蘭科植物菌根真菌研究新見解

王美娜 胡玥 李鶴娟 李健 陳建兵 蘭思仁

摘?要：?蘭科（Orchidaceae）在地球生命系統演化中占有十分重要的地位，幾乎全部蘭科植物均處于不同程度的瀕危狀態，研究蘭科菌根真菌對于保護珍稀瀕危蘭科植物具有重要意義。該文在對菌根真菌相關的概念及研究方法進行綜述的基礎上，對蘭科菌根真菌的主要類群、特異性及其與蘭科植物稀有性之間的關系，以及蘭科菌根真菌與蘭科植物之間的營養關系和進化關系進行了總結。蘭科菌根真菌的研究方法可以歸納為經典研究方法、早期分子生物學方法、rDNA片段高通量測序法、宏基因組學方法。蘭科菌根真菌類群主要隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota）。根據蘭科菌根真菌特異性與否，首次明確了蘭科菌根真菌定植關系可分為三大類：特異性定植、廣泛性定植和特異-廣泛兼性定植。根據營養關系特點，首次將蘭科植物與菌根真菌之間的營養關系劃分為三大類：蘭花單向利好型、典型共生型、分工合作型。蘭科菌根真菌特異性與蘭科植物稀有性之間的關系呈現出兩面性，而蘭科菌根真菌與蘭科植物之間是否存在協同進化關系還需要更多的研究才能闡明。此外，該文還對蘭科菌根真菌領域今后的研究提出了一些思路。

關鍵詞： 蘭科菌根真菌， 宏基因組， 特異性， 營養關系， 協同進化

中圖分類號：?Q933

文獻標識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0487-16

Abstract：?Orchidaceae occupies a very important position in the biological phylogeny and evolutionary system on the earth. Almost all Orchidaceae species are threatened or endangered to certain degrees. It is of great significance to study orchid mycorrhizal fungi （OMF） to protect rare and endangered orchids. In this article， OMF and its related terms were introduced. The methods used for the OMF research were summarized. The main taxa and specificity of OMF， the relationship between OMF specificity and orchids rarity， the nutritional relationship and co-evolutionary relationship between OMF and orchids were reviewed. The OMF research methods mainly include： classical methods， early molecular biological methods， rDNA fragment high-throughput sequencing methods and metagenomic methods. The taxa of OMF mainly belong three fungal phyla： Basidiomycota， Ascomycota and Mucoromycota. According to the degree of OMF specificity， it is the first time that we put forward that the OMF colonization can be divided into three types： specific colonization， extensive colonization and specific extensive facultative colonization. According to the characteristics of the nutritional relationship， we first put forward that the nutritional relationship between orchids and OMF can be divided into three types： orchids unidirectional benefit type， typical symbiotic type and cooperation type. The correlation between OMF specificity and orchids rarity showed two sides. And more researches are still needed to clarify whether there is co-evolutionary relationship between orchids and OMF. Finally， some ideas based on the current researches were proposed for future OMF research.

Key words： Orchid mycorrhizal fungi， metagenomic， specificity， nutritional relationship， co-evolution

蘭科（Orchidaceae）植物，俗稱蘭花（Orchids），是植物界中最大且多樣性最豐富的類群之一，起源古老且仍在經歷著快速的分化和物種形成（Chase，2001;Cribb et al.，2003）。蘭科植物約占開花植物的10%，具有獨特的花形，生活方式多樣化，成功占據了地球上絕大多數的棲息地類型（Roberts & Dixon，2008;Givnish et al.，2016），在地球生命系統演化中占有十分獨特且重要的地位（陳心啟等，2009）。蘭科植物因具有重要的觀賞價值、藥用價值、文化價值，長期以來被過度采挖，導致幾乎所有野生蘭科植物都處于不同程度的瀕危狀態（Valadares，2012）?！稙l危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）將所有野生蘭科植物列入附錄I和附錄Ⅱ，在其所涉及的保護植物中90%以上是蘭科植物。

菌根共生是大多數陸地植物的共同特征，從沙漠到熱帶森林再到耕地，在幾乎所有的生態系統中存在菌根關聯（Brundrett，2009），據統計約有86%的維管植物都與菌根真菌共生（Brundrett & Tedersoo，2018）。蘭科植物是典型的菌根植物，約占全部菌根植物的10%（Brundrett & Tedersoo，2018）。蘭科植物想要完成完整的生活史并在生態系統中成功地存活下來，離不開菌根真菌及其他密切互作的微生物的作用。深入研究蘭科菌根的特點，在不同生境、地域范圍探索蘭科菌根真菌的生態功能，對珍稀瀕危蘭科植物種群的生態恢復具有重要意義（蓋雪鴿等，2014）。蘭科菌根真菌研究長達百余年的歷史，讓我們逐漸認識到蘭科植物與其菌根真菌之間關系的復雜性。隨著分子測序方法和分析手段的發展，越來越多的分子數據被挖掘，數據庫不斷完善，為蘭科植物菌根真菌的研究提供了極大的便利，近年來更是出現了大量高通量測序的研究成果。然而，蘭科植物與菌根真菌之間關系的復雜性缺乏歸納，并且概念較多容易模糊混淆。因此，本文對蘭科菌根真菌的相關概念、研究方法及幾個主要熱點研究方向的進展進行概述，以期為從事蘭科菌根真菌研究的同行提供參考。

1?蘭科菌根真菌相關概念

1885年，Frank首次提出菌根（mycorrhiza）一詞，他認為這種植物與真菌之間的相互關系是雙方營養的需求所致（Frank，1885）。經過一百多年的研究，菌根一詞的定義曾被多名學者修正過（Brundrett，2004）?，F綜合前人研究將菌根真菌及其相關概念進行總結，認識清楚這些概念是研究菌根真菌及其相關領域的基礎和關鍵。

1.1 菌根真菌與非菌根內生真菌

菌根真菌（mycorrhizal fungi），又稱共生真菌（symbiotic fungi），是一類能與高等植物根系或其他與基質接觸的類根器官形成特定共生結構的真菌類群，它們生活在植物根（類根器官）的表面、皮層內或根（類根器官）的表皮細胞周圍，對植物和真菌雙方或其中一方有利好作用（van der Heijden et al.，2015）。這些真菌的主要作用是養分轉移，它們的菌絲在生長過程中可以從根部進入到土壤中以搜尋和獲取限制植物生長的營養，如硝酸鹽和磷酸鹽等，之后這些營養物質被傳遞到它們的寄主植物，有時可以換取菌根真菌自身生長所需的碳水化合物（Smith & Read，2008）。

除菌根真菌外，植物根部或類根器官中還存在數量更為龐大的內生真菌，它們當中不與植物形成共生關系或暫時缺乏證據能與植物形成共生關系，并且不存在致病真菌的典型解剖特征（Addy et al.，2005），這類真菌類群稱為非菌根內生真菌（non-mycorrhizal root-associated fungi，RAF）。

1.2 根內生真菌與根內生微生物

根內生真菌是指在植物生活史的某一時期生活在根系或類根器官當中所有的真菌類群，既包含了菌根真菌、非菌根內生真菌，同時又可能包含了致病真菌。根內生微生物則是包含植物根系或類根器官中內生真菌、細菌、病毒等所有微生物的總和。內生微生物是植物體內潛在的生物化學合成器（Chukalo & Krishna，2018;Sarsaiya et al.，2019）。

1.3 蘭科菌根真菌

蘭科菌根真菌（orchid mycorrhiza fungi，OMF），是指與蘭科植物根系（或類根器官）形成內共生關系或蘭花單向利好關系的真菌類群，屬于內生真菌。蘭科菌根真菌大多數情況下不屬于真正意義上的共生真菌，相當大的程度上蘭科植物是利用和欺騙菌根真菌為其生長提供營養，而菌根真菌不能從其宿主蘭科植物中獲得任何好處（Taylor & Bruns，1997）。蘭科菌根真菌與其他類型的菌根真菌相比具有極大的獨特性，它們的斑塊化非常明顯，很少與地下生態系統中其他類型的菌根真菌重疊（van der Heijden et al.，2015）。

2?蘭科菌根真菌研究方法概述

根據研究方法的發展歷程，可以將蘭科菌根真菌的研究方法歸納為幾大類。

2.1 經典研究方法——分離、培養、鑒定

2.1.1 組織表面消毒分離法?經典的研究方法是隨著蘭科菌根真菌的分類而興起的。最早的菌根真菌分離培養體系在20世紀初由Bernard創建，即組織表面消毒分離法。該方法的操作步驟如下：首先用流水沖洗蘭科植物組織表面，去除表面附屬物、表面微生物;然后用消毒劑進行表面消毒，再用無菌水沖洗去除消毒劑;最后將蘭科植物組織塊切成小段或小片，接種在培養基上，在適當的溫度下培養，可分離獲得菌根真菌（Bernard，1904）。該方法因操作簡便且不需要復雜的儀器設備而被廣泛應用，但無法完全避免組織表面雜菌的污染，不能保證分離出來的真菌全部都是菌根真菌。后人針對該方法的缺點進行了改良，如使用酒精、雙氧水、升汞、硝酸銀等作為消毒劑，現多使用多種消毒劑組合的方法進行消毒，最為常用的是酒精-次氯酸鹽組合消毒法。

2.1.2 單菌絲團分離法?該方法是從組織內將菌絲團挑出來進行培養的方法。最早的成熟的單菌絲團分離體系是由Warcup et al.（1967）建立的。該種方法大大提高了菌根真菌分離的準確度，但同時存在很大的缺點，如菌絲團容易結合到一起而很難分開，培養基冷卻溫度難以控制等。針對這些缺點，朱國勝（2009）對該種方法進行了改良：首先將根段進行表面消毒，刮取細胞內部菌絲團，配制成菌絲團懸液;然后接種于多個分離的瓊脂培養基上。改良后此種方法有效解決了上述缺點。

2.1.3 原生境種子誘捕法?原生境種子誘捕法是指將蘭科植物的種子套袋后播種到其原來生境中進行萌發試驗，待其萌發后從原球莖中定向分離菌根真菌的方法（Rasmussen & Whigham，1993）。該種方法有利于蘭科植物種子萌發階段促生菌的發現。原生境種子誘捕法能夠有效避免人工栽培條件下蘭科植物與其菌根真菌專一性改變的問題，使數據更加真實嚴謹。

2.1.4 非原生境播種誘捕法?該方法由Brundrett et al.（2003）建立。非原生境播種誘捕法，也稱實驗室播種誘捕法，是指將原生境的枯枝落葉、土壤等基質取回實驗室，在實驗室內進行種子播種誘捕，以獲得原生境中促進蘭科植物種子萌發的促生菌（Brundrett et al.，2003）。該方法的優點是突破了種子共生萌發研究的時空限制，對蘭科植物的異地栽培有非常好的指導作用。

經典的研究方法常用于菌根真菌的分類鑒定、共生驗證等研究。經過分離培養后得到的菌根真菌，可以使用誘導產孢法和菌絲融合群分類法，結合菌落形態特征、菌絲顯微結構、菌絲細胞核數目、菌絲隔膜超微結構等進行分類鑒定。然而，經典的研究方法往往很難將菌根真菌鑒定到種，同時也容易出現鑒定不準確的現象，并且可能存在大量菌根真菌不能被分離培養的現象?，F經典分類方法多用于前期處理，與分子技術相結合進行蘭科植物菌根真菌的鑒定、多樣性、特異性、營養交流、時空格局、代謝產物等研究。

2.2 早期分子生物學方法

20世紀50年代，分子生物學的興起為菌根真菌的研究帶來了春天，多種分子標記開始應用到菌根真菌的研究領域，早期的分子生物學技術主要有限制性片段長度多態性技術（RFLP）、末端限制性片段長度多態性技術（T-RFLP）、DNA微陣列（芯片）技術（Microarray）、隨機擴增多態性DNA技術（RAPD）、擴增限制性片段長度多態性技術（AFLP）、變性/溫度梯度凝膠電泳技術（DGGE/TGGE）、實時熒光定量PCR技術（Real-time PCR）、磷脂脂肪酸圖譜分析技術（PLFAs）、熒光原位雜交技術（FISH），以及早期的rDNA測序技術等。

上述分子技術方法常以組合的形式結合經典研究方法應用到蘭科菌根真菌多樣性、特異性、時空變化、互作網絡、系統發育等諸多方面的研究中。如Bougoure et al.（2005）通過ITS-PCR、RFLP分析和原球莖定殖試驗的方法對澳大利亞東南昆士蘭地區蘭科Acianthus、Caladenia和Pterostylis植物內生真菌的多樣性及菌根真菌的特異性進行了研究。Taylor et al.（2003）利用顯微觀察，結合RFLP分析、ITS和LSU核糖體基因片段的測序方法對沙漠分布的非光合蘭花Hexalectris spicata與其菌根真菌進行了研究，利用RFLP型對他們之間的進化關系進行了探討。Pereira et al.（2005）將RAPD和形態學分析相結合的方法應用到大西洋雨林蘭科植物保護計劃中，探討了7種新熱帶蘭花的菌根真菌及其特異性。

2.3 rDNA片段高通量測序技術

rDNA片段高通量測序技術，又稱擴增子高通量測序。從興起至今已經歷了幾代測序平臺，如454測序平臺、Miseq測序平臺、Hiseq測序平臺等，隨著測序策略的發展，讀長不斷增長，使得基于高通量測序平臺的測序研究物種多樣性的準確性大幅度提高（Luo et al.，2012）。利用高通量測序平臺進行測序，具有費用低、測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種的優點，已成為研究真菌群落多樣性的首選之策（Degnan & Ochman，2011）。常用于此項技術的rDNA片段，對于真菌來說，有位于核糖體18S與5.8S之間的ITS1和位于5.8S與28S之間的ITS2，它們都屬于中度保守區域，適用于種及種以下分類單元的研究（Waud et al.，2014）;對于細菌來說，適宜的擴增片段有16S的V4、V3-V4、V4-V5區等（Yu et al.，2013）。

近年來，應用擴增子測序的方法研究蘭科菌根真菌或內生真菌的研究陸續出現。如Jacquemyn et al.（2014）使用454焦磷酸測序法，對地中海草原兩個25 m × 25 m的樣方中小尺度空間同域分布的7種蘭科植物的菌根真菌特征進行了研究。Perotto et al.（2014）利用454焦磷酸測序法對分布于地中海綠色草甸上的蘭花Serapias vomeracea和其菌根真菌Tulasnella calospora之間的體外共生系統進行了研究。Jacquemyn et al.（2016）使用454焦磷酸測序法研究了14種掌裂蘭屬（Dactylorhiza）蘭科植物中菌根真菌組合的生態和地理變異。Cevallos et al.（2017）利用Illumina Miseq平臺對ITS2區進行了高通量測序，研究了厄瓜多爾南部山區雨林中三種同域附生熱帶蘭科植物（Cyrtochilum flexuosum、C. myanthum和Maxillaria calantha）菌根真菌群落的特征，結果發現了菌根真菌群落建群種（keystone mycorrhizal fungi）的存在。Cevallos et al.（2018）利用同樣的技術方法對上述三種蘭科植物的內生真菌群落組成的驅動因素進行了研究。

2.4 宏基因組學方法

宏基因組學（metagenomics）這一概念最早是1998年由威斯康辛大學植物病理學家Jo Handelsman提出的。Handelsman對宏基因組學的定義是一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法（Handelsman et al.，1998）。環境中大多數微生物物種及其生物量是未知的，并且多達99%的微生物不可培養，無法通過培養法進行研究（Pandey et al.，2013）。宏基因組學則規避了對微生物進行分離培養，提供了一種對不可分離培養的微生物進行研究的途徑，能更真實地反映樣本中微生物的組成、互作情況，同時可在分子水平上對其代謝通路、基因功能進行研究（Tringe et al.，2005）。

宏基因組學技術經過近幾十年的發展，在發掘未培養微生物資源、開發微生物活性物質、研究微生物群落結構和功能、篩選新基因等方面顯示了巨大的應用潛力和優越性。隨著測序技術和信息技術的快速發展，利用新一代測序技術（Next Generation Sequencing）能快速準確地得到大量微生物數據和豐富的微生物信息，從而成為研究微生物的重要手段（Tringe & Rubin，2005）。如致力于研究微生物與人類疾病健康關系的人體微生物組計劃（Human Microbiome Project，HMP），研究全球微生物組成和分布的全球微生物組計劃（Earth Microbiome Project，EMP）都主要利用宏基因組高通量測序技術進行研究。宏基因組學已成為目前國際上微生物研究的前沿和熱點領域，但這項技術用于蘭科植物菌根真菌的研究還未見報道。

3?蘭科菌根真菌主要研究方向的進展情況

據記載，早在1886年以前，第一次對溫帶和熱帶地區的蘭花進行大規模調查時就發現了真菌侵染蘭花成株的普遍現象（Smith & Read，2008）。然而，直到19世紀末20世紀初，Bernard和Burgeff才揭開蘭科菌根真菌的秘密：他們首次將菌絲團描述為蘭科菌根的獨特結構，并對這些菌絲進行早期最系統的分離，分類研究發現分離的真菌隸屬于擔子菌門（Basidiomycete）的絲核菌屬（Rhizoctonia）;他們還通過共生和非共生萌發試驗，對菌根真菌在蘭花幼苗發育中潛在的作用提供了最早的見解（Smith & Read，2008）。之后，涌現了大量關于蘭科菌根真菌的研究成果，這些研究成果逐漸讓我們認識到菌根真菌與蘭科植物之間關系的重要性及復雜性。

3.1 與蘭科植物形成菌根的主要真菌類群

1992年，Currah & Zelmer首次列出了蘭科菌根最基本的檢索表，記載了蘭科菌根真菌15屬29種和2個腐生類群，為蘭科菌根的分類研究提供了可靠依據（Currah & Zelmer，1992）。經過近幾十年的研究發現，蘭科菌根真菌主要隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）及毛霉門（Mucoromycota）（Herrera et al.，2010;Illyes et al.，2010;Ercole et al.，2015），其中擔子菌門是最為常見也是最早被發現的蘭科菌根真菌門。

常見的蘭科菌根真菌科有膠膜菌科（Tulasnellaceae）、角擔菌科（Ceratobasidiaceae）、蠟殼耳科（Sebacinaceae）、革菌科（Thelephoraceae）、紅菇科（Russulaceae）等（Zelmer，1995;Taylor & Bruns，1997;Pandey et al.，2013;Cevallos et al.，2017），它們均隸屬于擔子菌門。常見的蘭科菌根真菌屬有瘤菌根菌屬（Epulorhiza）、角菌根菌屬（Ceratorhiza）、角擔菌屬（Ceratobasidium）、Sistotrema、膠膜菌屬（Tulasnella）、紅菇屬（Russula）、小菇屬（Mycena）、Tricharina、盤菌屬（Peziza）和Flavodon等（Warcup & Talbot，1967;郭順星和范黎，1999;Taylor & Mccormick，2008;Girlanda et al.，2010;Waterman，2011;Khamchatra et al.，2016），其中膠膜菌屬是與蘭科植物形成菌根最主要和最廣泛的屬（Pereira et al.，2005）。本文整理了部分已發表的常見蘭科菌根真菌3門51科69屬，詳見附表1。

3.2 蘭科菌根真菌特異性

蘭科菌根真菌的特異性一直是研究的熱點。

總結前人研究，蘭科植物與其菌根真菌之間的定植關系，根據其特異性與否可以分為三大類，即特異性定植、廣泛性定植和特異-廣泛兼性定植。

在特異性定植關系中，蘭科植物僅與特定類群的菌根真菌發生定植關系，這種定植關系不隨地理分布區域的變化而變化。根據蘭科植物的營養類型，特異性定植又可分為兩大類：腐生類蘭科植物菌根真菌特異性定植和光合類蘭科植物菌根真菌特異性定植。前人研究發現不營光合作用（真菌異養）的腐生蘭科植物更容易形成高度特異性的菌根真菌定植關系。如Taylor & Bruns（1997）對兩種不營光合作用的蘭科植物頭蕊蘭屬（Cephalanthera）的C. austinae和珊瑚蘭屬（Corallorhiza）的C. maculata進行研究發現，這兩種蘭科植物其菌根真菌具有高度特異性：Cephalanthera austinae只與革菌科的一類真菌形成菌根，而Corallorhiza maculata只與紅菇科的一類真菌形成菌根。Barrett et al.（2010）對北美珊瑚蘭屬的Corallorhiza striata的42個種群107個個體進行研究，結果也發現了高度特異的菌根真菌定植關系：C. striata只與革菌科革菌屬（Tomentella）的真菌形成菌根。有些營光合作用的蘭科植物也具有特異性的菌根真菌關系（Pandey et al.，2013）。Shefferson et al.（2007）對三大洲15種90個居群的杓蘭屬（Cypripedium）植物進行了研究，結果發現15種杓蘭屬植物在屬水平上具有高度特異的菌根真菌定植關系，它們幾乎全部與膠膜菌科（Tulasnellaceae）的一類真菌形成菌根。Ding et al.（2014）對我國東北地區7個居群的羊耳蒜（Liparis japonica）進行研究發現，所鑒定的86株真菌其序列和系統發育分析表明，這些真菌均屬于同一主枝，與膠膜菌屬親緣關系最近，結果表明至少在中國東北地區，無論生境如何，羊耳蒜都具有較高的菌根真菌特異性。

廣泛性定植是指蘭科植物與多種菌根真菌類群形成定植關系，在不同的地理分布區域中趨向于與不同的菌根真菌形成定植關系。相對于真菌異養蘭科植物，大多數營光合作用的蘭科植物與菌根真菌的關系特異性較低。Pecoraro et al.（2017）對營光合作用的頭蕊蘭屬的大花頭蕊蘭（Cephalanthera damasonium）和頭蕊蘭（C. longifolia）進行研究，發現11種屬于擔子菌門和子囊菌門的真菌類群，研究結果有力地表明大花頭蕊蘭和頭蕊蘭的菌根關系都是多樣性的。對蘭科植物與菌根真菌是否為特異性定植關系的判定，理想的情況應是對多個不同地理種群的蘭科植物的菌根真菌進行研究（Herrera et al.，2019）。Herrera et al.（2019）對厄瓜多爾兩種同域分布的蘭科植物Epidendrum marsupiale和Cyrtochilum pardinum進行研究，他們在兩個不同的地點各取兩個不同海拔梯度進行采樣，研究發現這兩個物種在物種間、不同的地點及不同海拔梯度的居群間都共享大量不同的菌根真菌，表現出廣泛的菌根真菌定植關系。Qin et al.（2019）對獨蒜蘭屬（Pleione） 15個種的菌根真菌的研究也發現多樣性的真菌定植關系，獨蒜蘭屬的菌根真菌有膠膜菌科、角擔菌科、Serendipitaceae、Atractiellales和木耳菌目（Auriculariales），并且不同的種間能共享一定的菌根真菌。

特異-廣泛兼性定植是指蘭科植物在不同生活史階段菌根真菌特異性程度有所差異。一些蘭科植物在種子萌發階段具有廣泛的菌根真菌定植關系，而在成株階段菌根真菌的定植具有高度特異性;另一些蘭科植物則剛好相反，它們在種子萌發期具有高度特異性的菌根真菌定植關系，而在成株階段則具有廣泛的菌根真菌定植關系（Mccormick & Whigham，2004）。

3.3 蘭科植物的稀有性（或瀕危性）與其菌根真菌特異性之間的關系

鑒于蘭科植物在不同的生活期對菌根真菌都有或多或少的依賴，闡明蘭科植物與菌根真菌的互作模式對蘭科植物的生物學、生態學和保護生物學至關重要。然而，菌根真菌特異性是否是導致蘭科植物稀有或瀕危的原因不能一概而論。

有些研究發現，蘭科植物的稀有性或瀕危性與其菌根真菌特異性之間不存在直接關系。一方面，菌根真菌的特異性可能并不是造成蘭科植物稀有或瀕危的原因。Phillips et al.（2011）利用原位種子誘捕和ITS測序相結合的方法對三種常見且分布廣泛、兩種珍稀窄域的Drakaea蘭科植物的菌根真菌進行了研究，研究發現不管是分布廣泛還是珍稀窄域的Drakaea蘭科植物，它們的菌根真菌都是膠膜菌屬的一個特定類群，并且它們在原位種子誘捕試驗中的發芽率無明顯差異，這些結果表明菌根特異性與Drakaea的稀有性無直接關系。另一方面，很多稀有的蘭科植物也有多樣的菌根真菌定植關系。Pandey et al.（2013）對加利福尼亞特有瀕危且極為窄域分布的蘭科植物Piperia yadonii進行了研究，對兩種不同生境8個居群的個體的菌根真菌內轉錄間隔區進行了擴增和測序，結果發現P. yadonii在不同的生境可以利用不同的菌根真菌，即P. yadonii不存在菌根真菌特異性。這表明P. yadonii的瀕危性與其菌根真菌特異性無關。

也有一些研究指出，蘭科植物的稀有性是其僅與較少種類的真菌形成菌根所導致的。Shefferson et al.（2005）對杓蘭屬菌根真菌進行研究發現，絕大多數杓蘭屬植物的菌根真菌屬于膠膜菌科的一個特定類群，只有極為少數的杓蘭屬植物內生真菌包含了蠟殼耳科、角擔菌科及子囊菌門的瓶霉屬（Phialophora）等多個真菌類群，結果表明杓蘭屬植物的分布可能受到菌根特異性的限制。Swarts et al.（2010）發表了一項與Phillips et al.（2011）對Drakaea研究實驗設計相類似的另一個蘭科Caladenia的研究成果，他們以地生的珍稀瀕危蘭科植物C. huegelii為研究對象，同時以4種同屬廣泛且同域分布的蘭科植物C. arenicola、C. discoidea、C. longicauda、C. flava作為對照，進行了室內、原地共生萌發試驗及DNA分子測序實驗，但他們得出了與Phillips et al.（2011）相反的研究結論。瀕危蘭科植物C. huegelii的菌根真菌有高度的特異性，除專有的菌根真菌外不能與其他真菌建立菌根關系，而其同域常見的同屬蘭科植物則可以利用并相互共享多種菌根真菌（包括C. huegelii的菌根真菌），即菌根真菌的專一性與C. huegelii的稀有性有明顯的相關關系。

3.4 蘭科植物與其菌根真菌之間的營養關系

有些蘭科植物在整個生活史中都依賴其菌根真菌提供養分，這類蘭科植物屬于完全真菌異養植物（fully mycoheterotropic plants）。越來越多的光合蘭科植物被發現在利用自身光合作用產生養分的同時也從菌根真菌中吸收營養物質，這類蘭花被稱為兼性營養植物（mixotrophic plants）。Yoder et al.（2000）研究發現菌根真菌能為蘭科植物提供C、N、P和維生素等多種營養物質，提供赤霉素等植物激素，同時也可能是幼苗期蘭科植物水分的主要來源。長期以來，蘭科植物與其菌根真菌之間的營養關系是研究的熱點之一，其相互關系呈現出高度的復雜性，綜合前人研究，本文提出了三種蘭花-真菌營養關系類型。

3.4.1 蘭花單向利好型營養關系?在蘭花單向利好型營養關系當中，學者認為菌根同其他古老的相互關系（如蘭科植物與其傳粉者之間的關系）一樣，真菌容易受到蘭花的欺騙（Taylor & Bruns，1997），即蘭花利用真菌為其提供生長發育所需要的營養物質，而真菌卻不能從這個過程中得到任何好處。這類關系通常發生在非光合作用的蘭科植物中及光合蘭科植物的早期生活史中（Dearnaley & Cameron，2017）。正如Taylor et al.（1997）在對兩種非光合作用的蘭科植物Cephalanthera austinae和Corallorhiza maculata的研究中所報道的“所有的生理證據都表明蘭科植物與它們的菌根真菌不是共生關系”。

3.4.2 典型的共生型營養關系?在典型的共生營養關系中，營養流動是雙向的，菌根真菌為其宿主蘭科植物提供生長所需的無機物、有機物及水分等，而蘭科植物可以向其菌根真菌輸送光合作用的產物，甚至在非光合作用階段也可以向其菌根真菌輸送NH+4等營養物質（Dearnaley & Cameron，2017）。

Cameron et al.（2006）對小斑葉蘭（Goodyera repens）與其菌根真菌進行了放射性碳氮同位素追蹤，在發現菌根真菌持續向成年小斑葉蘭輸送碳素的同時，也清楚地檢測到了14CO2由成年宿主植物轉向菌根真菌。Fochi et al.（2017）對菌根真菌Tulasnella calospora及其宿主蘭花Serapias vomeracea的氮轉移及吸收基因的表達量進行了研究，在T. calospora的基因組中發現了兩個功能性氨轉運體和幾個氨基酸轉運體，但沒有發現硝酸鹽攝取和吸收的基因，表明T. calospora不能利用硝酸鹽。參與氮類化合物轉運和吸收的基因在共生系統中的差異表達發現，植物銨轉運體SvAMT1及真菌氨轉運體TcAMT2在共生系統中都顯著上調，這表明在非光合作用階段，S. vomeracea向T. calospora輸送NH4+。這項研究首次發現了營養物質在非光合階段從蘭科植物流向其真菌伴侶，刷新了對蘭科植物與菌根真菌之間營養關系的認識。因此，蘭科植物與其菌根真菌在植物發育的早期和成熟階段都可能表現出真正的互利共生。這種真正的互利共生關系充分驗證了一句古老的生態格言：在自然界中“沒有免費的午餐”（Dearnaley & Cameron，2017）。

3.4.3 分工合作型營養關系?在這種類型的營養關系中，蘭科植物首先與其菌根真菌各自合成所需營養物質的一部分，然后組合到一起生成所需要的營養物質。Hijner & Arditti（1973）對蘭屬（Cymbidium）的研究案例發現了這一現象。從蘭屬中分離的絲核菌可以產生煙酸和維生素B1的嘧啶，而蘭屬植物可以合成葉酸的前體——對氨基苯甲酸，研究表明蘭屬植物可以與其菌根真菌合作完成維生素的合成以滿足它們彼此生長發育的需求。

截止目前的研究表明，蘭科植物與其菌根真菌之間的營養關系往往是復雜的，以上三種類型的營養關系可能出現在同一種蘭科植物生活史的不同階段中，如同是對小斑葉蘭與其菌根真菌之間14CO2轉移的研究，Hadley & Purves（1974）未檢測到任何碳素向菌根真菌轉移的跡象，原因可能是限于當時的實驗條件而沒有被發現，也極有可能是不同的生長時期有不同的營養關系所致。另外，蘭科菌根真菌還可能與生境中的其他植物形成外生菌根，從而形成蘭花-菌根真菌-其他植物三者循環的營養流動關系（Martos et al.，2009）。

3.5 蘭科植物與其菌根真菌之間的協同進化關系

協同進化涉及兩組不同生物體之間親密的相互作用，被認為是物種形成的一個關鍵驅動力，特別是當這種親密的相互作用顯示出高度的特異性時，如宿主-寄生關系及專一性的傳粉關系等（Barrett，1986）。蘭科植物與其菌根真菌之間的進化關系目前還處于爭議的狀態。

有些學者認為，蘭科植物與其菌根真菌之間不存在協同進化關系。雖然菌根相互作用確實影響了植物養分吸收策略的進化，但大多數植物并不與窄域的真菌類群發生特異性的相互作用（Molina et al.，1992），使得植物和真菌物種之間不太可能成對共同進化，即便是特異性的蘭科植物-菌根真菌關系也不太可能導致共成種的分化。Roche et al.（2010）對同域發生的地生光合蘭科Chiloglottis的6種植物進行了研究，它們有專性和高度特異的欺騙性傳粉策略和菌根真菌定植關系，研究對比了專性的傳粉策略與菌根關系對Chiloglottis的進化影響，結果表明專性的傳粉關系而非專性的菌根關系，是導致該屬植物多樣化的主要原因，此項研究同時表明即便是具有高度專一性的菌根真菌定植關系的蘭花，也可能不存在蘭花-真菌協同進化。Xing et al.（2019）對西雙版納國家自然保護區勐侖片區的25屬44種熱帶蘭科植物與其菌根真菌的關系進行了研究，結果表明決定熱帶蘭科植物與其菌根真菌網絡結構建成的是生態約束而非宿主蘭科植物系統發育關系，研究不支持蘭科植物與其菌根真菌之間存在協同進化關系。

另有一些研究則認為，蘭花與真菌之間高度特異的關系可能促進蘭花的多樣化，對于蘭科植物與菌根真菌的相互作用來說，在某些顯示出高度特異性的情況下，可能在某些蘭科植物類群的形成中發揮了關鍵作用（Taylor et al.，2003）。從這類支持進化相關性的研究中可以總結出兩種菌根真菌促進蘭科植物物種形成的機制假說：一是菌根真菌驅動的生態地理隔離說（ecogeographic isolation）。這種假說認為居住在不同棲息地的種群與不同的菌根真菌群落發生相互作用，而菌根真菌又可能促進適應性分化，最終形成可繁殖的孤立物種。菌根真菌群落的差異可能會導致最近分化的姊妹物種之間的生殖隔離，因為它們在一定程度上可影響這兩個物種的空間分布，從而導致通過花粉或種子的基因流動在不同的地理分布區域之間受到限制（Jacquemyn et al.，2016）。二是菌根真菌介導的物種移植不可成活說（immigrant inviability）。這種假說認為菌根真菌群落在不同物種棲息地間存在差異，使得一個物種無法在另一個物種的棲息地上存活，反之亦然（Nosil et al.，2005）。有大量的研究案例支持進化相關的觀點。Taylor et al.（2003）對非光合作用沙漠蘭花Hexalectris spicata的三個復合體的研究表明，蘭科植物與菌根真菌之間的相互作用促進了蘭科植物的進化多樣化。Taylor & Bruns（1999）研究了珊瑚蘭屬的兩個姊妹種Corallorhiza maculata和C. mertensiana的種群、生境及遺傳背景對菌根真菌的影響，結果發現即便是在同一地區，這兩個姊妹種也從不共享菌根真菌，表現出極強的遺傳控制性。Jacquemyn et al.（2011）對紅門蘭屬（Orchis）的16種蘭科植物及其菌根真菌的研究發現，紅門蘭屬和膠膜菌科真菌之間的相互作用受到紅門蘭屬物種間系統發育關系的顯著影響，表明蘭科植物進化過程可能是菌根結合模式的重要影響因素。Martos et al.（2012）對留尼旺島的自然棲息地中73種蘭科植物和95種菌根真菌OTUs進行了二維系統發育網絡分析，研究發現了高度模塊化的菌根關系架構，推測附生蘭花與菌根真菌之間可能存在協同進化，結果表明菌根真菌是影響菌根共生系統生態組合和進化約束的重要因素。

綜上所述，蘭科植物與菌根真菌之間是否存在協同進化關系還懸而未決。前人的研究多針對親緣關系密切的姊妹種或復合種與其菌根真菌進行進化驗證。一方面，蘭科作為一個高度進化的植物類群擁有豐富的物種多樣性，物種選擇的尺度過小可能不能充分闡明進化問題。另一方面，限于研究方法，已經發現的菌根真菌類群是否能夠代表全部與蘭科植物可能產生進化關系的真菌類群還是未解之謎。因此，還需要進一步的研究才能真正揭開蘭科植物與菌根真菌或內生真菌之間的進化關系。

4?結論與展望

本文通過綜合整理近年來國內外蘭科菌根真菌的研究進展，提出了一些新的見解?？v觀蘭科菌根真菌的研究歷史，蘭科菌根真菌的研究可歸納為三個階段，即經典研究階段、早期分子生物學階段和分子生物學高通量測序階段。根據蘭科菌根真菌特異性與否，蘭科菌根真菌定植關系可分為特異性定植、廣泛性定植和特異-廣泛兼性定植?；谇叭搜芯?，對蘭科植物與菌根真菌之間的營養關系也進行了總結，將其劃分為三大類，即蘭花單向利好型、典型共生型和分工合作型。同時，對蘭科菌根真菌特異性與蘭科植物稀有性之間的關系及蘭科菌根真菌與蘭科植物之間的進化關系也進行了論述。蘭科植物與其菌根真菌之間的關系是極為復雜的，雖然已有相關研究，但只是部分地揭示了其中的奧秘。本文提出的論點是否完整、正確還有待于進一步研究加以驗證、補充。隨著宏基因組學、宏蛋白組學、宏轉錄組學及代謝組學的發展，多組學相結合的研究方法將使得蘭科植物與其菌根真菌之間的各種關系及機理機制進一步地被挖掘和認知。

除了已報道的蘭科菌根真菌類群外，蘭科植物還擁有數量更加龐大的非菌根內生真菌。非菌根內生真菌有促進蘭科植物吸收根際土壤養分（Newsham，2011;Zhao et al.，2014）、影響次級代謝物的產量和變化（Zhang et al.，2013）、保護宿主免受土壤病原體侵害（Ma et al.，2015）等作用。在未來的研究中，如何區分菌根真菌與非菌根真菌，菌根真菌與非菌根真菌之間的關系和互作模式，以及它們與宿主蘭科植物之間的作用機制值得思考。蘭科植物菌根中還存在大量的益生細菌，這些內生細菌對蘭科植物也有積極的作用，如促進種子萌發和植株生長（Wilkinson et al.，1989，1994）、增強植物抗逆性（Cheng et al.，2008）、促進光合作用（Tsavkelova et al.，2003）、內生固氮（Hurek et al.，2002）、分泌植物生長所需的調節物質如吲哚乙酸（Tsavkelova et al.，2005）等。然而，相對于蘭科菌根真菌來說，菌根細菌的研究還遠遠不夠，蘭科植物菌根細菌與菌根真菌之間的關系也有待于未來進一步深入研究。各類微生物群落在蘭科植物根際、根內形成復雜的網絡關系，蘭科根際微生物-蘭科根內微生物-蘭科植物之間的相互關系及作用機制還有很多科學問題需要被打開和解決。

當前，我們對微生物的研究非常有限，按比例估計，仍有數萬億的微生物物種尚未被發現，同時微生物基因功能數據庫也相當不完善。這使得研究學者在探索蘭科內生微生物、根際微生物、土壤（或基質）微生物群落的物種構成、基因功能、代謝特征等方面的研究面臨巨大的挑戰。通過多組學方法整合分析多種高通量測序數據來發現未知基因、微生物物種、代謝產物等，將會提高數據庫和方法論的完整性，有助于研究的推進。然而，僅依賴多組學手段并不能完全解決問題，由于大量微生物本身仍然是未知的，因此未來傳統經典領域的研究也不能被忽略。

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（責任編輯?蔣巧媛）