3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白功能特性變化

姚 慧，祁雪兒，毛俊龍，齊 賀，武天昕，張 賓,2,

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大學比薩海洋研究生學院，浙江 舟山 316022）

魷魚作為一種常見的營養健康且風味良好的遠洋漁業資源，含有豐富的膠原蛋白、?；撬?、維生素及多種人體必需氨基酸等，表現出明顯的高蛋白、低脂肪及低熱量特點，因而深受廣大消費者的喜愛[1]。魷魚肌肉中肌原纖維蛋白含量較高，約占全部肌肉組織的60%～70%。在加工、貯藏及運輸過程中肌肉中肌原纖維蛋白功能特性的變化情況顯著影響著魷魚及其制品的感官價值及營養品質。冷凍貯藏作為魷魚制品的最常用保存方式，可有效保持魷魚肌肉的營養價值[2]。但有研究表明，隨著凍藏時間延長，魷魚肌肉中水分含量逐漸降低，組織結構破損程度加劇，導致肌原纖維蛋白各種功能特性也不斷減弱[3]，致使魷魚凍藏品質也不斷下降。此外，低溫貯藏過程中，肌肉組織中生成的冰晶促使水分子不斷從蛋白質周圍析出，從而影響肌原纖維蛋白濁度、溶解性、起泡性等功能特性[4-5]。

近年來，國內外釣捕產量較高的魷魚資源主要有阿根廷魷魚（Illex argentines）、北太平洋魷魚（Ommastrephes bartrami）（以下簡稱北太魷魚）、秘魯魷魚（Dosidicus gigas）等。其中，關于單一種類魷魚中肌原纖維蛋白功能特性的變化研究較多，而對不同品種魷魚之間肌肉品質特性的比較研究還鮮見報道。綜上，本實驗以阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚為研究對象，分析凍藏對不同魷魚肌原纖維蛋白品質特性的影響情況，旨在為3 種魷魚凍藏過程中肌肉蛋白質冷凍變性（差異性）規律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿根廷魷魚（體長約170 mm、質量400 g）、北太魷魚（體長約250 mm、質量500 g）和秘魯魷魚（體長約300 mm、質量1 000 g）購自浙江舟山國際水產城。將新鮮魷魚樣品置于裝有冰塊的保溫箱內，0.5 h內運回實驗室，備用。

氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等（均為分析純） 武漢谷歌生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl-hydrazin，DNPH）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷酸氫二鈉、十二烷基硫酸鈉（dodecyl sodium sulfate，SDS）等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Ca2+-ATPase試劑盒、總巰基試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設備

MDF-U53V型超低溫冰箱 日本Sanyo公司；UV751GD型紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠；F-4500型熒光分光光度計、CF-16RN高速冷凍多用途離心機 日本日立公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速勻漿機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 魷魚分組與取樣

將新鮮阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚樣品在-18 ℃冰箱中進行長期凍藏，第0、15、30、45、60、75、90、105天和第120天分別取樣1 次，進行各指標測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白制備及質量濃度測定

依據李學鵬等[6]的方法并加以修改。取5 g魷魚胴體攪碎，加入4 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2），高速均質20 s，然后在4 500 r/min條件下離心20 min；取沉淀再次均質1 次，加入4 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2）混勻均質，在4 500 r/min條件下離心20 min，取上清液即獲得肌原纖維蛋白提取液，進而采用雙縮脲法測定蛋白質量濃度[7]。

1.3.3 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力測定

采用試劑盒測定肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力，具體方法參照說明書進行。Ca2+-ATPase活力以每毫克蛋白所含Ca2+-ATPase活力單位表示。

1.3.4 肌原纖維蛋白溶解度測定

參照刁小琴等[8]報道的方法。采用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含有0.6 mol/L NaCl，pH 6.2），將制備的肌原纖維蛋白溶液質量濃度調整為10 mg/mL，4 000 r/min離心40 min后，上清液用雙縮脲法測定蛋白質量濃度，按式（1）計算肌原纖維蛋白溶解度。

1.3.5 肌原纖維蛋白濁度測定

依據Benjakul等[9]的方法，并稍作修改。取制備的肌原纖維蛋白溶液于燒杯中，加入磷酸鹽緩沖溶液（含有50 mmol/L Na2HPO4、0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）使肌原纖維蛋白溶液質量濃度為2 mg/mL，在80 ℃水浴鍋中加熱30 min，冷卻后在340 nm波長處測定吸光度，以吸光度表示肌原纖維蛋白濁度。

1.3.6 肌原纖維蛋白乳化能力測定

參考Agyare[10]和Xia Xiufang[11]等的方法，并略作修改。將2.0 mL大豆油和8.0 mL肌原纖維蛋白溶液（1～2 mg/mL）置于50 mL離心管中，高速勻漿1 min；結束后從離心管底部0.5 cm處取出50 μL混合液，加入5 mL質量分數0.1% SDS溶液，混勻后在500 nm波長處測定吸光度。離心管繼續放置10 min后，再次在相同位置取50 μL混合液，加入5 mL質量分數0.1% SDS溶液，混勻后測定吸光度，按式（2）和式（3）分別計算肌原纖維蛋白乳化活性指數（emulsification activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsification stability index，ESI）。

式中：ρ為乳狀液肌原纖維蛋白質量濃度/（mg/mL）；A0為0 min時乳狀液的吸光度；A10為10 min時乳狀液的吸光度；φ為油相體積分數（φ為0.2）；n為稀釋倍數。

1.3.7 肌原纖維蛋白起泡性和泡沫穩定性的測定

參考Hammersh?j等[12]的方法并略作修改。取30 mL肌原纖維蛋白溶液（20 mg/mL），高速勻漿機勻漿1 min；勻漿結束后將液體快速轉入至量筒中，分別測定勻漿操作停止時的泡沫體積和液體體積之和V0，以及操作停止10 min后的泡沫和液體總體積V10，按式（4）和式（5）分別計算肌原纖維蛋白起泡性和泡沫穩定性。

式中：V0為勻漿0 min后泡沫體積和液體總體積/mL：V10為勻漿10 min后泡沫和液體總體積/mL。

1.3.8 總巰基含量測定

采用總巰基含量試劑盒法進行測定，具體操作依據說明書進行，總巰基含量以每毫克蛋白所含總巰基的物質的量表示。

1.3.9 羰基含量測定

依據Oliver等[13]的方法，并稍作修改。取5 mL 2.5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，加入5 mL 10 mmol/L DNPH溶液（含2 mol/L HCl），室溫下避光反應1 h，每隔15 min振蕩1 次；反應后加5 mL質量分數20% TCA溶液，混合后10 000 r/min離心5 min；取沉淀物用5 mL乙酸乙酯-乙醇混合液洗滌3 次，再加入10 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃水浴15 min后，10 000 r/min離心3 min，在370 nm波長處測定吸光度，計算肌原纖維蛋白羰基含量，羰基含量以每毫克蛋白所含羰基物質的量表示。

1.4 數據處理與分析

實驗均重復3 次，結果均以平均值±標準差表示，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白質量濃度的變化

圖1 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白質量濃度變化情況Fig.1 Changes in myofibrillar protein contents in three squid species during frozen storage

由圖1可知，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚酮體肌肉中，肌原纖維蛋白初始質量濃度存在著較大差異，其中阿根廷魷魚肌原纖維蛋白初始質量濃度為105.22 g/L，高于其他兩種魷魚，而北太魷魚和秘魯魷魚二者之間并無明顯差異。隨著凍藏時間延長，3 種魷魚肌原纖維蛋白質量濃度均呈現不斷的下降趨勢。凍藏120 d時，相比于凍藏0 d時，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚中肌原纖維蛋白質量濃度較初始分別減少了72.22%、46.24%和40.83%，其中以阿根廷魷魚肌原纖維蛋白質量濃度下降幅度最大。對于阿根廷魷魚，在凍藏0～15 d范圍內，其肌原纖維蛋白質量濃度明顯下降；第15天時，比初始質量濃度減少33.53 g/L；在隨后15～45 d范圍內，其下降速率相對較為平緩，這可能是阿根廷魷魚中肌動球蛋白含量較高，凍藏過程中肌動球蛋白部分結合水形成冰晶，導致肌動球蛋白分子之間相互形成非共價鍵，進而形成超大分子的凝集體所致[14]。在凍藏60～120 d范圍內，3 種魷魚肌原纖維蛋白質量濃度變化趨勢較為相似，三者之間并無明顯差異，表明在凍藏后期3 種魷魚中蛋白質的變性過程及變化程度相對較為一致。

2.2 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的變化

圖2 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活力變化情況Fig.2 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

Ca2+-ATPase活性是反映肌球蛋白結構完整程度的一個重要指標，其也能反映肌肉蛋白質的整體變性程度。由圖2可知，3 種魷魚中初始肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力存在較大差異，其中阿根廷魷魚初始肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力為2.31 U/mg，明顯高于其他兩種魷魚。隨著凍藏時間的延長，3 種魷魚中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力均呈現不斷下降的趨勢。凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力較初始分別下降了2.15、1.22 U/mg和1.20 U/mg，這是由于肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性主要源于肌球蛋白的球狀頭部，在凍藏過程中冰晶形成以及由此造成的體系離子強度升高，都會導致肌球蛋白頭部結構發生改變，從而使Ca2+-ATPase活性下降。此外，低溫凍藏誘導的蛋白質分子重排、凍結濃縮效應及肌球蛋白活性部位的巰基氧化作用，也會導致Ca2+-ATPase活性的降低[15]。在凍藏0～15 d范圍內，阿根廷魷魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力呈現急劇下降的趨勢，這可能是因為阿根廷魷魚肌球蛋白含量較高[16]，其表現出的初始Ca2+-ATPase活性較高，在隨后的低溫凍藏過程中降低幅度也最為明顯。在凍藏45～100 d范圍內，北太魷魚和秘魯魷魚中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性變化趨勢較為相似；在此期間，阿根廷魷魚中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性始終高于其他兩種魷魚。

2.3 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白溶解性的變化

圖3 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白溶解性變化情況Fig.3 Changes in solubility of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白溶解性是肌肉蛋白質重要的功能性質之一，對肌肉品質特性具有重要的影響。通常情況下，蛋白溶解性的下降也是肌肉品質劣變的重要標志[17]。由圖3可知，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白初始溶解度分別為68.87%、66.93%和69.73%，三者之間并無明顯差異。凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白溶解度分別下降至20.88%、32.93%和22.42%，其中以北太魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白溶解度保持效果較好，明顯優于其他兩種魷魚。3 種魷魚肌原纖維蛋白溶解性下降，是因為在凍藏過程肌原纖維蛋白發生變性或者通過二硫鍵等發生交聯聚集，造成肌原纖維蛋白可提取性下降[18]。阿根廷魷魚在凍藏45 d時，比初始肌原纖維蛋白溶解度下降了39.81%，下降速率明顯高于其他了兩組魷魚，推測其原因可能是由于阿根廷魷魚凍藏過程中造成更多活性巰基暴露并氧化形成二硫鍵，同時造成更多的蛋白質變性解旋，使肌球蛋白重鏈聚合，降低其鹽溶性。在0～120 d凍藏過程中，3 種魷魚肌原纖維蛋白溶解度整體變化趨勢較為相似。

2.4 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白濁度的變化

圖4 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白濁度變化情況Fig.4 Changes in turbidity of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白質溶液加熱后的濁度水平常用于表征溶液中蛋白質的聚集情況。凍藏對不同魷魚肌原纖維蛋白濁度的影響如圖4所示。阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白初始濁度存在較大差異，其中北太魷魚初始肌原纖維蛋白濁度最低，為0.355，明顯低于其他兩種魷魚，且在整個貯藏過程中始終低于其他兩種魷魚。凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白濁度分別增加至1.303、0.608和1.177，表明隨著凍藏時間延長，肌原纖維蛋白熱誘導的聚集程度不斷增強。在整個凍藏過程中，3 種魷魚肌原纖維蛋白濁度變化趨勢較為相似。這是因為經長期凍藏后，魷魚肌原纖維蛋白中巰基在低溫條件下氧化形成二硫鍵，同時肌原纖維蛋白表面疏水性不斷增加，導致其加熱時更容易發生聚集，使得肌原纖維蛋白溶液濁度增加[19]。凍藏120 d后，阿根廷魷魚肌原纖維蛋白濁度較初始增加了141.29%，明顯高于其他兩組，推測其原因可能是阿根廷魷魚肌原纖維蛋白含量較高，在加熱后相互聚集導致顆粒直徑較大，濁度升高幅度較大[20]。濁度分析結果與魷魚中肌原纖維蛋白質量濃度分析結果相互印證。

2.5 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白乳化性的變化

圖5 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白乳化活性（A）和乳化穩定性（B）變化情況Fig.5 Changes in emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白質乳化性指一定條件下蛋白質所能乳化油脂的能力，是表征蛋白質功能特質的重要指標之一。圖5為3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白EAI和ESI的變化情況，北太魷魚肌原纖維蛋白初始EAI為18.89 m2/g，明顯高于其他兩種魷魚，而秘魯魷魚肌原纖維蛋白初始ESI最低，且在整個貯藏過程中一直低于阿根廷魷魚和北太魷魚。凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白EAI較初始分別下降了10.09、15.48 m2/g和11.63 m2/g；凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白ESI較初始分別下降了36.78%、46.85%和42.69%。低溫凍藏過程中，3 種魷魚肌原纖維蛋白乳化性能均不斷降低；在整個凍藏過程中，3 種魷魚肌原纖維蛋白EAI和ESI變化趨勢較為相似。其原因可能是長期的低溫環境破壞了魷魚肌原纖維蛋白結構的完整性，導致肌原纖維蛋白與脂肪交聯能力不斷下降，從而使其EAI及ESI顯著降低[21]。從結果可以看出，在凍藏0～120 d范圍內，無論是EAI還是ESI，北太魷魚肌原纖維蛋白的下降速度明顯快于阿根廷魷魚和秘魯魷魚。這可能是隨凍藏時間延長，北太魷魚蛋白質氧化更加迅速，從而破壞蛋白質結構的穩定性，降低了蛋白與脂肪顆粒交聯的能力，使蛋白質不能形成穩定的界面膜，導致其蛋白乳化能力比其他兩組魷魚下降速率快。

2.6 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白起泡性和泡沫穩定性的變化

起泡性是蛋白質攪打時捕捉氣體形成泡沫的能力；泡沫穩定性指蛋白質泡沫維持的能力，即泡沫間液膜保持液體不析出的能力[22]。3 種魷魚凍藏過程中，肌原纖維蛋白起泡性及其泡沫穩定性的變化情況如圖6所示。阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚中，初始的肌原纖維蛋白起泡性和泡沫穩定性存在一定差別，北太魷魚初始肌原纖維蛋白起泡性僅為50%，在3 種魷魚中起泡性最低。3 種魷魚肌原纖維蛋白的起泡性均隨凍藏時間的延長而降低，而泡沫穩定性的變化趨勢與起泡性變化趨勢基本保持一致。3 種魷魚肌原纖維蛋白起泡性和泡沫穩定性下降的原因可能是隨凍藏時間延長，魷魚肌原纖維蛋白含量下降及變性程度不斷加劇，造成蛋白質分子間的范德華力及分子中氨基與羧基之間形成氫鍵的能力減弱[23]。凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白起泡性較初始分別下降了50.00%、60.00%和58.82%，泡沫穩定性較初始分別下降5.88%、8.89%和5.31%。經凍藏后北太魷魚肌原纖維蛋白起泡性及泡沫穩定性明顯低于阿根廷魷魚和秘魯魷魚。這與董士遠等[24]報道的結果相一致。

圖6 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白起泡性（A）及泡沫穩定性（B）變化情況Fig.6 Changes in foaming activity (A) and foam stability (B) of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

2.7 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白總巰基含量的變化

圖7 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白總巰基含量變化情況Fig.7 Changes in total sulfhydryl contents of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

巰基具有較強的親核性和還原性，對維護肌原纖維蛋白空間結構穩定、保持理化和功能性質具有重要意義。由圖7可見，在凍藏15～30 d時，3 種魷魚肌原纖維蛋白總巰基含量均急速下降，而凍藏30 d后下降速度趨于平緩；在凍藏過程中，3 種魷魚肌原纖維蛋白總巰基含量變化趨勢較為相似，三者之間并無明顯差異。3 種魷魚肌原纖維蛋白總巰基含量不斷下降，可能是因為肌原纖維蛋白冷凍變性逐漸加劇，加上冰晶顆粒產生的機械損傷作用破壞了肌原纖維蛋白空間結構，使得內部巰基暴露出來，進而被氧化形成二硫鍵[25-26]。凍藏120 d后，阿根廷魷魚肌原纖維蛋白總巰基含量較初始下降了76.66%，下降速率高于其他兩種魷魚，這可能是因為阿根廷魷魚肌原纖維蛋白中有較多活性巰基（—SH1和—SH2）暴露出來，導致Ca2+-ATPase活性下降，進而造成了總巰基含量的下降。Chantarasuwan[27]和Kittiphattanabawon[28]等研究也指出，凍藏肌肉蛋白質中總巰基含量的下降往往也伴隨著Ca2+-ATPase活性的不斷下降，表明總巰基含量的下降與Ca2+-ATPase活性之間具有一定的相關性。

2.8 魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白羰基含量的變化

圖8 3 種魷魚凍藏過程中肌原纖維蛋白羰基含量變化情況Fig.8 Changes in carbonyl contents of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白質易被自由基氧化修飾而產生羰基化合物，肌肉中羰基含量一般可作為判斷蛋白質氧化程度的重要指標[29]。如圖8所示，凍藏0～15 d時，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白羰基含量表現出相似的增加趨勢，且三者之間無明顯差異。凍藏120 d后，阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白羰基含量較初始分別增加了8.74、13.95 nmol/mg和4.79 nmol/mg，這可能是因為在凍藏過程中活性氧自由基攻擊蛋白質氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基，經一系列反應后生成氨基及相應的羰基衍生物；同時，活性氧自由基也能導致蛋白質肽鏈斷裂，即在斷裂地方也可產生羰基基團，致使肌肉中羰基含量不斷增加[30-32]。凍藏0～120 d，北太魷魚羰基含量由1.57 nmol/mg增加至15.52 nmol/mg，增加速率明顯高于其他兩種魷魚，這可能是由于北太魷魚肌肉中含有較多的促氧化成分（如自由基等），導致北太魷魚蛋白質氧化迅速，致使羰基含量明顯增加。而阿根廷魷魚和秘魯魷魚羰基含量在整個凍藏期間變化趨勢較為相似，并無明顯差異。

3 結 論

以阿根廷魷魚、北太魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白為對象，研究凍藏對3 種魷魚肌原纖維蛋白功能特性的影響情況。結果表明，隨著凍藏時間延長，3 種魷魚肌原纖維蛋白功能特性不斷降低，同時其冷凍氧化程度均不斷增加。其中，阿根廷魷魚肌原纖維蛋白質量濃度、Ca2+-ATPase活力、溶解性和總巰基含量下降速度明顯低于北太魷魚和秘魯魷魚，且濁度增加程度明顯高于其他兩組魷魚；北太魷魚肌原纖維蛋白起泡性、泡沫穩定性、乳化性、乳化穩定性下降速度及羰基含量增加量則高于阿根廷魷魚和秘魯魷魚。綜上，3 種魷魚在低溫凍藏過程中，肌原纖維蛋白理化特性表現出相同的變化趨勢，但不同理化特性下降幅度及速率有所不同。