基于trnH-psbA和matK序列的不同種油茶種苗DNA條形碼分析

代佳妮　于靖　戚華沙　鄭蔚　王健　吳友根　賴杭桂　胡新文

摘 ?要：為有效鑒別出不同種油茶種苗，收集101份不同種油茶種苗作為試材，其中18份越南油茶、79份普通油茶、1份博白大果油茶、3份紅花油茶，利用葉綠體基因組trnH-psbA和matK序列進行擴增并測序分析，隨后對序列進行拼接及特征分析，并計算樣本種間及種內遺傳距離，構建系統發育樹。結果表明：101份供試材料的trnH-psbA序列全長381 bp，有10個變異位點，可通過變異位點鑒別出越南油茶、紅花油茶及部分普通油茶，系統發育樹將越南油茶聚為一支，自展支持率為64%;matK序列全長797 bp，有5個變異位點，可通過變異位點鑒別出越南油茶、紅花油茶及部分普通油茶，系統發育樹將紅花油茶聚為一支，越南油茶聚為一支，自展支持率分別為65%和64%。因此，trnH-psbA序列可對越南油茶進行有效鑒別，而matK序列可對越南油茶和紅花油茶進行有效鑒別。該研究結果對避免油茶種苗混雜、規范海南油茶種苗市場有一定的指導意義。

關鍵詞：trnH-psbA序列;matK序列;油茶;DNA條形碼

中圖分類號：S794.4 ? ? ?文獻標識碼：A

DNA Barcoding Identification of Different Species in Camellia Based on trnH-psbA and matK Sequences

DAI Jiani1， YU Jing1*， QI Huasha1， ZHENG Wei1， WANG Jian1， WU Yougen1， LAI Hanggui2， HU Xinwen2

1. Institute of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Hai-kou， Hainan 570228， China

Abstract： In order to effectively identify the species of Camellia seedlings， we collected 101 samples of Camellia seedlings as the test materials， including 18 C. vietnamensis， 79 C. oleifera， 1 C. gigantocarpa， and 3 C. chekiangoleosa. In order to identify all the samples effectively， the trnH-psbA and matK sequences of the chloroplast genome were used for amplification and sequencing analysis， followed by splicing and characterization of the sequences. Subsequently， the sequences were spliced and analyzed， and the genetic distances between the samples were calculated， and the phylogenetic tree was constructed. The results showed that the trnH-psbA sequence of the 101 test materials was 381 bp in length and had 10 mutation sites， which could be used to identify C. vietnamensis， C. chekiangoleosa and parts of C. oleifera. Phylogenetic trees gathered C. vietnamensis as a branch with a self-developed support rate of 64%. The matK sequence showed 797 bp in length and had 5 mutation sites. C. vietnamensis， C.chekiangoleosa and parts of C. oleifera could be identified by the mutation sites. The phylogenetic tree showed that all C. chekiangoleosa species were clustered into one branch with a self-developed support rate of 65%， and all C. vietnamensis species were clustered into one branch with a self-developed support rate of 64%. Therefore， the trnH-psbA sequence could be used to identify C. vietnamensis effectively， and the matK sequence could be used to identify C. vietnamensis and C. chekiangoleosa effectively. The results have certain practical significance for avoiding the hybridization of Camellia seedlings as well as regulating the Hainan Camellia seedling market.

Keywords： trnH-psbA sequence; matK sequence; Camellia; DNA barcode

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.001

油茶是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）中種子油脂含量較高且具有一定經濟價值的植物總稱，所屬物種約有50個，多為常綠小喬木[1]。油茶籽油中不飽和脂肪酸的含量高于90%，此外，還富含植物甾醇、維生素E、多酚、角鯊烯和類胡蘿卜素等多種功能性成分，在預防和治療心腦血管疾病、抗菌消炎、抗老化等方面，均可發揮一定的作用[2]。油茶在中國已有約2000年的栽培歷史，是我國四大木本油料作物之一，具有重要的經濟、社會和生態價值[3]，其在長江流域和亞熱帶的高山及丘陵地帶多有種植[4]，分布于湖南、江西、福建等18個省市[5]。我國油茶種質資源非常豐富，主栽培種包括普通油茶（Camellia oleifera Abel.）、越南油茶（Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu）、博白大果油茶（Camellia gigantocarpa）、紅花油茶（Camellia chekiangoleosa）等[6]。海南省曾是廣東的一個行政區，加之部分海南島油茶果形接近高州油茶，因此，有些學者和海南民間多數認為海南島油茶屬高州油茶（越南油茶C. vietnamensis）[7]。越南油茶適應海南島常年高溫高濕的生態環境，但產果量低于普通油茶。近年來，為了提高茶果產量，許多種植戶試圖引進內陸普通油茶在海南島上種植，但外來苗木在海南島的表現普遍較差，生長速度緩慢、抗逆性差、易受病蟲侵害，從而導致存活率較低，盲目的大面積引種普通油茶曾一度造成了海南油茶產業的重大損失[8]。目前，海南省市場上的油茶種苗魚龍混雜，不少商販利用普通油茶種子繁育實生苗或作為砧木以降低育苗成本，種植戶不慎購買后會面臨油茶死亡率高、結果率低的風險。因此，采取有效手段對油茶種苗進行鑒別，對海南油茶產業的發展有著重要的實際意義[9]。

在油茶種質資源鑒定方面，目前常用的有形態學鑒定和分子標記技術2種方法。在形態學鑒定方面，主要以數量性狀作為依據進行分類，如劉姝利等[10]選取了50株湖北麻城的早熟油茶，通過觀測其種實顏色、形狀及成熟期等性狀，對該地油茶種質資源進行了評估;楊立榮等[11]以海南省21個老油茶林為研究對象， 取其種實為實驗材料，對果實質量、出籽率、果皮厚度等10個數量性狀指標進行了觀測，從而探究了海南油茶與高州油茶的異同之處，為提高種質資源選育效率提供了基礎。在分子學方面，姜德志等[12]選取了109個油茶種質材料為樣本，采用ISSR分子標記和聚類分析，鑒定了材料間的親緣關系;謝薈等[13]利用SRAP分子標記，圍繞廣西省廣寧紅花油茶種質資源遺傳多樣性展開了研究?；诜肿訑祿跋鄳治鍪侄螒糜诜诸愯b定是對傳統鑒定方法的有益補充，尤其是DNA條形碼技術的出現，為物種鑒定提供了新的思路。DNA條形碼是通過一段較短的標準基因片段作為分子探針，對物種進行鑒定的分子生物學技術。目前，葉綠體片段matK、rbcL、trnH-psbA和核糖體基因及其轉錄間隔區的ITS/ITS2等標準條形碼常以不同的組合的形式用于植物鑒定中[14]。與其他鑒定方法相比，使用基于測序的DNA條形碼可以有效提高物種鑒定穩定性、縮短鑒定時間、降低物種鑒定技術門檻，因此，為了更好地對海南油茶種苗進行鑒定，本研究收集了海南大學儋州校區油茶種質資源圃的101份油茶材料，基于DNA條形碼技術，利用trnH-psbA序列和matK序列對不同油茶樣本進行鑒定，旨在評價這2個序列在鑒別不同油茶物種上的可行性及有效性，為不同種油茶種苗的鑒別提供理論依據和技術支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗材料 ?于2018年采自海南大學儋州校區的油茶種質資源圃，共101份樣本，包括越南油茶18份，紅花油茶3份，博白大果油茶1份，普通油茶樣本79個，試材編號及樣品信息見表1。采集油茶新梢幼葉，迅速用硅膠干燥，常溫保存。

1.1.2 ?試劑和儀器 ?植物基因組DNA提取試劑盒（中國福際FORE GENE公司）、引物（上海生工）、瓊脂糖、PCR MIX（含染料）、GoldView核酸染液、1×TAE緩沖液、2kb DNA marker、無水乙醇、β-巰基乙醇、6×Loading Buffer。電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特）、臺式高速冷凍離心機（西川蜀科）、萬分之一分析天平（上海佑科）、PCR擴增儀（杭州安杰思）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）、迷你電泳儀（杭州奧盛）、全自動雪花制冰機（常熟雪科）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?葉片總DNA提取 ?經硅膠干燥的葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒提取各樣本總DNA。用萬分之一分析天平稱取瓊脂糖1.00 g，加入1× TAE緩沖液50 mL，配制2.00%瓊脂糖，混勻后微波爐加熱2 min，滴加GoldView核酸染液2 μL，混勻倒入電泳槽中，待凝固后將電泳槽放入電泳儀中。取每個樣本總DNA 5 μL 和6× Loading Buffer 1 μL混勻后點樣進行電泳檢測，剩余總DNA保存4 ℃冰箱備用。

1.2.2 ?PCR擴增 ?參照Kuzmina等[15]和Sang等[16]的方法設計適用于油茶trnH-psbA和matK序列的特異性引物，分別用于PCR擴增和測序。trnH-psbA正向引物序列：GTTATGCATGAAC GTAATGCTC，反向引物序列：CGCGCATGGTG GATTCACAATCC;matK正向引物序列：CGTAC AGTACTTTTGTGTTTAC GAG，反向引物序列：ACCCAGTCCATCTGGA AATCTTGGTTC。PCR反應體系（25 μL）：PCR Mix 12.5 μL，引物F（10 μmol/L）1.0 μL，引物R（10 μmol/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增所得產物在0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.3 ?雙向測序 ?委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.3 ?數據處理

獲得測序峰圖后，利用CodonCode Aligner V 8.0.1軟件進行序列校對拼接，在此基礎上輔以人工校正。為了驗證所得序列是否為目標序列，使用NCBI在線工具對完整的trnH-psbA和matK序列進行BLAST相似性檢索（越南油茶trnH-psbA序列的GenBank登錄號為KX121735.1，matK序列的GenBank登錄號為KX216418.1;紅花油茶trnH-psbA序列的GenBank登錄號為HQ427072.1，matK序列的GenBank登錄號為MG431968.1;博白大果油茶trnH-psbA序列和matK序列的GenBank登錄號均為AB443612.1;普通油茶trnH-psbA序列和matK序列的GenBank登錄號均為KY406750.1。）。序列間變異位點的分析、種內和種間遺傳距離的計算[基于Kimura-2- Parameter （K2P）模型]以及鄰接（NJ）系統發育樹的構建均利用MEGA 5.0軟件進行分析完成。

2 ?結果與分析

2.1 ?總DNA提取和PCR擴增

本試驗101份樣本提取總DNA電泳質量檢測均出現明亮清晰且單一的條帶，說明干燥油茶新梢幼葉樣本總DNA提取成功率為100%（圖1）。由圖2和圖3可知，PCR產物電泳條帶清晰，表明該序列擴增條帶純度較高;有些條帶也出現亮度偏暗情況，表明PCR擴增產物濃度偏低。

2.2 ?trnH-psbA和matK序列的特征分析

如表2所示，trnH-psbA序列長381 bp，G+C含量24.90%，符合葉綠體基因GC含量較低的特點，有10個變異位點，占全長的2.68%，有7個簡約信息位點，占總長度的1.84%，轉換與顛換的比值為0.52，能夠提供較多的物種鑒定信息。matK序列全長797 bp，G+C含量為32.50%;簡約信息位點共3個，序列較保守;變異位點5個，分別為202、583、700、708、782 bp位點;序列的轉換與顛換的比值為1.06，主要是G與A之間發生轉換。

由表3可知，trnH-psbA序列根據10個變異位點把101份油茶樣本歸類成12大類，變異位點分別為117、173～179、253、280、281、331、362、

363、368、375 bp。其中，類型五（博白大果油茶）在368 bp和375 bp分別由G和T變為T和G，117 bp缺失，由此根據3個變異位點來鑒別博白大果油茶，但本實驗只有1個博白大果油茶樣本，需進一步驗證。3份紅花油茶樣本被歸為兩類（類型三和類型六），均在331 bp由T變異為C，在368 bp由G變異為T，因此可初步根據331 bp和368 bp兩個變異位點來鑒別紅花油茶。18份越南油茶樣本中有17份trnH-psbA序列完全一致，類型一（番賽一）在375 bp存在1處種內變異，這可能與環境、地理因素的影響相關，其余越南油茶樣本均歸類為類型二，在331、363、368 bp處發生變異，初步認為這3個變異位點可用來鑒別越南油茶。通過比較79份普通油茶（表1中序號為23～101）的trnH-psbA序列，發現均出現變異位點，歸類為類型四、類型七至類型十二，所有普通油茶樣本在363 bp處均未發生變異，大部分普通油茶在331 bp處未變異，少量普通油茶在331 bp處變異為C，因此可根據331 bp和363 bp這2個變異位點來鑒別部分普通油茶。

由表4可知，matK序列根據5個堿基位點把101份油茶樣本歸類成6大類，變異位點分別為202、583、700、708、782 bp。其中，類型一包括18份越南油茶，在583 bp位點由G變為A，該變異位點可用來鑒別越南油茶，類型二包括3份紅花油茶樣品，均在202 bp處由A變異為C，其余位點無變異，因此202 bp可用于紅花油茶的鑒別。類型三、類型四、類型五對應的堿基突變位點分別為708、782、700 bp，其樣品均為普通油茶，因此，這3個位點可用于普通油茶單株的鑒別。類型六（67份普通油茶和1份博白大果油茶）的matK序列均未發生變異，即博白大果油茶未產生特異性的變異位點，matK序列未能將博白大果區分鑒別出來。

2.3 ?trnH-psbA序列種內、種間遺傳距離分析

種間遺傳距離大于種內遺傳距離可作為理想DNA條形碼序列要求，trnH-psbA序列種內和種間遺傳距離見表5和表6，普通油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.005，最大種內遺傳距離為0.011，不滿足理想DNA條形碼要求，表明trnH-psbA序列不能有效區分普通油茶與其他油茶。紅花油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.003，最大種內遺傳距離為0.003，不滿足理想

DNA條形碼的要求，表明trnH-psbA序列不能有效鑒別出紅花油茶。博白大果油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.005，沒有種內遺傳距離（只有1個樣本），無法通過遺傳距離得出結論，若加大樣本量可進一步得到驗證。越南油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.003，最大種內遺傳距離為0.003，初步表明該序列不能有效鑒別越南油茶。

2.4 ?matK序列種內、種間遺傳距離分析

由表7和表8可看出，越南油茶最大種內遺傳距離為0，與其他油茶最小種間遺傳距離為0.001，其種間遺傳距離大于種內遺傳距離，表明matK序列可將越南油茶與其他油茶進行區分。普通油茶最大種內遺傳距離為0.001，與其他油茶的最小種間遺傳距離為0，即matK序列無法對普通油茶進行鑒別。紅花油茶的最大種內距離為0，與其他油茶的最小種間距離為0.001，表明matK序列可用來鑒別紅花油茶。由于博白大果油茶只有1個樣本，無法通過遺傳距離得出結論，若加大樣本量可進一步得到驗證，除此之外，可通過博白大果所特有的外形長勢將與其他品種進行區分鑒別。綜上所述，matK序列可鑒別紅花油茶和越南油茶。

2.5 ?系統發育樹的構建

2.5.1 ?trnH-psbA序列系統發育樹的構建 ?通過MEGA 5.05軟件用NJ法構建系統發育樹，trnH-psbA序列如圖4所示，所有樣本聚為6大支。其中18個越南油茶樣品聚為一大支，自展支持率為64%;樣品H9、H19、仙207和仙93聚為一大支，自展支持率為89%;樣品15-2、D6、N3、N8、N9、N41聚為一大支，自展支持率為66%。長林53、仙41等11份普通油茶和1份博白大果油茶聚為一小支，自展支持率為63%，表明普通油茶與博白大果親緣關系較近，可能在物種進化過程中發生了基因交流;3份紅花油茶中，有2份樣品（紅二、紅三）聚為一支，紅一則單獨成一支，自展支持率均低于50%，可能因為紅花油茶的種源差異較大且多態性豐富。通過對系統發育樹的分析得出，利用trnH-psbA序列可有效區分越南油茶和其他油茶。

2.5.2 ?matK序列系統發育樹的構建 ?matK序列系統發育樹的構建結果如圖5所示，其中18份越南油茶單獨聚為一支，3份紅花油茶單獨聚為一支，自展支持率分別為64%和65%;B6、GC8、Z12Z22H17等10份普通油茶樣本聚為一支，自展支持率為64%;博白大果與其余普通油茶未聚成支。以上結果表明matK序列可鑒別出紅花油茶和越南油茶，但不能對其他油茶進行區分鑒別。

3 ?討論

油茶是我國特有的木本油料樹種[1]，其籽油中含有脂肪酸、植物甾醇、維生素E、多酚、角鯊烯和類胡蘿卜素等多種功能活性成分[2]，具有重要的經濟、社會和生態價值[3]。研究表明，DNA條形碼技術可有效地對不同物種進行分類鑒定，但在山茶科植物評價和鑒別上應用較少[17]，目前，國際植物學界主推的植物條形碼序列主要有ITS2、matK、rbcL、trnH-psbA、rpoB等，其中matK序列的PCR擴增成功率比較低，引物的通用性比較差[18]。trnH-psbA序列在物種鑒定方面有較高的鑒定成功率[19-20]，且葉綠體序列trnH-psbA在物種水平和屬水平鑒定效率遠高于葉綠體其他條形碼候選序列[21]。

在山茶屬植物鑒別方面，戚華沙等[9]選取trnH-psbA、rbcL、matk和ITS2序列作為目的序列，對不同種油茶種子進行鑒定，其中，利用trnH-psbA序列可將普通油茶與其他油茶種進行有效鑒別，而matK序列則可用來鑒別越南油茶。在此基礎之上，本研究利用DNA條形碼技術，選取了trnH-psbA和matK序列對101份油茶樣品進行鑒別。

結果表明，越南油茶可基于trnH-psbA序列和matK序列進行鑒別;而紅花油茶和普通油茶則更適用基于matK序列的DNA條形碼進行鑒定，其中，對普通油茶的鑒別還需進一步實驗驗證;可初步根據trnH-psbA序列的3個變異位點來鑒別博白大果油茶，但本研究博白大果油茶樣品不足，還需進一步驗證。綜合以上結果，基于DNA條形碼技術，聯合使用trnH-psbA、和matK序列，可對越南油茶和紅花油茶進行有效鑒別，該結果可為不同種油茶種苗的鑒別提供科學依據。除此之外，DNA條形碼技術的使用還可減少海南油茶種苗混雜的情況，對規范海南油茶種苗及茶油市場，推動海南油茶產業更好發展有重要意義。日后可通過更多實驗，探索出更多適合于山茶科植物，特別是油茶物種分類鑒別的理想DNA條形碼候選序列。

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責任編輯：黃東杰

收稿日期? 2020-03-01;修回日期? 2020-05-26

基金項目? 海南省自然科學基金高層次人才項目（No. 820RC585）;海南省重大科技計劃項目（No. ZDKJ2017004）。

作者簡介? 代佳妮（1996—），女，碩士研究生，研究方向：植物次生代謝。*通信作者（Corresponding author）：于? 靖（YU Jing），E-mail：yujinghxy@163.com。