花椰菜白色花球變紫代謝物的測定及主成分分析

郎朗　牛國?！螘哉埿←悺∥恼A　江漢民　劉莉莉　黃亞杰　肖瑜　張艷玲　姚星偉

摘 要：花椰菜生產中低溫、高溫、水分或鹽分脅迫等常常導致白色花球變紫，嚴重時甚至完全失去商品價值，給生產造成巨大損失，迄今為止花椰菜白色花球變紫的代謝產物尚不清楚。為了深入解析花椰菜白色花球變紫機制，利用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）方法測定了花椰菜花球變紫前后代謝物。共檢測出10種花青素成分，白色花球樣本間花青素含量差異不顯著，但不同程度變紫花球中花青素含量差異顯著，白色與紫色樣本之間花青素含量也存在顯著差異。主成分分析和因子分析表明，芍藥素 O-己糖苷、矢車菊素半乳糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖甙氯化物與花球變紫的相關性較強。由此推測花椰菜白色花球變紫很可能與矢車菊合成途徑密切相關。

關鍵詞：花椰菜;花球變紫;花青素;主成分分析;因子分析

中圖分類號：S635.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）04-057-05

Abstract： The white cauliflower curds often become purple due to low temperature， high temperature， water or salt stress， which decrease their commercial value seriously and cause huge losses for the field production. The metabolites of purplish curds in white cauliflower are not clear yet. Therefore， LC-MS / MS method was used to determine the metabolites of the purplish curds in white cauliflower. Ten anthocyanins were detected in the experiment， there was no significant difference in anthocyanin content among different white curds， but significant difference among different purplish curds， and there was also significant difference in anthocyanin content between white sample and purplish curds. Principal component analysis and factor analysis showed that paeoniflorin o-hexoside， cyanidin galactoside and paeoniflorin-3-O-glucoside chloride had a great correlation with the purplish curds in white cauliflower. The result indicated that the purplish curds in white cauliflower was closely related to the synthetic pathway of cyanidin. This study provided a reference for further research on the mechanism of purplish cauliflower.

Key words：Cauliflower; Purplish curds; Anthocyanins; Principal component analysis; Factor analysis

花椰菜營養豐富，味道鮮美，同時具有抗癌防癌的保健功能，因此深受廣大消費者的喜愛[1]。我國是世界上花椰菜栽培面積和產量最大的國家，2018年我國花椰菜栽培面積54.87萬hm2，約占世界栽培總面積的40%[2]，花椰菜在我國蔬菜生產中占有重要地位。

花椰菜是為數不多的以花器官為食用部位的蔬菜作物之一，生長發育過程與食用葉片、果實、根等蔬菜作物相比更易受到環境影響?；ㄒ松a中如遇到高溫、光照[3]、水分脅迫、低溫[4]等惡劣環境條件，容易出現花球變紫的現象?；ㄇ蜃冏巷@著影響花椰菜外觀品質和商品價值，大大增加了農民種植風險和花椰菜生產不確定性，嚴重影響農民種植收益。開展花球變紫機制研究對解決該產業難題具有非常重要的意義。

花椰菜花球變紫與花青素累積密切相關?；ㄇ嗨睾吭黾邮腔ㄇ蜃冏系母驹騕5]。RAHIMM M A [6]比較了青花菜紫色和綠色花青素含量，證明紫色下胚軸花青素含量是綠色的15倍。近年來，科學家還利用分子生物學手段驗證了ANS、BoMYB2、BoTT8和BoDFR等基因和轉錄因子與花椰菜花球紫色密切相關[6-8]。

代謝產物是基因表達的最終產物，可以最直接地反映生命現象，因此代謝組學越來越受到科學家的關注[9-10]。迄今為止還沒有花椰菜花球變紫代謝產物的相關報道。為此本試驗對花球變紫代謝產物進行了分析，希望為解決花椰菜變紫產業難題提供實驗數據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為11和PW-161花椰菜純合自交系，由天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所提供。11為低溫條件下花球易變紫色的花椰菜自交系。PW-161為低溫條件下花球不變紫色的花椰菜優良自交系。11株型直立，護球性好，波浪形葉片，葉色淺綠色，花球周正、潔白、高圓，一般配合力高，低溫花球變紫明顯。PW-161株型半開張，橢圓形葉片，花球緊實，周正、平整，低溫花球始終保持潔白不變紫色。2018年8月1日將2份材料同期播種于天津市農業科學院武清創新基地，采用穴盤播種，穴盤規格為50穴，每份材料播種100穴，每穴1～2粒。2018年9月10日待幼苗長到3葉1心時定植于天津市農業科學院武清創新基地日光溫室內，株行距50 cm× 50 cm，每份材料每個小區定植30株，小區面積10 m2，定植3個小區，每份材料種植90株。2019年3月10日前后待花球成熟后（花球直徑15～20 cm），分別采集材料11深紫色花球組織，11淺紫色花球組織、11未變紫色即白色花球組織以及PW-161純白花球組織各1.0 g，置于液氮中備用。采用隨機區組設計，每個處理設3次重復。

1.2 方法

將備用樣本取出，真空冷凍干燥，利用研磨儀（MM400，Retsch）30 Hz 研磨1.5 min至粉末狀。稱取100 mg粉末，溶解于1.0 mL的70 %（φ）甲醇水溶液中，將樣品置于4 ℃冰箱中12 h，期間渦旋3次，提高花青素提取率。之后將樣品從冰箱中取出，離心（轉速10 000 r·min-1，10 min）后，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于液相色譜串聯質譜分析（LC-MS/MS）。

數據采集儀器系統主要包括超高效液相色譜（UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC）（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串聯質譜Tan-dem mass spectrometry MS/MS）（Applied Biosystems 4500 QTRAP）。色譜條件：①色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSST3 C18，1.8 ?m，2.1 mm × 100 mm。②流動相：水相為含0.04%（φ）乙酸的超純水;有機相為含0.04%乙酸的乙晴。③洗脫梯度：0 min水/乙晴（95∶5 V/V），11.0 min為5∶95 （V/V），12.0 min為5∶95（V/V），12.1 min為95∶5 （V/V），15.0 min為95∶5（V/V）。④流速0.4 mL·min-1;柱溫40 ℃，進樣量5 μL。質譜條件：電噴霧離子源溫度500 ℃，質譜電壓5500 V，簾氣25 psi（約等于172.38 kPa）。

基于數據 MWDB（metware database）以及代謝物信息公共數據庫，對質譜檢測的一級譜、二級譜進行定性分析，部分物質定性分析時，去除了同位素信號，含K+、Na+、NH4+的重復信號，以及其他更大分子質量物質的碎片離子重復信號。代謝物結構解析參考了MassBank（http：//www.massbank.jp）、KNAPSAcK（http：//kanaya.naist.jp/KNApSAcK）、HMDB（http：//www.hmdb.ca）（Wishart et al. 2013）、MoTo DB（http：//www.ab.wur.nl/moto/）和METLIN（http：//metlin.scripps.edu/index.php）等已有質譜公共數據庫。代謝物定量是利用三重四級桿質譜的多反應監測模式分析完成。獲得不同樣本的代謝物質譜分析數據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜峰進行積分校正。

1.3 數據分析

利用Aanlyst1.6.3軟件對原始數據進行定性定量分析。利用MultiaQuant軟件進行色譜峰積分和校正工作，每個色譜峰面積代表對應物質的相對含量，最后導出所有色譜峰面積積分數據。利用SPSS Statistics 22.0分析軟件進行花青素多因素方差分析、主成分分析和因子分析。

2 結果與分析

2.1 花椰菜花球花青素相對含量分析

本次試驗共檢測到10種已知花青素類代謝物（表1）。

從表2可以看出，除了成分1和成分10在兩個白色樣本中基本沒有被檢測到外，其余8種花青素代謝物在所有樣本中都被檢測到。對不同樣本間進行差異顯著性分析，表明除了PW-161和11白色樣本之間花青素含量沒有顯著差異外，其他樣本之間花青素含量都存在顯著差異（表3）。從上述結果可以看出，白色花球間花青素含量差異不顯著，但是在不同程度的變紫花球中花青素含量差異顯著，白色樣本與紫色樣本之間花青素含量差異也顯著。

對10種花青素成分進行差異顯著性分析，表明除成分5、6和9與其他成分有顯著差異外，其他成分之間花青素含量差異不顯著（表4）。

2.2 花球變紫花青素代謝物主成分分析

根據特征值>1且累計方差貢獻率>80%的原則，提取前兩個主成分，第一主成分方差占所有主成分方差的72.28%，第二個主成分方差占所有主成分方差的14.27%，前兩個主成分方差累計貢獻率達到86.55%。絕大多數變量共同度都在80%以上，證明提取的公因子具有很好地解釋各變量的能力（表5）。

2.3 花球變紫花青素代謝物因子分析

對白色和紫色花椰菜花球進行主成分分析方法提取公因子進行因子分析。因子得分模型如下：

F1=0.137X1+0.07X2+0.13X3-0.13X4+0.13X5+0.12X6+0.01X7+0.12X8+0.14X9+0.14X10;

F2=-0.05X1-0.54X2+0.23X3+0.07X4+0.10X5-0.23X6+0.53X7+0.120X8+0.04X9-0.03X10。

從因子得分模型可以看出，F1在成分X1、X9和X10有較大的載荷值，與對應的芍藥素O-己糖苷（Peonidin O-hexoside）、矢車菊素半乳糖苷（Cyanidin 3-O-galactoside）和芍藥-3-O-葡萄糖甙氯化物（Peonidin 3-O-glucoside chloride）呈正相關，可將F1定義為矢車菊素合成途徑因子。F2在X2和X7中有較大的載荷值，與對應的矢車菊素 O-丁香酸（Cyanidin O-syringic acid）呈負相關;與天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（Pelargonidin 3-O-beta-D-glucoside）呈正相關。

2.4 花球變紫花青素代謝物主成分得分

利用基迪奧生物科技有限公司云平臺PCA在線分析軟件繪制PCA得分圖。從圖1可以看出11紫色花球樣本11-4、11-5、11-6聚為一類，11白色花球樣本11-7、11-8、11-9聚為一類，純白花椰菜花球樣本PW-161-1、PW-161-2、PW-161-3聚為一類，花球組織紫色最明顯的樣本11-1、11-3聚為一類。除11-2離群明顯外，各處理組間分離程度清晰。

3 討論與結論

不同種類的色素使植物呈現出五彩斑斕的色彩。迄今為止已知的天然色素有500余種?；ㄇ嗨厥且活悘V泛存在于植物中的重要次生代謝產物，屬于類黃酮類化合物。最常見的花青素主要有6種，分別為天竺葵素（pelargonidin）、矢車菊素（cyanidin）、飛燕草素（phinidin）、芍藥素（peonidin）、矮牽牛素（petunidin）和錦葵素（malvidin）[10]，其中矢車菊素甲基化合成芍藥素;飛燕草素甲基化合成矮牽牛素和錦葵素（圖2）?；ㄇ嗨厣锖铣梢资軠囟?、光照、水分、鹽分等環境因素的影響，使植物器官呈現藍色、紅色和橙色等色彩[11]。本研究通過液相色譜串聯質譜分析方法（LC-MS/MS）在花椰菜花球變紫前后的不同處理中檢測到矢車菊素、飛燕草色素、芍藥素、牽?；ㄋ睾吞祗每?大類花青素，其中芍藥素O-己糖苷（Peonidin O-hexoside）、矢車菊素半乳糖苷（Cyanidin 3-O-galactoside）和芍藥-3-O-葡萄糖甙氯化物（Peonidin 3-O-glucoside chloride）與花球變紫呈正相關，這3種成分主要與花青素的矢車菊素合成途徑相關。Liu[3]分析了青花菜變紫花球中花青素成分，共檢測到矢車菊素、飛燕草色素和錦葵素3種花青素，其中矢車菊素半乳糖苷（cyanidin3-O-galactoside）和矢車菊素3-O-葡萄糖（cyanidin-3-O-glucoside）含量最高，這兩種花青素參與了矢車菊素合成途徑;紫色花椰菜中也是以矢車菊素為主[12-13]。本試驗結果表明，矢車菊及其衍生物與花椰菜白色花球變紫具有較強相關性，與前人研究類似。ANS和UFGT基因是無色花青素形成有色花青素的關鍵基因，逆境脅迫下ANS過表達可以增加植物的花青素含量[14-16]。本試驗預測花椰菜花球變紫過程中ANS和UFGT基因起到了關鍵作用。后續試驗計劃從轉錄水平和基因水平對花椰菜花球變紫機制進行深入研究。本研究中第一主成分方差占所有主成分方差的72.28%，因此在評估這12個樣本的分類關系時可以主要參考PC1，雖然11-2離群，但與11-1、11-3的差異主要都在PC2這個維度上，第二個主成分方差占所有主成分方差的14.319%，該主成分影響略小，11-2離群對整個試驗結果影響不大，處理組間的差異大于組內差異，總體而言12個樣本分類效果較好。各處理內表達模式相似，試驗重復性較好。

筆者利用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）方法共檢測出花椰菜花球變紫前后10種花青素成分，其中6種成分為矢車菊素及其衍生物，并且3種為主成分。由此推測花椰菜白色花球變紫很可能與矢車菊合成途徑密切相關。本研究為深入解析花椰菜白色花球變紫機制提供了參考。

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