中，37℃振蕩24 h，離心取上清液，紫外分光光度法于363 nm處測定吸光度。

2.3.3 非洛地平固體分散體含量測定 非洛地平固體分散體研細，精密稱取適量（約含藥1 mg），無水乙醇溶解，超聲，紫外分光光度法于363 nm處測定吸光度。按外標法計算非洛地平含量。

2.3.4 非洛地平固體分散體差示掃描量熱法（DSC）鑒定 分別將非洛地平原料藥、吐溫80-PVPP、非洛地平與吐溫80-PVPP物理混合物、非洛地平固體分散體在速度10℃/min，溫度40～180℃下掃描，記錄曲線。

2.3.5 非洛地平固體分散體體外釋放測定 精密稱取適量研細過篩的25μm粒徑的非洛地平固體分散體（約含藥10 mg）和25μm粒徑的非洛地平原料藥10 mg，照溶出度與釋放度測定法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部0931第二法），純水1 000 mL為溶出介質，50 r/min轉速，于5，10，15，30，45，60，90，120 min，取適量溶液，高效液相色譜法進行測定。

2.4 非洛地平納米混懸劑

2.4.1 非洛地平納米混懸劑制備方法 精密稱取非洛地平原料藥溶于二氯甲烷，配制50 mg/mL的有機溶液；精密稱取泊洛沙姆188溶于純水，配制0.1%的水溶液。有機溶液與水溶液體積比1∶5，水溶液冰浴5 min，1 000 r/min的轉速下，有機溶液快速注入水溶液中，攪拌5 min，探頭超聲10 min，室溫攪拌12 h揮發二氯甲烷［8］。

2.4.2 非洛地平納米混懸劑粒徑與穩定性測定測量非洛地平納米混懸劑粒徑并于常溫下放置，觀察粒徑變化。

按文獻配制Krebs-Ringer′s（K-R）液［9］，觀察KR液稀釋非洛地平納米混懸劑100倍時粒徑變化。

2.4.3 非洛地平納米混懸劑包封率和載藥量測定 非洛地平納米混懸劑于3 000 r/min轉速離心10 min，取上清液，甲醇混勻，水浴超聲15 min，紫外分光光度法于363 nm處測定吸光度，經外標法計算總含藥量。

非洛地平納米混懸劑于3 000 r/min轉速離心10 min，取上清液，4℃下15 000 r/min轉速離心30 min，取上清液，甲醇混勻，紫外分光光度法于363 nm處測定吸光度，經外標法計算游離藥量。包封率（%）=（總含藥量-游離藥量）/投藥量×100，載藥量（%）=（總含藥量-游離藥量）/（投藥量+載體質量）×100。

2.4.4 非洛地平納米混懸劑體外釋放測定 精密量取適量非洛地平納米混懸劑（約含藥10 mg）和25μm粒徑的非洛地平原料藥10 mg，照溶出度與釋放度測定法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部0931第二法），0.1%SDS 1 000 mL為溶出介質，50 r/min轉速，依法操作，于5，10，15，30，45，60，90，120 min，取適量溶液，高效液相色譜法進行測定。

2.5 非洛地平在體單向腸灌流考察

2.5.1 溶液配制 供試混懸液：按上述非洛地平普通片處方，分別精密稱取適量200、150、25μm粒徑的非洛地平原料藥和輔料，K-R液配制成80μg/mL的混懸劑。

供試固體分散體：精密稱取適量上述非洛地平固體分散體，K-R液配制成80μg/mL混懸劑。供試納米混懸劑：精密量取適量上述非洛地平納米混懸劑，K-R液稀釋至80μg/mL。

2.5.2 檢測條件與方法 熒光分光光度計于激發波長386 nm，發射波長438 nm處測定非洛地平熒光強度，但非洛地平熒光響應低，測得熒光強度低，定量困難，故選用吐溫80增加非洛地平對熒光強度敏感性［10］，即非洛地平溶液10 mL中含2%吐溫80 1.5 mL。

2.5.3 在體單向腸灌流模型 禁食過夜的雌性SD大鼠（自由飲水），腹腔注射20%烏拉坦（200 mg/kg）麻醉。沿腹中線打開腹腔，選取10～15 cm十二指腸、空腸、回腸、結腸，于兩端切口，插管并結扎，用生理鹽水洗凈腸內容物，再用供試液以2.0 mL/min的流速平衡孵育10 min。傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕。入口處用供試液以0.2 mL/min的流速灌流，出液口用已知質量的接收液小瓶收集，每隔30分鐘更換下一組供試液和接收液小瓶，實驗持續180 min。實驗結束后沿插管兩端剪下腸段，平放舒展后測量長度和內徑。

2.5.4 數據處理 采用重量法矯正灌流液體積，計算藥物吸收速率常數（Ka）和表觀滲透系數（Papp）［11］，由灌流前后藥量差值求出每小時單位面積腸壁上累積吸收量，由4個腸段吸收量之和求出累積吸收總量。

2.6 非洛地平藥代動力學考察

2.6.1 溶液的配制 非洛地平混懸液：按上述非洛地平普通片處方，分別精密稱取適量200，150，25μm粒徑的非洛地平原料藥及輔料，0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成4 mg/mL的混懸液。

非洛地平固體分散體溶液：精密稱取適量上述非洛地平固體分散體，純水配制成4 mg/mL的固體分散體溶液。

非洛地平納米混懸液：精密量取適量上述非洛地平納米混懸劑，純水稀釋至4 mg/mL。

2.6.2 方法學特異性 非洛地平激發波長和發射波長分別為386和438 nm；空白血漿激發波長為291 nm，發射波長為352 nm；吐溫80無熒光吸收。因此，血漿、吐溫80對非洛地平測定不干擾。

2.6.3 給藥方案及血樣采集 將實驗前禁食12 h（自由飲水）的雌性SD大鼠隨機分成5組，分別為200μm非洛地平原料藥與輔料組、150μm非洛地平原料藥與輔料組、25μm非洛地平原料藥與輔料組、非洛地平固體分散體組、非洛地平納米混懸液組。80 mg/kg劑量灌胃，給藥后0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，24 h于大鼠眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置預先肝素化的EP管中，10 000 r/min離心5 min，分離上層血漿，-20℃儲存。

2.6.4 樣品與數據處理 非洛地平血漿樣品室溫解凍，吸取170μL，加2%吐溫80 30μL，熒光分光光度計測得熒光強度。采用PK Solver按非房室模型處理數據，計算主要藥代動力學參數。

3 結果與討論

3.1 非洛地平原料藥pH-溶解度測定

如圖1-A所示，非洛地平在不同pH的溶液中溶解度極低，達不到漏槽條件；圖1-B顯示，1.0%SDS顯著提高非洛地平溶解度，滿足漏槽條件，非洛地平溶解度無pH依賴性。

Figure 1 pH-solubility curves of felodipineactive pharmaceutical ingredient(API)A:Felodipine APIin the water;B:Felodipine APIin the 1.0%SDSsolution

3.2 非洛地平普通片

3.2.1 藥物含量測定 結果如表1所示，藥物含量均在標示量的95.0%～105.0%范圍內，符合規定。

3.2.2 溶出度 圖2表明，不同粒徑原料藥的非洛地平普通片均在7 h內釋放量達85.0%以上，符合規定。且原料藥粒徑越小，溶出速率和程度越高。

Table1 Determination of felodipinecontent(xˉ±s,n=3)

Figure 2 Dissolution curve of felodipine tablets based on 200,150,25μm particle sizes of bulk drug in 1.0%SDSsolution(xˉ±s,n=3)*P＜0.05 vs150μm tablets group

3.3 非洛地平固體分散體

3.3.1 藥物飽和溶解度 非洛地平固體分散體及其原料藥飽和溶解度分別為（179.03±5.47）μg/mL和（2.80±0.12）μg/mL。該結果表明固體分散體顯著提高非洛地平在水性介質的飽和溶解度。

3.3.2 藥物含量測定 該固體分散體中主藥含量為（9.88±0.28）%。

3.3.3 DSC鑒定 由圖3可知，非洛地平在147.49℃出現吸熱峰，吐溫80-PVPP載體無吸熱峰，非洛地平和載體的物理混合物只出現非洛地平吸熱峰，說明非洛地平與載體之間沒有相互作用或相互作用較弱，但固體分散體吸熱峰消失，表明固體分散體中非洛地平以無定形或分子形式存在。

3.3.4 體外釋放 圖4表明，非洛地平固體分散體在1 h內累積釋放量為（86.69±2.54）%，原料藥累積釋放量為（12.24±2.31）%，可見，將非洛地平制備成固體分散體后，其體外釋放顯著提高。

3.4 非洛地平納米混懸劑

3.4.1 粒徑與穩定性 如圖5-A所示，非洛地平納米混懸劑粒徑為（168.90±6.22）nm，PDI：0.11±0.06，粒徑分布較均一。如圖5-B所示，非洛地平納米混懸劑常溫下48 h內粒徑穩定。圖5-C表明，K-R液稀釋100倍的非洛地平納米混懸劑在12 h內亦能保持粒徑穩定。

Figure 3 DSCthermograms of felodipine API,Tween 80-PVPP,phys?ical mixture and felodipine solid dispensionA:Felodipine API;B:Tween 80-PVPP;C:Physical mixture;D:Felo?dipinesolid dispension

Figure 4 In vitro release curves of felodipine solid dispension and 25μmfelodipine APIin water(xˉ±s,n=3)

3.4.2 包封率和載藥量 非洛地平納米混懸劑包封率為（78.98±2.31）%，載藥量為（39.46±1.24）%。

3.4.3 體外釋放 圖6所示，非洛地平納米混懸劑在90 min內累積釋放量為（87.52±5.48）%，原料藥累積釋放量為（20.39±1.03）%，因此，納米混懸劑可顯著提高原料藥的體外釋放。

3.5 非洛地平在體單向腸灌流考察

大鼠在體單向腸灌流法測得指標與人體吸收指標有較好的相關性，該法建立模型所測的數據能應用于人體吸收的預測［12］，已成為美國食品藥品管理局認可的研究藥物吸收的模型之一［13］，故本研究采用此模型來研究非洛地平的胃腸道吸收機制。由于胃腸道中存在的P-糖蛋白（P-gp）可影響藥物在腸道吸收效果，而非洛地平不是P-gp底物，故本研究中不考慮P-gp的作用。

3.5.1 不同制劑在十二指腸、空腸、回腸、結腸中的吸收速率 如圖7-A和7-B所示，同一腸段（結腸除外）中，非洛地平的Ka隨原料藥粒徑減小而增大，非洛地平固體分散體、納米混懸劑較普通片均可進一步提高Ka（P＜0.05）。以上結果說明，增大以非洛地平為代表的BCSⅡ藥物的溶出速率，可有效提高藥物在腸道的吸收速率。

圖7-C數據顯示，同一非洛地平制劑在十二指腸、空腸、回腸的Ka均優于結腸（P＜0.05），但十二指腸、空腸、回腸之間的Ka無顯著性差異（P＞0.05），說明非洛地平主要吸收部位在小腸，且在小腸無特定吸收腸段，而大腸吸收速率低。結腸可能因吸收效果不佳，不同制劑之間Ka無顯著性差異（P＞0.05）。

Figure 5 Particle size figures of felodipine nanosuspension(xˉ±s,n=3)A:Felodipine nanosuspension at 0 h;B:Felodipinenanosuspension at 48 h;C:Felodipine nanosuspension diluted in K-Rsolution at 12 h

Figure 6 In vitro release curves of felodipine nanosuspension and 25μm felodipine APIin 0.1%SDSsolution(xˉ±s,n=3)

3.5.2 不同制劑在十二指腸、空腸、回腸、結腸中的表觀滲透系數 藥物在大鼠體內Papp大于2.0×10-5cm/s，表現為高滲透性［14］。如圖8所示，不同制劑不同腸段的非洛地平Papp均大于2.0×10-5cm/s，因此非洛地平屬于高滲透性藥物，限制其腸道吸收的主要因素是低溶解性。

圖8-A數據表明，粒徑減小，普通片的Papp在全腸段均有所增加；圖8-B表明，相比于最低粒徑的普通片，固體分散體和納米混懸劑的Papp進一步增大；分析圖8-C數據可知，非洛地平在所有制劑中均在十二指腸的Papp最大，且顯著高于結腸（P＜0.05）?？赡芤蚱胀ㄆ芙舛鹊?、滲透性高，溶出藥物幾乎都滲入腸壁，導致同一粒徑的非洛地平普通片在不同腸段Papp無明顯差異（P＞0.05）。綜上，對于BCSⅡ藥物，提高其胃腸道內的溶出速率，有增大其Papp的潛力。

Figure 8 Apparent permeability coefficient of felodipine tablets,solid dispersion and nanosuspension in the duodenum,jejunum,ileum and colon(xˉ±s,n=3)A:200μm,150μm and 25μm felodipine tablets;B:25μm felodipine tablets,felodipine solid dispersion and felodipine nanosuspension;C:Felodip?inetablets,solid dispersion and nanosuspension*P＜0.05 vs150μmtabletsgroup;#P＜0.05 vs25μmtabletsgroup;△P＜0.05 vs colon group

3.5.3 不同制劑在十二指腸、空腸、回腸、結腸中的累積吸收量與累積吸收總量 與上述Ka和Papp的結果趨勢相一致，如圖9所示，在普通片中原料藥粒徑越小，非洛地平的累積吸收量越大；通過新技術進一步提高非洛地平溶解度和溶出速率，可較低粒徑普通片再度提高其在各腸段的相應吸收量（P＜0.05）。最后，非洛地平累積吸收總量也呈相同趨勢：普通片，粒徑越小，累積吸收總量越大；固體分散體和納米混懸劑累積吸收總量最大，進一步證明增加以非洛地平為代表的BCSⅡ類藥物的溶解度和溶出速率，可顯著促吸收（P＜0.05）。

Figure 9 Absorption quality and total absorption quality of felodipine tablets,solid dispersion and nanosuspension in the duodenum,jejunum,ileum and colon(xˉ±s,n=3)A:Absorption quality of 200μm,150μm and 25μm felodipine tablets;B:Absorption quality of 25μm felodipine tablets,solid dispersion and nano?suspension;C:Total absorption quality of felodipine tablets,solid dispersion and nanosuspension*P＜0.05 vs150μm tablets group;#P＜0.05 vs25μm tablets group

3.6 藥代動力學考察

如表2和圖10所示，非洛地平固體分散體cmax、AUC和F最高，非洛地平納米混懸劑次之，最大粒徑非洛地平普通片最小。在普通片中，粒徑減小非洛地平cmax、AUC和F依次遞增。結果證明，增加以非洛地平為代表的BCSⅡ類溶解度和溶出速率，口服后能提高胃腸道吸收量，從而增加在體內的有效濃度，進而提高口服生物利用度。

4結 論

本研究制備了原料藥粒徑為200μm、150μm、25μm的非洛地平普通片，通過制劑增溶新技術制備了非洛地平納米混懸劑和固體分散體，研究增溶策略對以非洛地平為代表的BCSⅡ類藥物口服吸收的影響。pH-溶解度曲線驗證非洛地平溶解性差，大鼠在體腸灌流實驗結果表明非洛地平滲透性高，因此限制非洛地平等BCSⅡ類藥物口服吸收的關鍵因素其是低溶解性；增加以非洛地平為代表的BCSⅡ類藥的飽和溶解度和溶出速率，能顯著提高其在胃腸道吸收速率和累積吸收量，從而最終提高生物利用度。

Table2 Pharmacokinetic parametersof felodipinetablets,solid dispersion and nanosuspension(xˉ±s,n=5)

Figure 10 Plasma concentration-time curves of felodipine tablets,solid dispersion and nanosuspension(xˉ±s,n=5)