瓊脂對Komagataeibacter xylinus自發變異的控制

王志國,鐘春燕,張偉敏,*

(1.海南大學食品科學與工程學院,海南?？?570228; 2.海南椰國食品有限公司,海南?？?570311)

木駒形桿菌Komagataeibacterxylinus(或稱Acetobacterxylinum,Gluconacebacterxylinus)[1-2],產生的纖維素稱為細菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC),具有純度、結晶度、持水力、楊氏模量高及生物相容性好等獨特性能[3-5],廣泛應用于食品、醫藥等領域[6-9]。我國海南從1996年開始利用椰子水生產細菌纖維素(椰纖果),目前全省該類廠80多家,年產量約18萬噸,年產值近3億元。但椰纖果生產中一個較為突出的技術問題尚未能解決,即K.xylinus種子液制備時易變異,導致BC產量降低,甚至絕收,此外大量發酵廢液的排放,既造成一一經濟損失又嚴重污染環境。

Schramm等首次報道了K.xylinus變異現象。在搖瓶培養時,K.xylinus菌體會發生變異,從而形成具有中度缺陷和嚴重缺陷的突變體,相較野生型菌株,突變體在菌落特征及產BC能力方面都有顯著差異,后來陸續有學者就K. sp.變異現象進行了報道[10-12]。前期研究發現,該菌在靜態淺層培養中很穩定,在深層靜態培養及攪拌培養中易產生變異菌株[13-14]。此外,瓊脂對K.xylinus在不同培養方法下BC產量及結晶度具有較大影響。李少慧及Chao等認為,瓊脂使K.xylinus靜態培養中BC產量降低[15-16];但在搖瓶或攪拌培養中,因為瓊脂降低了剪切力[15],增加了游離細胞數量[15-16]，降低了BC結晶度,從而提高了產量[17]。

本實驗在靜態和動態培養中,研究培養基中添加瓊脂對K.xylinus自發變異的影響,采用涂布法對變異菌的數量進行測定,稱重法對BC的產量測定,同時運用粘度法和傅里葉變換紅外光譜法分別對BC的聚合度和結晶度進行分析,采用分光光度法測定發酵液中纖維素酶活力,以期探尋瓊脂對K.xylinus自發變異的控制及原因探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木駒形桿菌(Komagataeibacterxylinus) 本室分離保存;SH液體培養基1000 mL:葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母膏 5 g、檸檬酸1.15 g、Na2HPO42.7 g,121 ℃,滅菌20 min,其中加入20 g瓊脂成為固體培養基[18];種子液制備:固體培養基上(30 ℃,10 d)挑取5個菌落加入50 mL液體培養基中,30 ℃,靜態培養3 d;銅乙二胺溶液 中國紙漿造紙研究院。

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器 上海三申醫療器械有限公司;SHP-1500生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 常州市華普達教學儀器有限公司;UV-3200紫外-可見光分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;1-14高速離心機 德國Sigma;T27傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 含瓊脂培養液:種子液按5%(v/v)接種量接種至250 mL三角瓶中的150 mL液體SH培養液中(不添加或添加瓊脂0.05%和0.10%,以w/v計),30 ℃,靜態培養4 d或者120 r/min搖瓶培養4 d。

含泡沫塑料顆粒培養液:靜態培養中,防止攜帶BC的菌體下沉,培養液加入泡沫塑料顆粒(3 mm× 3 mm× 3 mm)。在超凈工作臺上,泡沫顆粒經紫外燈照射30 min后,直接無菌操作投入至已滅菌的液體SH培養液中,培養基的體積和接種方法同上,30 ℃,靜態培養4 d。

轉接培養:為了考察K.xylinus在添加瓊脂的培養液中,靜態和動態轉接培養中的自發變異,按5%(v/v)接種量接種至相對應的相同培養基組成和體積的培養液中,并按相對應的相同培養條件進行培養。

上述培養中,以靜態培養(不添加瓊脂)的為對照組,每個實驗重復三次。

1.2.2 變異菌計數 將30 ℃靜態或搖瓶4 d的發酵液經過無菌水10～104梯度稀釋,取0.1 mL稀釋液涂布于固體培養基上,30 ℃,培養7 d,變異菌與正常菌的菌落外觀差異明顯,正常菌的菌落小而凸起,表面干燥,變異菌的菌落大而扁平,表面濕潤[13]。

1.2.3 BC量測定 從發酵液中直接收集膜狀BC,而絮狀或顆粒狀BC經4000 r/m,20 min離心獲得,再將BC置于80 ℃,0.1 mol/L NaOH溶液中,維持2 h,冷卻后用0.1 mol/L HCl中和,自來水充分洗滌,在80 ℃下干燥至恒重后稱重。

1.2.4 BC聚合度及結晶度測定 銅乙二胺溶液法測定BC聚合度(Degree of Polymerization,DP):準確稱取經除雜冷凍干燥的BC 0.05 g,加入幾小塊銅片,用20 mL銅乙二胺溶液,在氮氣保護下攪拌溶解,使用烏氏粘度計(內徑0.5～0.6 mm)測定其流出時間,按下式計算其聚合度[19]。

式中：ηsp:增比粘度;t:試樣流出時間,單位s;t0:銅乙二胺溶液流出時間,單位s;[η]:特性粘度;c:纖維素濃度,單位g/mL。

BC結晶度測定:將除雜冷凍干燥的BC,剪刀剪碎,稱取2 mg,用300 mg KBr(光譜級,阿拉丁)充分研磨后壓片,使用T27型傅里葉變換紅外光譜儀測定樣品在4000～400 cm-1范圍內的吸光度[20],用基線量取法得到1428及897 cm-1的峰高,根據下列公式計算其結晶度[21-22]。

1.2.5 纖維素酶活力測定 發酵液在4000 r/min離心10 min,取上清液20 mL,加入硫酸銨達到60%(w/w),4 ℃,12 h后,4000 r/min離心10 min,收集沉淀,加入0.1 mol/L,pH5.0的乙酸鈉緩沖溶液3 mL,轉移至透析袋中透析至無銨離子,經PEG-20000濃縮后,加入0.1 mol/L,pH5.0乙酸鈉緩沖溶液,使其總體積為1 mL,成為粗酶液,取0.5 mL加入至1 mL乙酸鈉緩沖溶液配制的0.2%(w/v)CMC-Na中,37 ℃水浴,60 min,加入DNS試劑3 mL,沸水浴5 min,冷卻后再加入8 mL蒸餾水,540 nm波長測定吸光度。

表1 瓊脂對K. xylinus靜態培養中自發變異及BC產量的影響Table 1 Effects of agar on spontaneous mutation and BC weights of K. xylinus

纖維素酶活力單位為μ mol G/20 mL培養液60 min,其含義:20 mL培養液中的纖維素酶在37 ℃條件下,以CMC-Na為底物,水解60 min,生成的葡萄糖量。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次。Excel軟件中輸入數據,進行標準偏差計算、方差分析和Q檢驗。

2 結果與分析

2.1 瓊脂對K. xylinus自發變異及BC產量的影響

靜態培養,對照實驗中,在氣-液界面處,收集到的BC膜不完整(圖1A),而添加0.05%瓊脂或泡沫塑料小顆粒中則形成完整BC膜(圖1B和圖1C),添加0.10%瓊脂中也形成完整的BC膜。

圖1 添加瓊脂或泡沫塑料顆粒對 K. xylinus靜態培養中BC膜形成的影響Fig.1 Effects of agar or foamed plastic particles on BC pellicles in static culture 注:A.對照;B.0.05%瓊脂;C.泡沫塑料顆粒。

表1所示:K.xylinus靜態培養時,對照實驗(未添加瓊脂的靜態培養)中,變異菌數達4.63×105,占總菌數的38.33%,而添加0.05%和0.10%瓊脂的培養液,以及加入泡沫顆粒的培養液中沒有出現變異菌。

對照中,BC產量為0.16 g/L,氣-液界面是菌體生長繁殖及產BC的活躍層,變異菌在空間及營養物質方面與野生型競爭,導致BC產量最低;當瓊脂添加量為0.05%時,由于變異菌沒有出現,BC產量增加至0.38 g/L;當瓊脂添加量為0.10%時,BC含量反而下降,其原因在于盡管變異沒有發生,但瓊脂使發酵液粘度過大,營養物質不易滲透至BC膜表面,從而BC產量(0.28 g/L)降低,但仍較對照中的BC產量高。李少慧及Chao等人靜態培養時,瓊脂使BC產量降低[15-16],可能是因為他們的菌株在靜態培養時沒有發生變異的緣故。

靜態培養是制備K.xylinus種子液的主要方式,但由于培養容器裝液量多,液體的深度較大,種子液經過轉接后往往發生自發變異,導致其接種至生產培養基中時BC產量大幅下降[13]。本實驗發現,靜態方式制備種子液時,培養基中添加0.05%的瓊脂,即使連續轉接9次,種子液中也未曾出現變異菌,且培養液中菌體濃度保持在106CFU/mL以上(見圖2)。

K.xylinus動態培養時,變異菌數量高達1.32×107CFU/mL,占總菌數的88.60%,因而BC產量僅為0.09 g/L;0.05%瓊脂使變異菌的數量減少,變異菌率下降至66.39%,BC量提高至0.15 g/L;瓊脂量增加至0.10%時,變異菌沒有出現,此時BC產量達到最高,為0.34 g/L,與靜態培養中添加0.05%瓊脂的培養液中產量(0.38 g/L)相當。另外,因為瓊脂增加了培養液粘度,從而削弱剪切力對菌體產BC的不利影響[15-17]。但盡管培養液中添加0.10%瓊脂阻止了變異菌的出現,但如果連續轉接至第2次時,變異菌也會產生,往往經3～4次轉接后,培養液中幾乎都是變異菌(見圖2)。

圖2 K. xylinus轉接培養中的正常菌和變異菌的數量變化Fig.2 Changes in numbers of wild type and mutants during series of transfer passage cultures of K. xylinus

靜態和動態培養方式中,添加適量瓊脂阻止K.xylinus的自發變異,因而增加了BC產量。靜態培養中,0.05%瓊脂培養液連續轉接9次也沒有出現變異菌株。動態培養中,0.05%瓊脂培養液轉接過程中變異菌株易出現,瓊脂的添加量增加至0.10%時,初次培養和轉接第一次時,變異菌不會出現,但繼續增加轉接次數,變異仍會發生。繼續提高瓊脂的量,培養液粘度過大而無法進行動態培養。

2.2 瓊脂對BC的DP及結晶度的影響

圖3顯示:靜態培養中,BC的聚合度(DP)為5.03×103,瓊脂添加量為0.05%和0.10%的培養基中則分別為4.83×103和4.96×103,由此可見,靜態培養中,瓊脂對BC的DP影響不大(減小幅度皆小于4%);動態培養中,BC的DP為3.92×103,0.05%及0.10%瓊脂中BC的DP分別為3.61×103和2.95×103。由此可見,培養方式會影響BC的DP,搖瓶生產的BC的DP比靜態生產的低,降低22.2%,培養基中添加瓊脂,會加劇DP的下降,當瓊脂量為0.05%時,比靜態的DP下降26.7%,瓊脂量為0.10%時,下降幅度達42.2%。

圖3 瓊脂對BC的DP影響Fig.3 Effects of agar on DP of BC

靜態和動態培養中的BC在800～1500 cm-1范圍的的FT-IR圖譜見圖4和圖5,用基線量取峰高法測定BC的O’KI結晶指數,結果如表2所示:對照(未添加瓊脂的靜態培養)中的BC的結晶指數為3.14,這比文獻[21,23]報道的4.84要低,可能是菌株差異的緣故。

圖4 K. xylinus靜態培養中產生BC的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectrum of BC produced by K. xylinus in static culture

圖5 K. xylinus搖瓶培養中產生BC的FTIR譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of BC produced by K. xylinus in shaken culture

表2 瓊脂對K. xylinus產BC的結晶度影響Table 2 Effects of agar on O’KI index of BC produced by K. xylinus

表2可以看出:以未添加瓊脂的靜態產生BC的結晶指數為基準,靜態培養中,添加0.05%瓊脂,結晶指數降低至2.73,下降13.1%,當瓊脂量增至0.10%時,結晶指數為2.85,下降9.2%,其原因可能是高濃度的瓊脂,因粘度過大,不易滲透至氣-液界面的BC中,因而對纖維素的結晶過程干擾有限,從而與0.05%的瓊脂中的BC的結晶度相較而言,下降幅度略低(前者下降幅度13.1%,后者9.2%)。

動態培養中,未添加瓊脂中的結晶指數為2.54,下降19.1%,表明搖瓶培養降低了BC的結晶度。培養液中添加0.05%瓊脂,結晶指數下降至2.23,下降28.9%,當瓊脂增加為0.10%時,結晶指數為1.53,下降幅度達到最高51.3%?？梢?搖瓶培養時,添加瓊脂大大降低了BC的結晶指數,其原因可能是搖瓶培養時,瓊脂能更好地吸附于BC上從而嚴重干擾BC的結晶。

瓊脂對BC的結構影響與培養方式有關:從對DP影響的角度看:瓊脂在靜態培養中的影響較小(<4%),但在動態培養中卻加劇DP下降;從對結晶度影響的角度看:瓊脂在兩種培養方式中都導致BC結晶度極顯著下降(P<0.01),只是相較靜態培養,動態培養中下降的幅度更大。

2.3 瓊脂對培養液中K. xylinus的纖維素酶活力影響

靜態及搖瓶培養中皆檢測到纖維素酶活力(見圖6),這與Kenji等[24]的結論一致,兩種培養方式中,纖維素酶活力沒有差異,而瓊脂的添加對纖維素酶活力也沒有影響。

圖6 K. xylinus培養液中纖維素酶活力Fig.6 Activities of cellulase in K. xylinus culture

3 結論與討論

K.xylinus靜態和動態培養中,培養液中添加瓊脂阻止其發生自發變異,從而提高了BC產量,由于瓊脂靜態培養液連續轉接過程很穩定,適合于制備種子液。結構方面來說,瓊脂對靜態培養產生的BC的DP影響較小,但極顯著(P<0.01)下降BC的結晶度;對動態培養中的BC的DP和結晶度都極顯著(P<0.01)下降。

Coucheron[25]發現G.xylinusATCC 23769(或K.xylinusATCC 23769)中具有插入序列IS1031,該序列的存在導致K.xylinus易變異,當培養條件改變時,產BC的正常菌(Cellulose+,Cel+)或不產BC的變異菌(Cellulose-,Cel-)具有生長優勢:a.靜態培養時,BC膜使Cel+漂浮在氧氣充足的氣-液界面,而Cel-則處于液體中,因缺氧而漸亡[26]。本實驗中也發現,靜態培養中,氣-液界面有完整BC膜(0.05%和0.10%瓊脂及泡沫顆粒培養液)的培養液中沒有出現變異菌,而無完整BC膜(對照)的培養液中分離到變異菌株,但對于為何對照實驗中會產生不完整的BC膜尚無定論;b.動態培養時,充足的氧氣使Cel+過度生長,Cel-產生的概率增加,同時Cel+被所形成的BC包裹,而Cel-呈游離狀態,轉接時吸取的液體中,Cel-占有數量優勢,所以多次轉接后只剩下Cel-[27]。本實驗也發現,動態培養中易出現變異菌株,培養液中變異菌的百分含量隨轉接次數的增加而增加直至全部為變異菌,但0.10%瓊脂加入至培養液中時,盡管瓊脂干擾了BC球的形成,使BC呈粉狀,按上述觀點,轉接過程中Cel+和Cel-應共存,但實驗結果卻顯示轉接至第四次時,培養液中只有Cel-;Jung等通過透射電鏡證明,Cel-比Cel+有更完整的雙層膜結構,動態培養時,Cel-能承受剪切力而得以富集[28]。本實驗中培養液添加0.10%瓊脂在初次培養時只有Cel+,轉接一次時,也只有Cel+,且總量與初次培養時相近,說明0.10%瓊脂足以消除剪切力對Cel+破壞,但隨后的轉接過程中Cel+卻逐漸消失。

瓊脂對K.xylinus自發變異的控制的可能原因在于瓊脂消除了BC對細胞的脅迫:靜態培養時,一方面,氣-液界面層是菌體生長繁殖最活躍層,菌體分泌出BC后,BC仍附著在細胞膜上[1],而BC的密度(3.2 g/L)促使攜帶BC的細胞沉降,另一方面,K.xylinus是嚴格好氧菌[6],有向氣-液界面上浮的趨勢,于是攜帶BC的菌體處于反復的沉-浮運動狀態,BC就成為細胞的負擔或脅迫,該脅迫促使相關的維素合成酶的基因序列或表達向著不產BC方向變異。靜態培養中,培養液在培養容器中的高度是導致變異發生的關鍵因素:淺層培養時,BC的產生及膜的形成縮小甚至消除了細胞沉-浮運動的空間,因而消除了BC脅迫;深層培養時,細胞沉-浮運動有足夠的空間,長時間的BC脅迫導致變異發生,Cel-一旦產生,便占據氣-液界面,與正常菌在營養和空間上競爭,致BC膜不能完整形成。吳謙等[13]的實驗也表面靜態培養中的變異與培養液在培養容器中的高度緊密相關。瓊脂增加液體的粘度而抑制細胞的沉-浮行為,泡沫顆粒使菌體被固定在氣-液界面而消除細胞的沉-浮行為,因此靜態培養中,培養液中添加瓊脂或者泡沫顆粒就能控制K.xylinus自發變異;動態培養時,一方面,0.10%瓊脂使BC的結晶度極顯著(P<0.01)下降,同時,纖維素酶更易和BC接觸,這兩個因素使BC極易被纖維素酶水解,從而使BC的聚合度極顯著下降。低聚合度意味著低BC脅迫,從而抑制K.xylinus在動態培養中的變異,但轉接培養導致低BC脅迫長時間存在,故變異發生。