基質金屬蛋白酶-2、CD34標記微血管密度在膽囊癌組織中的表達及臨床意義

買賽虎，徐建慶，張站產

(西安高新醫院普外科，陜西 西安710075)

膽囊癌(Gallbladder carcinoma,GC)是膽道系統最常見的惡性腫瘤，占消化系統惡性腫瘤發病率的第五位，其發病比較隱匿，侵襲性強，早期臨床表現缺乏特異性，一旦出現臨床體征多為中晚期[1-2]?，F在一致的認識細胞外基質(Extracellular ma-trix,ECM)被降解引起細胞基底膜的完整性破壞是腫瘤浸潤正常組織開始轉移的先決條件[3]。CD34是唾液酸表面分子家族中的一員，對皮內細胞的黏附作用有極其重要的意義，此過程是形成新生血管的關鍵步驟。腫瘤周圍血管密度可反映出腫瘤生成血管的能力，微血管密度(Microvessel density，MVD)是反映血管生成能力的重要指標之一，腫瘤的生長、浸潤、轉移與MVD有著關系密切[3]。采用CD34標記 MVD (CD34-MVD)可以提供清晰的判斷依據，密度越大組織中的新生血管數量越多，同時由于新生血管性質的不穩定性，通常情況下會呈出現扭曲、擴張和不均勻的狀態，膽囊癌患者CD34-MVD值在這種高密度狀態下，最容易發生腫瘤擴大和轉移情況[4]?；|金屬蛋白酶(Matrixmetalproteinases，MMPs)是降解細胞外基質重要酶類之一，可以降解細胞外基質中的多種蛋白成分和細胞基底膜，從而促進腫瘤細胞在局部和遠處組織發生侵襲和轉移，與腫瘤的侵襲、轉移關系密切[5]?；|金屬蛋白酶-2(Matrixmetallopro-teinases-2，MMP-2)是其家族的重要成員之一，進一步研究發現其可作為腫瘤侵襲、轉移的標志物，并且認為MMP-2與惡性腫瘤的浸潤轉移密切相關[6]。本研究探討MMP-2及CD34-MVD在膽囊癌中的表達水平及兩者的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究的所有病例選自高新醫院2014年5月至2019年5月手術切除標本，術后病理證實，共77例，膽囊癌52例，女35例，男17例，年齡51～72歲，中位數年齡62.6歲。組織學分型：高分化腺癌15例，中分化腺癌13例，低分化腺癌24例，無淋巴結轉移22例，淋巴結轉移30例。Ⅰ期5例：Ⅱ期8例；Ⅲ期17例；Ⅳ期22例。慢性膽囊炎25例，女17例，男8例，年齡45～63歲，中位數年齡55.6歲。

1.2 研究方法 使用免疫組織化學法對膽囊癌及慢性膽囊炎患者中的MMP-2、CD34-MVD表達情況進行檢測，依照SABC試劑盒說明進行。取石蠟標本進行脫蠟、抗原修復，添加一抗，4 ℃冰箱過夜，添加生物素化二抗，持續30 min。使用DAB進行室溫顯色，顯微鏡下觀察控制顯色，充分顯色后蒸餾水沖洗。在光鏡下進行病理學診斷，按照腫瘤細胞的分化程度分為低、中、高分化三組。對于陰性對照組：采用PBS液取代一抗作為陰性對照，其余實驗步驟同前。

1.3 結果判定 細胞膜和細胞漿內呈現棕黃色顆粒為CD34-MVD蛋白表達陽性。MMP-2表達陽性表現在細胞質內，呈現棕黃色或棕褐色顆粒；根據相關文獻[3]，以顯色強度和范圍分為：強陽性()，陽性細胞數>50%；中等陽性()，陽性細胞數占25%～50%；弱陽性(+)，陽性細胞數占5%～25%；陰性(-)，陽性細胞數<5%。按表達情況將研究對象分為兩組：低表達組(-～+)和高表達組(～)。

1.4 統計學方法 使用SPSS 19.0統計學軟件對相關實驗數據進行統計學分析，計數資料以[例(%)]表示，采用χ2檢驗進行率的比較，CD34-MVD與MMP-2之間的相關性分析采用Spearman等級相關分析。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MMP-2在膽囊癌與慢性膽囊炎組織中的表達 見表1。MMP-2陽性表達在膽囊癌組織中主要定位于細胞胞漿，呈棕黃色，分布比較均勻，細胞間質內可見部分陽性表達。MMP-2在25例慢性膽囊炎組織中呈陰性表達為19例，6例呈陽性表達，陽性表達率為24.0%。34例膽囊癌組織中MMP-2呈高表達，在膽囊癌中MMP-2的陽性表達率為78.8%(41/52)，其中陰性(-)11例，弱陽性(+) 7例，陽性()11例，強陽性() 23例。MMP-2在慢性膽囊炎和膽囊癌組織中的表達率比較有統計學差異(P=0.0038)。提示MMP-2在膽囊癌組織中表達明顯增強。

表1 MMP-2在慢性膽囊炎與膽囊癌組織中的表達[例(%)]

2.2 MMP-2表達與膽囊癌臨床病理特征的關系 從性別、年齡、淋巴結轉移、組織分化程度、遠處轉移、臨床分期等方面比較MMP-2高表達與低表達在組之間的差異性。統計結果顯示，MMP-2高表達與膽囊癌分化程度、有無淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期方面有明顯的關系(均P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤浸潤程度等無關(均P>0.05)。

表2 MMP-2表達與膽囊癌臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 CD34-MVD在膽囊癌與慢性膽囊炎組織中的表達 CD34-MVD在膽囊癌中均值為(53.6±8.9)，慢性膽囊炎均值(19.6±4.15)，兩者之間CD34-MVD的表達水平比較有統計學差異(P<0.05)。

表3 CD34-MVD在膽囊癌與慢性膽囊炎組織中的表達

2.4 MMP-2、CD34-MVD在膽囊癌中表達關系的相關性分析 52例膽囊癌中，MMP-2蛋白陽性表達的患者41例、MMP-2蛋白陰性表達的患者11例，CD34-MVD值分別為(50.8±12.3)和(39.9±9.4)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。表明伴隨MMP-2的表達，CD34-MVD值明顯增加，腫瘤新生血管明顯增多。

表4 膽囊癌中MMP-2與CD34-MVD表達的相關性

3 討 論

MMPs是降解細胞外基質重要酶類之一，可以降解細胞外基質中的多種蛋白成分和細胞基底膜，從而促進腫瘤細胞在局部和遠處組織發生侵襲和轉移，與腫瘤的侵襲、轉移關系密切[7]。在MMPs家族中MMP-2能降解細胞外基質以及促進腫瘤細胞的浸潤和轉移，進一步研究發現其可作為腫瘤侵襲、轉移的標志物，并且認為MMP-2與惡性腫瘤的浸潤轉移密切相關[8]。MMP-2 作為一種鋅離子依賴蛋白酶，以酶原的形式由腫瘤細胞進行分泌，在被激活后，MMP-2對細胞外基質中Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白、基底膜進行水解，基底膜完整性遭到破壞，對細胞遷移進行調節，進而促進血管生成以及腫瘤的生長，同時參與到腫瘤細胞降解細胞外基質，腫瘤細胞浸潤結締組織基質、侵入小血管及淋巴管而發生轉移，從而導致惡性腫瘤侵襲的發生。已有研究[9-10]證明，腫瘤細胞可誘導周圍的纖維細胞合成產生更多的MMP-2，從而加速周圍組織的惡變。腫瘤周圍微血管的形成直接影響腫瘤細胞的生長及發展，CD34作為細胞表面跨膜蛋白，直接參與了細胞間的粘附、造血干細胞運輸及炎癥反應、白細胞的聚集等，對血管內皮細胞匯聚成管腔過程的研究發現CD34起到重要作用，因此將CD34作為標記微血管密度(MVD)重要的分子生物學指標[12-13]。Min等[14]對乳腺癌中相關蛋白表達進行研究，表明乳腺癌患者總生存率與細胞基質上MMP-2蛋白表達程度呈正向相關，認為MMP-2蛋白通過破壞細胞基底膜，使得腫瘤細胞更加易于侵襲周圍組織及淋巴系統。國內學者對甲狀腺癌、子宮內膜癌及食管癌等腫瘤中MMP-2的表達進行研究，發現上述惡性腫瘤的發生可能與MMP-2高表達有關，MMP-2可能促進腫瘤新生血管的生成，并且在評估惡性程度和預后方面具有一定意義[15-17]。

本研究發現在膽囊癌組織中MMP-2的表達明顯增強，高表達率為65.4%(34/52)，陽性率78.8%(41/52)，其中陰性11例，弱陽性7例，陽性11例，強陽性23例；在15例慢性膽囊炎組織中，陽性表達率24.0%(6/25)，其中陽性6例，陰性14例，MMP-2在膽囊癌及慢性膽囊炎的表達比較具有統計學差異。在淋巴結轉移組MMP-2的高表達率明顯高于無淋巴結轉移組，兩者比較差異有統計學意義。在臨床Ⅲ,Ⅳ期中MMP-2高表達率明顯高于臨床Ⅰ，Ⅱ期，兩者間比較差異有統計學意義。在不同性別、年齡、腫瘤部位、組織學分級組間，MMP-2的高表達率比較無統計學差異。這些均提示MMP-2與膽囊癌的發生、發展密切相關。在膽囊癌的患者中，MMP-2高表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及遠處轉移情況成正相關趨勢，提示MMP-2蛋白在腫瘤發生早期開始產生，為腫瘤侵襲轉移提供調節。腫瘤的發生發展必然伴隨著新生微血管的生成，為腫瘤生長、浸潤及轉移提供媒介。MMP-2的作用更多的表現為降解細胞外基質的膠原、明膠物質，從而使腫瘤細胞的浸潤力更強，以及為促進腫瘤血管的形成做準備。因此MMP-2蛋白的表達程度可以間接反映出腫瘤細胞的惡性程度[18]。

Li等[19]通過免疫組化的方法，對肝細胞癌組織上CD34的表達進行研究，發現其蛋白陽性表達水平顯著高于良性肝細胞性病變患者，而另一項研究[20]發現胃腸惡性腫瘤的組織上CD34的陽性表達率高于癌旁組。從我們的研究結果中也可以看出，CD34-MVD表達在膽囊癌中明顯高于慢性膽囊炎，可以證實在惡性腫瘤的發生發展中伴隨著微血管的生成，且在52例膽囊癌患者中，MMP-2蛋白陽性患者的CD34-MVD結果也較陰性組高，進一步說明腫瘤的侵襲、轉移與微血管息息相關。

本研究顯示，52例膽囊癌中，41例MMP-2蛋白陽性表達和11例MMP-2蛋白陰性表達的患者，微血管密度均值分別為(50.8±12.3)和(39.9±9.4)，兩者比較差異有統計學意義。表明伴隨MMP-2的表達，CD34-MVD值明顯增加，MMP-2、CD34-MVD在膽囊癌中的表達呈正相關。腫瘤新生血管明顯增多，對于膽囊癌的發生、發展以及腫瘤細胞的增殖、遷徙MMP-2與CD34-MVD起著協同作用，因此可以聯合檢測MMP-2與CD34-MVD，對于膽囊癌的早期診斷、判定膽囊癌的生物學行為有著積極的臨床意義。

總之，膽囊癌的侵襲、轉移過程中MMP-2蛋白在降解細胞基底膜后，CD34-MVD為腫瘤提供必需的微循環營養及轉移所需的血管“橋梁”，兩者之間是存在高度相關性的。但是，兩者之間是直接調節還是通過某些蛋白或細胞因子進行調節，仍需深入探討，這為我們下一步研究兩者之間的作用機制提供了相關思路。