人工栽培桑黃不同生長期子實體的主要活性成分測定比較

張文雋 吳亞召 雷 萍* 馬婧嘉 賈 靜 張 歡

（1陜西省微生物研究所，陜西西安 710043；2陜西崇德生物技術發展有限公司，陜西西安 710201）

桑黃（Sanghuangporusspp.）隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），是多年生大型藥用真菌，因其通常生長于桑屬植物上，子實體為黃褐色而得名[1]?！侗静菥V目》詳細記載了桑黃的藥性：“味甘、性平。主治女子漏下赤白，血病腹內凝塊，腫痛，陰陽寒熱，不孕。療月經不調?！盵2]民間用于治療肝腹水、肝硬化等癥?，F代研究表明，桑黃有效活性成分有多糖類、黃酮類、三萜類、甾類、多酚類、吡喃類及生物堿等，具有顯著的醫療保健功效及較高的營養價值[3]。桑黃多糖類物質是桑黃主要有效成分之一，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗炎、護肝、降血糖血脂等廣泛的藥理作用[4]。黃酮類化合物是桑黃具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、增強心血管系統等作用的重要藥理成分[5]。桑黃含有的三萜類化合物具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等藥用功效[6-10]。不同生長發育期的藥用真菌子實體活性有效成分含量差異較大[11-13]。故藥用菌采收時間直接影響其有效成分及藥效。研究藥用菌生長期有效成分含量變化，對探索其適宜的采收期尤為重要。目前關于桑黃多糖、總黃酮和總三萜的研究報道主要集中在提取測定、分離純化和藥理藥效等方面，對不同生長期桑黃子實體中三種活性成分含量變化研究報道較少，為此筆者進行人工栽培桑黃不同生長期子實體的（以下稱桑黃子實體）多糖、總黃酮、三萜測定，以期為桑黃子實體的適時采收及質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桑黃桑-S子實體為2019年6月中旬至8月下旬采集自陜西省微生物研究所試驗基地，分別為原基發生后生長30 d、40 d、50 d、60 d、70 d、80 d、90 d、100 d。采收后桑黃子實體由鼓風干燥箱68℃烘干2.5 h，粉碎后過孔徑為0.85 mm篩，備用。

試劑：葡萄糖、蘆丁、齊墩果酸（均為標準品），美國Sigma；無水乙醇、苯酚、硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯仿、香草醛、冰乙酸、高氯酸（均為分析純）。儀器：WGL-65B鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司），FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），RE-5299旋轉蒸發器（鞏義市英峪予華儀器廠），TG16高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），LGJ-18S型冷凍干燥機（北京松源華興有限公司），TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計。

1.2 多糖測定方法

1.2.1 樣品制備

分別精確稱取待測桑黃樣品2.0 g，加入蒸餾水100 mL充分混勻，70℃水浴提取2 h，真空抽濾，收集濾渣按上述操作重復1次，合并濾液，旋轉蒸發濃縮至原體積1/5，加入無水乙醇至乙醇終濃度達80%，置于4℃冰箱靜置過夜，3 000 r/min轉速離心15 min，用80%乙醇洗滌沉淀，離心，此操作重復2次，沉淀用蒸餾水溶解定容至250 mL，即得多糖測定供試液。

1.2.2 標準曲線繪制

精確稱取105℃條件下干燥至恒重的無水葡萄糖對照品20 mg，于100 mL容量瓶中溶解定容，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別吸取標準溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL于25 mL具塞試管，加入蒸餾水至1 mL。然后加入5%苯酚溶液2 mL，振蕩搖勻，再加入濃硫酸7 mL，充分搖勻，靜置顯色30 min，于490 nm波長處測定吸光值，計算并繪制標準曲線。

1.2.3 供試液多糖含量的測定

吸取供試液0.5 mL，按照標準曲線制作方法操作，測定吸光值并計算不同生長期桑黃樣品中多糖含量。

1.3 總黃酮測定方法[14]

1.3.1 樣品制備

精確稱取待測桑黃樣品粉末10.0 g，加入70%乙醇200 mL，于室溫下浸提24 h，真空抽濾，收集濾渣按上述操作重復1次，合并濾液，真空濃縮回收乙醇，濃縮液中加水繼續濃縮以揮發殘留的乙醇，水液冷凍干燥，得桑黃提取物。準確稱取桑黃提取物17.3 mg于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得總黃酮測定供試液。

1.3.2 標準曲線繪制

精確稱取蘆丁對照品23.2 mg，于50 mL容量瓶中用70%乙醇溶解定容，配制成0.464 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別吸取標準溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶，加入5%NaNO2溶液1 mL，充分搖勻后放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，振蕩搖勻放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻后用70%乙醇定容，靜置顯色10 min，于510 nm波長處測吸光值，計算并繪制標準曲線。

1.3.3 供試液總黃酮含量的測定

吸取供試液3 mL，按照標準曲線制作方法操作，測定吸光值并計算不同生長期桑黃樣品中總黃酮含量。

1.4 總三萜含量測定方法

1.4.1 樣品制備

準確稱取待測桑黃樣品粉末0.2 g，置于100 mL具塞磨口三角瓶，加入氯仿50 mL，超聲處理60 min，放冷，移至100 mL容量瓶中，用氯仿洗滌三角瓶3次，洗滌液合并入同一容量瓶中，并加入氯仿定容至100 mL，搖勻，即得總三萜測定供試液[15-16]。

1.4.2 標準曲線繪制

精確稱取95℃干燥2 h齊墩果酸標準品10.0 mg，于100 mL容量瓶中用氯仿溶解定容，配制成0.1 mg/mL的齊墩果酸標準溶液。分別吸取齊墩果酸標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于5 mL具塞試管中，常壓下60℃水浴蒸干溶劑。依次加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出，立即冰浴冷卻5 min，再水浴調至室溫。用冰乙酸定容至5 mL，搖勻后于30 min內在548 nm波長處測吸光度值，計算并繪制標準曲線。

1.4.3 供試液總三萜含量的測定

吸取供試液1 mL，按照標準曲線制作方法操作，測定吸光值并計算樣品中總三萜含量。

1.5 數據統計與分析

采用Excel 2013和SPSS 17.0進行數據統計學分析與繪圖。

2 結果與分析

2.1 標準品回歸方程與相關系數

分別繪制多糖、總黃酮和總三萜測定的標準曲線，計算線性回歸方程與相關系數，結果見表1。由表1可知，相關系數均為0.99以上，符合檢測的要求。

2.2 不同生長期桑黃子實體的多糖、總黃酮、總三萜質量分數

不同生長時期桑黃子實體的多糖、總黃酮、總三萜質量分數及變化見表2、圖1、圖2。

表2 不同生長期桑黃子實體多糖、總黃酮、總三萜質量分數

圖1 不同生長期桑黃子實體的多糖、總三萜質量分數變化趨勢

圖2 不同生長期桑黃子實體的總黃酮質量分數變化趨勢

由表2、圖1和圖2可以看出，多糖、總黃酮、總三萜質量分數隨著桑黃子實體生長時間的遞增逐漸升高，分別在生長60 d、70 d時達最高，隨后又逐漸下降。

多糖、總三萜質量分數變化趨勢一致，在子實體生長30~70 d逐漸上升，70 d時達最大值，為4.26%、2.22%，之后又逐漸降低；總黃酮質量分數在子實體生長30~60 d快速上升，至60 d時達最高值（24.05%），生長70 d之后下降迅速。

3 小結

對桑黃的三種活性成分測定結果表明：人工栽培桑黃子實體生長70 d時，其多糖和總三萜質量分數達最高，為4.26%、2.22%，生長80 d次之，為3.87%、1.85%；生長60 d時總黃酮質量分數達最高，為24.05%，生長70 d時總黃酮質量分數僅次于60 d，為23.34%。綜合考慮這3種主要有效成分質量分數，再結合實際生產中的子實體產量，桑黃子實體生長70 d時應為最佳采收期，此時采收可有效保障活性成分含量，為市場提供更為優質的桑黃產品。