種植體周圍牙周致病菌早期定殖臨床研究

徐 典，朱明慧

(空軍軍醫大學第三附屬醫院急診與綜合臨床科，陜西 西安710032)

種植義齒作為一種修復方式近年發展迅速，種植修復的長期效果已被廣大患者和口腔醫師肯定[1]。但隨著種植義齒在臨床上的廣泛應用，種植修復失敗的病案也逐漸增多[2]。有研究顯示種植義齒失敗率約為3.0%～15.8%[3]。目前大多數學者認為的種植失敗原因為機械性刺激或牙周感染所致的種植體周圍組織的損傷[4]。國內外許多學者對牙周致病菌在種植體周圍定殖進行了研究，認為牙齦卟啉菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、中間普氏菌(Prevotella intermedia,Pi)、伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitans,Aa)等致病菌定殖與種植體周圍齦溝深度高度相關[5]。這些牙周致病菌定殖于種植體周圍的齦溝中，刺激機體釋放一系列炎性因子，誘發炎癥反應[6]，影響并破壞骨整合過程，導致種植體修復失敗[7]。本研究選擇以上三種種植體周圍炎和牙周炎的共同主要致病菌作為研究對象，在早期種植體周圍進行細菌學縱向檢測和鑒定，對早期種植體周圍牙周致病菌的定殖，及其與時間的關系進行研究，探討種植體植入后牙周致病菌定殖的基本規律，為預防早期種植體周圍炎的發生，提高種植修復的成功率提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2020年12月就診于空軍軍醫大學第三附屬醫院急診與綜合臨床科，接受種植修復的缺失牙齒數量≤2顆的牙列缺損患者52例，男26例，女26例，年齡22～65歲。其中非牙周病缺牙組30例，牙周病缺牙組22例。其中非牙周病缺牙組男13例，女17例；牙周病缺牙組男13例，女9例。為排除牙位導致的刷牙清潔效率的不同，本研究中種植位點以前牙或前磨牙、磨牙加以區分，非牙周病缺牙組前牙或前磨牙12例，磨牙18例；牙周病缺牙組前牙或前磨牙10例，磨牙12例；以上各因素經分析均無統計學差異(均P<0.05)，具有可比性。病例納入標準：全身無系統性疾病，牙周病缺牙組患者在行一期種植體植入術前已經接受牙周治療并停止使用抗生素3個月；無吸煙史，或種植手術前6個月已成功戒煙；拍片觀察牙周病進入靜止期；愿意配合臨床治療和后期隨訪，并簽署知情同意書。排除標準：吸煙患者；精神性疾病患者；在擬種植區域有種植體脫落史的患者；在擬種植區域存在腫瘤，慢性骨喪失類疾??；曾有放射性治療史等疾病的患者，以及拒絕參加或無法配合復查采樣的患者。

1.2 研究方法 術前檢查包括開口位錐形束CT(CBCT)、血常規、術前感染四項等，檢查是否符合篩選標準；所有患者選用骨水平種植體，自由手操作，埋入式愈合。一期手術后行常規抗炎治療。選擇種植體對側同名牙作為對照牙。若種植體對側同名牙不是天然牙，則選擇種植體對頜牙。種植后6個月行牙片檢查骨結合情況，進行二期手術。于術中采集種植體根部樣本，種植二期術后12 d取模，此時采集種植體及對照牙的齦袋底樣本。種植二期術后24 d復診戴牙，此時采集種植體及對照牙的齦袋底樣本。

1.3 取樣方法 ①對照牙：一期術前準備前取樣，對照牙牙周圍用棉球搽干隔濕、氣槍吹干。用3個30號紙尖插入牙的近頰、頰側和遠頰牙周袋袋底，靜置30 s，紙尖立即置于1.5 ml EP管中，PBS緩沖液200 μl，-20 ℃凍存，待用。②種植二期手術：患者在局麻下，切除種植釘上牙齦組織，暴露種植體，局部止血，去除封閉螺絲，將3個30號紙尖置于種植體內部30 s,紙尖立即置于1.5 ml EP管中，200 μl PBS浸泡，-20 ℃凍存。③種植二期術后12 d：將種植體周圍棉球搽干、隔濕、氣槍吹干，用3個30號紙尖插入種植體的近頰、頰側和遠頰牙周袋袋底，靜置30 s，紙尖立即置于1.5 ml EP管中，PBS緩沖液200 μl，-20 ℃凍存，待用，用同樣方法同時取對照牙標本。④種植后二期后24 d：將種植體周圍棉球搽干隔濕、氣槍吹干，用3個30號紙尖插入種植體的近頰、頰側和遠頰牙周袋袋底，靜置30 s，紙尖立即置于1.5 ml EP管中，PBS緩沖液200 μl，-20 ℃凍存，待用。用同樣方法同時取對照牙標本。

1.4 對照設置 以 Pg ATCC 33277、Aa ATCC 33384、Pi ATCC 25611原菌液(均為空軍軍醫大學第三附屬醫院實驗室提供)作為陽性對照，具體參數見表1。

表1 引物設計表

2 結 果

2.1 三種牙周致病菌菌株的PCR擴增 針對三種牙周致病菌的16sDNA設計引物進行常規PCR檢測，擴增片段電泳圖(圖1)。

1道為Aa擴增產物條帶；2道為Pi擴增產物條帶；3道為Pg擴增產物條帶圖1 三種細菌單獨PCR擴增電泳圖

2.2 臨床齦溝液樣本多重PCR擴增陽性結果 見表2。將采樣標本按照預實驗摸索成熟的反應條件進行擴增，出現陽性結果的電泳圖(圖2～4)。牙周病缺牙組中，1例患者(編號25)一期術前對照牙齦溝內發現Pg(圖2中1道)；1例患者(編號38)二期術后12 d對照牙齦溝內發現Pg(圖2中7道)；1例患者(編號14)二期術后12 d對照牙齦溝內發現Pi(圖2中8道)；以上3例患者在二期術后24 d時在對照牙和種植體周圍均檢出相同牙周致病菌定殖(圖3、4)。1例患者(編號52)一期術前對照牙齦溝內發現Aa(圖2中11道)，但在隨后的采樣中再未檢出。在非牙周病缺牙組中只有2例患者在一期術前的對照牙齦溝內檢測出Pi(圖2中2道及17道)，后期的歷次采樣中均未能檢出Pi。

表2 牙周病缺牙組陽性檢出情況

A、B、C道分別為Aa、Pi和Pg陽性對照；Marker自下而上分別為100、250、500、750、1000、2000 bp；1道和7道Pg陽性，11道Aa陽性，8道Pi陽性，均為牙周病組檢出；2道和17道Pg陽性，為非牙周病缺牙組檢出圖2 兩組在一期術前和二期術后12 d三種細菌陽性檢出

A、B、C道分別為Aa、Pi和Pg陽性對照；M道為Marker，自下而上分別為100、250、500、750、1000、2000 bp；1道和5道與圖2中1道為同一患者，8和15道與圖2中7道為同一患者，連續檢出Pg圖3 患者二期術后24 d口內種植體和對照牙Pg檢出陽性

M道為Marker，自下而上分別為100、250、500、750、1000、2000 bp；13道和15道為Pi陽性圖4 圖1中8道Pi陽性患者口內于術后12 d和24 d連續檢出Pi

2.3 各組陽性檢出率統計 非牙周病缺牙組30例患者中有2例檢出牙周致病菌，檢出率6.67%；牙周病缺牙組22例患者牙周致病菌檢出為4例，檢出率為18.18%。兩者之間比較無統計學差異(χ2=1.649，P>0.05),見表3。以三種牙周致病菌檢出例次為單位計算，非牙周病的患者共采集標本88例次，其中有10例次有牙周致病菌檢出，檢出率為1.67%；而牙周病組采集標本88例次，有10例次有牙周致病菌檢出，檢出率為11.36%，兩者之間比較存在統計學差異(χ2=8.781，P<0.05),見表4。

表3 兩組患者陽性檢出情況比較(例)

表4 兩組患者陽性檢出例次比較(例/次)

3 討 論

在牙周感染所致的種植體周圍組織損傷中，種植體周圍炎是種植義齒修復的常見并發癥,是導致種植修復失敗的主要原因[8]。種植義齒能否長時間留存于患者口內并正常行使功能，與種植體周圍組織是否健康密切相關，包括種植體與骨組織的良好骨結合，以及種植體與鄰接上皮和結締組織纖維良好的結合狀態[9]。諸葛春耕等[10]研究表明，種植義齒由于其特殊的解剖結構環境，更容易遭受口腔微生物的侵襲。有研究指出，種植體周圍炎的發病率近33%[11]，以種植體數量計算，種植體周圍炎發生率約為20%，且呈逐年增長的趨勢[12]。 細菌感染是種植體周圍炎發生的最主要因素，包括常見的牙周致病菌，如牙齦卟啉單胞菌(Pg)、伴放線放線桿菌(Aa)、中間普氏菌(Pi)、福賽坦氏菌(Tannerella forsythia，Tf)和齒垢密螺旋體(Treponema denticola，Td)等[13]。

本研究僅就齦溝液樣品進行多重PCR定性檢測，以考察受檢患者牙周致病菌的攜帶情況。在牙周病缺牙組有10例次，共3例患者連續檢測出牙周致病菌的存在，另有1例患者與一期術前檢測出Aa的存在。而其他病因導致缺牙的患者中只有2例有牙周致病菌的檢出，兩組間進行χ2檢驗后，檢出例數兩組無統計學差異，但檢出例次存在統計學差異。說明牙周致病菌在種植體周圍定殖的機會很高。Koka等[14]發現二期術后14 d細菌會在牙齦邊緣定殖，而齦下菌群的定殖約需28 d，說明牙周致病菌在種植體周圍的定殖比天然牙更早。Mombelli等[15]發現，種植體周圍菌群數量和種類與鄰近天然牙齦溝內的定殖菌群相似，85%以上為球菌，80%以上是革蘭陽性兼性厭氧球菌。植入后6個月，未發現菌群有顯著改變。另有學者對種植修復后患者追蹤調查，發現有牙周病史的牙列缺損患者種植體周圍可檢出牙周致病菌從鄰牙牙周組織傳播到種植體周圍[16]。本研究的結果也印證以上結論?？梢姺N植體周圍牙周致病菌的早期定殖受到種植體類型、結構、口腔內暴露時間以及口腔內余留牙的影響。雖然目前認為經過系統的牙周治療后，牙周病進入靜止期，牙槽骨停止病理性吸收，可以進行牙種植術，但患者口內的牙周致病菌仍然有可能遷移并定殖于種植體穿齦部位。

本研究中，在牙周病組中有4例共10例次有牙周致病菌的檢出，并且有3例是連續的檢出，提示在種植體植一旦暴露于口腔內，牙周致病菌就會進入種植體周圍定殖，其種類與對照牙的陽性細菌相同，在此印證了種植體周圍細菌來自口內天然牙牙周菌群的學說[17]。但國外有研究發現，種植體周圍炎中的微生物中檢測出的牙周致病菌中福賽坦菌最多，其次是具核梭杄菌及齒垢密螺旋體，但作為牙周病主要致病菌的伴放線放線桿菌和牙齦卟啉單胞菌的含量較少[18]；有學者報道，牙周炎的發生與牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌水平相關，而種植體周圍炎與這兩種微生物無顯著關聯[19]。目前的觀點認為兩者的主要致病微生物并不完全相同，種植體周圍炎中的菌斑微生物種類較正常的種植體周圍組織和傳統的牙周炎更加復雜[20]。

本研究中，牙周病缺牙組中有3例患者在種植義齒完成時發現其種植體周圍已經有與對照牙相同種類的牙周致病菌定殖，提示對于牙周病靜止期患者進行種植體修復時應考慮牙周致病菌的因素。1例患者在一期術前對照牙檢測出Aa的定殖，但是在隨后的各時間節點均未能檢測出牙周致病菌的定殖。以上結果與Waal等[21]的研究類似，該學者發現種植體周圍的破壞程度與牙齦卟啉單胞菌(Pg)、中間普氏菌(Pi)、福賽坦氏菌(Tf)和具核梭杄菌(Fn)的齦下定殖存在顯著相關，Pi和Tf與疾病狀況的關聯最為明顯，伴放線放線桿菌(Aa)和葡萄球菌的檢出率很低。就非牙周病導致缺牙的患者來說，其陽性檢出率僅6.67%，并且沒有連續檢出的病例。原因可能是：①樣本量不夠大。②本研究對種植修復期間的常規口腔保健措施并沒有加以控制，如術后40 d口水抗菌治療等；只是告知病人在此基礎上不必使用任何口服或注射用抗菌素。所以非牙周病組的檢出率較低只能說明與牙周病缺牙的患者相比，其種植修復過程中受到牙周致病菌影響的幾率較低而已，而并不意味著牙周組織健康的患者在進行種植修復構成中完全沒有牙周致病菌感染和種植失敗的危險。③檢測手段的局限性。最新的研究顯示，人類口腔內微生物可能近1.9萬種，而目前的技術手段能夠檢測出700余種[22]，僅用一種方法難以精確測定種植體周圍牙周致病菌的存在。已有學者采用MiSeq測序、QIIME(Quantitative insights in microbial ecology)技術、Mothur軟件、LEfSe差異分析、Network網絡分析等先進的檢測手段進行牙周致病菌群的定性、定量研究，在不久的將來也勢必會應用于種植體周圍炎的研究[23]。

可見，種植體周圍細菌來自口內天然牙牙周菌群。由于年齡、飲食、口腔衛生習慣的不同，種植體植入后其周圍的細菌組成受多種因素影響。所以對牙周組織健康的患者仍然要注意口腔牙周致病菌的控制，對牙周致病菌易感染群的種植適應證和控制，糾正不良口腔衛生習慣，嚴格菌斑控制，以降低種植體周圍牙周致病菌的繁殖，延長種植體使用壽命。