栽培大豆GRAS轉錄因子家族基因鑒定及其鹽脅迫下表達模式分析

張斌 陳麗娟 李其華 唐滿生

摘要：?利用生物信息學手段及轉錄組測序方法對大豆78個GRAS家族基因進行系統分析。染色體定位結果表明78個GRAS基因不均勻地分布在20條染色體上。通過系統進化分析將大豆GRAS家族分為11個亞族?；蚪Y構和保守基序分布分析結果表明GRAS家族成員在進化上具有保守性，尤其是進化關系較近的成員多具有類似的基因結構和蛋白質結構。轉錄組數據及qRT-PCR結果顯示，5個基因受鹽脅迫誘導上調，5個基因受鹽脅迫誘導下調，其中GmGRAS14、GmGRAS33和GmGRAS69在鹽處理12 h時上調倍數最高，而GmGRAS17、GmGRAS54和GmGRAS57在鹽處理12 h時表達量下調倍數最高，說明這些基因可能在大豆響應鹽脅迫方面發揮重要功能。

關鍵詞：?大豆;GRAS家族;鹽脅迫;表達模式

中圖分類號：?S565.101??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0296-14

Abstract：?In this study， 78 genes of GRAS family in soybean were systematically investigated using bioinformatics and RNA-seq. The chromosomal distribution map showed that 78 GRAS genes were randomly located in 20 chromosomes. Phylogenetic analysis showed that the soybean GRAS family could be divided into 11 subfamilies. The gene structure and conserved motif distribution analysis suggested that the GRAS family members were consertive in evolution， and most of the GRAS members with close evolutionary relationship had similar gene and protein structures. Transcriptomal and qRT-PCR results showed that five genes were up-regulated and five genes were down-regulated under salt stress. Among them， GmGRAS14， GmGRAS33 and GmGRAS69 had the highest fold of up-regulation at 12 h of salt treatment. GmGRAS17， GmGRAS54 and GmGRAS57 showed the highest down-regulation multiple at 12 h of salt treatment， suggesting that these genes may play an important role in the response to salt stress of soybean.

Key words：?soybean;GRAS family;salt stress;expression pattern

轉錄因子通過結合到啟動子區發揮激活或抑制作用調控特定基因的表達，在植物生長發育以及生物或非生物脅迫響應過程中發揮著重要作用。目前很多轉錄因子家族基因的功能已被報道，如WRKY、MYB、MADS、bZIP、AP2/ERF、GRAS等[1]，其中GRAS是植物特有的轉錄因子家族。GRAS家族基因的命名是根據最早鑒定出的該家族3個成員的基因名而來，包括GAI、RGA和SCR[2-4]。通常GRAS家族蛋白長度為400～700 aa，并且具有序列非常保守的C端和序列可變的N端[5]。根據系統進化樹可將GRAS家族分成多個亞家族，但是不同物種中亞家族的數量也存在差異。如GRAS家族最早在擬南芥中被分成8個亞族：LISCL、PAT1、SCL3、DELLA、SCR、SHR、LAS和HAM[6];在蓖麻中被分成13個亞族：SCR、DLT、OS19、LAS、SCL4/7、OS4、OS43、DELLA、PAT1、SHR、HAM、SCL3和LISCL[7];在棉花和木薯中均可分為14個亞族[8-9]。目前，有多種植物GRAS轉錄因子家族基因的全基因組已被鑒定，如擬南芥與水稻[10]、煙草[11]、玉米[12]、白楊[13]、甘薯[14]、棉花[8]等。

GRAS轉錄因子在植物生長發育過程中發揮著多種功能，參與信號轉導、調控組織發育、生物或非生物脅迫應答等過程[15]。擬南芥SCL3蛋白屬于SCL3亞族，其在根的內胚層可通過減弱DELLA抑制效應以維持赤霉素（GA）途徑正常功能，并在擬南芥生長過程中參與調控根細胞的伸長[16]。水稻SCR亞族基因OsGRAS32基因在赤霉素代謝過程發揮重要調控作用[17]。過表達丹參SmGRAS3基因導致水楊酸和赤霉素的合成以及丹參毛狀根的生長均受到抑制[18]。此外，大量研究結果表明GRAS轉錄因子參與植物對生物和非生物脅迫的響應過程。通過RNAi技術將水稻GRAS基因OsCIGR2沉默后接種稻瘟病菌，發現細胞死亡數目較野生型材料顯著增加[19]。在擬南芥中過表達甘藍型油菜LAS亞族基因BnLAS，則可通過降低過表達材料葉片失水率、減小氣孔開度、合成較多的葉表皮蠟質增強轉基因材料耐旱性[20]。胡楊SCL4/7亞族基因PeSCL7的表達受干旱和鹽脅迫誘導上調，過表達PeSCL7基因可提高轉基因擬南芥耐旱和耐鹽能力[21]。在鹽和甘露醇處理條件下，番茄GRAS家族基因SlGARS7的表達水平顯著上調，SlGARS7基因過表達材料相較于野生型材料更加耐旱、耐鹽[22]。通過對甘薯、棉花GRAS家族的全基因組學鑒定，也發現大量基因在鹽、干旱、熱、冷脅迫條件下被誘導表達上調[8，14]。

在很多植物中已對GRAS家族進行了全基因組學鑒定，并且對一些基因功能進行了深入研究。大豆中也有少數GRAS家族基因的功能被報道，例如GmSCL6和GmNSP2（即本研究中的GmGRAS1和GmGRAS12）的表達被miRNA（gma-miR171o和gma-miR171q）調控，進而影響大豆結瘤相關基因NIN、ENOD40和結瘤所需乙烯響應因子基因ERN的表達水平[23]。但是關于大豆GRAS家族的全基因組學分析及在非生物脅迫下的功能研究尚未見報道。本研究中，我們從大豆基因組數據庫中鑒定GRAS家族成員，并對其理化性質、染色體定位、系統進化關系、基因結構、蛋白質氨基酸序列保守基序以及在不同組織中的表達模式和鹽脅迫下的表達模式進行分析，為進一步研究GRAS家族基因在環境適應方面的功能提供理論基礎。

1?材料與方法

1.1?大豆GRAS家族基因的獲取和GRAS蛋白理化性質預測

在栽培大豆數據庫（http：//soykb.org/）檢索GRAS轉錄因子家族成員，并下載檢索到的所有基因編碼的蛋白質氨基酸序列。將蛋白質氨基酸序列在數據庫SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）中檢測是否含有GRAS結構域（PF03514），去除不含有此保守結構域的成員后即為最終鑒定出的大豆GRAS轉錄因子家族成員。根據候選基因在染色體上的位置依次命名。利用在線數據庫ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）對GRAS家族成員蛋白質的氨基酸序列長度、相對分子質量、等電點、不穩定系數等理化性質進行預測。

1.2?染色體定位、基因結構和蛋白質保守基序分析

栽培大豆所有染色體的總長度信息下載自NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Glycine+max），大豆GRAS家族成員基因在染色體上的位置信息從Phytozome數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）下載整理，利用Map Chart 2.2軟件繪制大豆GRAS家族成員基因在染色體上的定位圖[24]。根據初步鑒定出的大豆GRAS家族成員的基因ID，在大豆數據庫中逐一下載對應的基因堿基序列和CDS序列，利用在線工具GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結構圖[25]。利用在線數據庫MEME（http：//meme-suite.org/）分析GRAS家族成員蛋白質氨基酸序列上的保守基序[26]，參數為：保守基序最小長度為6，最大長度為50，數量設置為10。

1.3?系統進化樹的構建

在擬南芥TAIR數據庫（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥GRAS家族成員的氨基酸序列（33個），在水稻數據庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）下載水稻GRAS家族成員的氨基酸序列（50個）。將大豆、擬南芥和水稻GRAS家族成員的氨基酸序列在軟件Clustal X中進行多重比對，在MAGA 7.0軟件中利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）繪制系統進化樹，參數設置：Bootstrap method 1 000，Poisson model，Pairwise deletion[8]。

1.4?GRAS家族基因在不同組織中的表達模式分析

栽培大豆GRAS家族基因在不同組織的表達數據從Phytozome數據庫下載整理，即轉錄組測序數據中的FPKM值。包括基因在根、根毛、莖、頂端分生組織、葉、花、豆莢、種子、根瘤共9個部位的表達數據，所有的FPKM值經公式ln（X+1）計算后得到的數值用于表示基因的相對表達水平，并利用軟件Hem1.0繪制基因表達熱圖[8]。

1.5?大豆幼苗的培養和鹽處理后的轉錄組測序

試驗所用的栽培大豆（Glycine max）品種為天隆1號。將充分吸水的大豆種子播種于濕潤的營養土中（丹麥品氏泥炭土），置于生長室生長，生長室條件：恒溫25 ℃，濕度為50%～60%，光照為中日照（12 h晝/12 h夜）。大豆生長約10 d后，第1張三出復葉完全長出，將大豆分為2組，一組澆灌普通自來水（對照組），另一組澆等量的200 mmol/L NaCl水溶液，6 h后分別取對照組和處理組大豆幼苗的地上部分（含莖和葉）于10 ml離心管中（均有3組生物重復），并迅速置于液氮中。樣品交予上海歐易生物公司進行轉錄組學測序（RNA-seq）。從轉錄組數據中先初步篩選出GO注釋為GRAS家族的基因，并進一步找出前期通過生物信息手段鑒定的大豆GRAS家族基因在正常生長和鹽處理6 h后的基因表達FPKM值，繪制基因表達熱圖以分析鹽脅迫條件下GRAS家族所有基因的表達模式。

1.6?RNA提取和熒光定量PCR檢測

為了驗證轉錄組數據中GRAS家族基因表達模式的準確性，重新培養一批大豆幼苗并進行NaCl處理（幼苗生長條件、生長時間、處理方式和方法同方法1.5）。使用TRIzol法提取大豆幼苗總RNA，使用反轉錄試劑盒SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix（Thermo）合成cDNA。以合成的cDNA為模板進行qRT-PCR分析，試驗操作參照文獻[27]。PCR反應總體系為20.0 μl：10.0 μl SYBR Green Mix（Thermo），8.0 μl RNAase-free水，正向和反向引物各0.5 μl，cDNA模板1.0 μl。利用ABI 7500定量PCR儀進行PCR擴增反應，反應程序：94 ℃，預變性32 min;94 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環。利用2-△△Ct法計算基因相對表達水平。大豆UBI3基因作為內參，本研究所用引物如表1所示。

2?結果與分析

2.1?大豆GRAS家族成員的理化性質及GRAS家族基因染色體定位

本研究最終在栽培大豆中共鑒定出78個GRAS家族成員，并根據基因在染色體上的位置將這些基因依次命名為GmGRAS1～GmGRAS78。通過數據庫ExPASy對大豆GRAS家族成員的理化性質進行分析。結果如表2所示，該家族成員的理化性質差異較大，蛋白質的長度在168 aa（GmGRAS35）至744 aa（GmGRAS1）之間，相對分子質量則介于1.897 584×104（GmGRAS35）至8.238 555×104（GmGRAS9）之間，等電點在4.82（GmGRAS63）至9.21（GmGRAS35）之間，不穩定系數在39.54（GmGRAS26）至61.75（GmGRAS1）之間，其中僅有GmGRAS26和GmGRAS47的不穩定系數小于40，說明這2個蛋白質被預測為穩定蛋白質。染色體定位分析結果表明，大豆GRAS家族78個基因不均勻地分布在20條染色體上，其中第11、12、13、15號染色體上分布較多，分別有12、6、9、7個;其次為第16號染色體，共有5個;第1、10、17號染色體上均包含4個GRAS基因，第2、3、5、9、18號染色體上均為3個GRAS基因，第4、6、7、14、20號染色體上則均有2個GRAS基因;而第8和第19號染色體上含有的GRAS基因數量最少，均為1個（圖1）。

2.2?大豆GRAS家族基因的系統進化分析

為了探究GRAS家族基因在大豆和其他物種之間的進化關系，我們將擬南芥、水稻和大豆GRAS家族蛋白質氨基酸序列進行多重比對后，繪制了系統進化樹。結果如圖2所示，參照GRAS家族基因在擬南芥和水稻中的分組方法，并參考蓖麻中GRAS亞家族的命名方式（其分為PAT1、SHR、SCL3、LISCL、HAM、SCL4/7、SCR、DELLA、DLT、Os43、 Os4、Os19、Rc_GRAS共13個亞族），將大豆GRAS家族分為11個亞家族，分別是PAT1、SHR、SCL3、LISCL、HAM、SCL4/7、SCR、Os24、DELLA、DLT、Gm10，而進化樹中LAS亞族不包含大豆GRAS家族成員。分析不同亞家族GRAS基因的數量，發現GRAS基因家族成員不均勻地分布在不同的亞家族。LISCL是最大的亞族，家族成員最多（共29個），包括了14個大豆GmGRAS基因、10個水稻OsGRAS基因和5個擬南芥AtGRAS基因。其次為PAT亞族，共包含27個GRAS基因，其中包括16個大豆GmGRAS基因、7個水稻OsGRAS基因和4個擬南芥AtGRAS基因。而DLT、SCL4/7、Gm10和SCL3則為較小的亞家族，分別包含了6、5、4、8個GRAS基因，其中Gm10亞族包含的4個成員均為大豆GRAS基因，SCL3亞族8個成員中僅有1個是大豆GRAS基因（GmGRAS18）。而在HAM、DELLA、SHR、Os24、SCR亞族中則分別包含10、10、9、5、4個大豆GRAS基因。

2.3?大豆GRAS家族基因結構及GRAS蛋白氨基酸序列上保守基序分布

利用在線軟件GSDS構建了GRAS家族基因的外顯子-內含子結構圖（圖3）。結果顯示，大部分基因（66個）不含有內含子，僅12個基因有內含子，其中Gm10亞族的GmGRAS62的內含子數量最多（6個），GmGRAS18屬于SCL3亞族，其包含4個內含子;GmGRAS24和GmGRAS35均有3個內含子，GmGRAS52含有2個內含子，而GmGRAS10、GmGRAS22、GmGRAS23、GmGRAS31、GmGRAS38、GmGRAS65和GmGRAS76均有1個內含子。大多數大豆GRAS基因（57個）在5′末端和3′末端都含有非翻譯區。此外，在78個GRAS蛋白氨基酸序列上共鑒定出10個保守基序（Motif 1-Motif 10）（圖4）。所有GRAS蛋白的保守基序主要集中在C端，并且同一亞族蛋白質含有的保守基序類型及位置均非常相似。如DELLA亞族蛋白質均含有除Motif 9以外的其他9個保守基序，SCR亞族蛋白質均含有除Motif 2和Motif 9以外的其他8個保守基序，這也進一步證明了相同亞族的GRAS家族成員進化關系較近。此外，除GmGRAS18僅含有1個保守基序Motif 4、GmGRAS35僅含有1個基序Motif 2、GmGRAS38僅含有2個基序Motif 3和Motif 7以外，其余大豆GRAS蛋白上的保守基序數量在6至10個之間。根據對不同亞族GRAS基因結構和GRAS蛋白保守基序的分析結果可知，同一亞族內的成員相對保守，推測同一亞族的基因功能可能相似。

2.4?大豆GRAS家族基因在不同組織中的表達

利用公共數據庫Phytozome中大豆GRAS家族基因在不同組織表達的FPKM值繪制基因表達熱圖。結果如圖5A所示，78個大豆GRAS基因的表達模式呈多樣化，其中GmGRAS18、GmGRAS23、GmGRAS25、GmGRAS35、GmGRAS38和GmGRAS62共6個基因在所有組織均未檢測到表達。有48個基因在所有組織均檢測到不同程度的表達，其中GmGRAS8、GmGRAS15、GmGRAS16、GmGRAS20、GmGRAS22、GmGRAS39和GmGRAS73共7個基因的表達水平在所有組織中均較高，而GmGRAS51在所有組織中表達均較低。此外，有些大豆GRAS基因表現出組織特異性高表達，如GmGRAS16、GmGRAS29、GmGRAS46、GmGRAS55和GmGRAS56在根中的表達水平最高，GmGRAS39、GmGRAS40和GmGRAS57在莖中的表達水平最高，而GmGRAS1、GmGRAS26、GmGRAS73和GmGRAS78在種子中的表達量最高，可以推測這些組織特異性高表達的基因可能在特定的組織發揮特定功能?？偠灾?，大豆GRAS家族基因在不同組織中的表達模式存在較大的差異，說明該家族基因在不同組織可能發揮其獨特的生物學功能。然而，同一亞族的某些基因具有類似的表達模式，如LISCL亞族的GmGRAS53和GmGRAS58，SHR亞族的GmGRAS54和GmGRAS57，DELLA亞族的GmGRAS15和GmGRAS20，且它們在進化樹上的進化關系也非常近（圖2），說明具有類似表達模式的基因可能也具有類似的功能。

2.5?GRAS家族基因響應鹽脅迫的表達模式

通過對正常生長和鹽處理（200 mmol/L NaCl，6 h）后的大豆植株進行轉錄組測序，獲得了大豆GRAS家族78個基因在正常和鹽脅迫下的表達數據FPKM值，并進一步繪制成表達熱圖（圖5B）。結果表明，大多數基因的表達水平在正常生長和鹽處理的大豆中表達水平無顯著差異，有5個基因（GmGRAS6、GmGRAS14、GmGRAS15、GmGRAS33、GmGRAS69）的表達水平在鹽脅迫下顯著上調，5個基因（GmGRAS17、GmGRAS45、GmGRAS54、GmGRAS57、GmGRAS71）在鹽脅迫下顯著下調。此外，我們還挑選了受鹽脅迫表達水平顯著變化的一些基因（GmGRAS14、GmGRAS33、GmGRAS69和GmGRAS17、GmGRAS54、GmGRAS57）通過qRT-PCR進行進一步驗證。結果見圖6，鹽處理后這些基因的表達水平變化與轉錄組測序結果一致，其中GmGRAS14和GmGRAS69在鹽處理3 h、6 h和12 h時表達水平均顯著上調，且在12 h時上調倍數最高，分別為3.67倍和5.82倍。GmGRAS33在鹽處理6 h和12 h時表達水平顯著上調，且在12 h時達到極顯著水平，上調5.92倍。而GmGRAS17和GmGRAS57在鹽處理3 h、6 h和12 h時表達水平均顯著下調;GmGRAS54在鹽處理3 h時與對照無顯著差異，在鹽處理6 h和12 h時其表達水平顯著下調。以上結果說明表達水平受鹽脅迫上調或下調的基因在大豆鹽脅迫響應過程中可能發揮調控作用。

3?討論

GRAS家族基因在植物生長發育和多種生理過程中發揮重要作用，參與赤霉素信號轉導、赤霉素等激素的代謝、根的發育、響應生物和非生物脅迫的轉錄調控等過程。GRAS家族的全基因組學鑒定以及它們的進化關系也已在很多植物中被研究，如模式植物擬南芥[6]和煙草[11]以及常見的農作物水稻[10]、玉米[12]、甘薯[14]、棉花[8]等。并且已有部分GRAS家族基因在植物中的功能及分子機制被報道。但是關于大豆GRAS家族的全基因學鑒定及基因功能的研究卻很少。因此，本研究從大豆基因組數據庫鑒定出GRAS家族成員并進行全面的生物信息學分析。這將有助于我們研究大豆GRAS家族的進化并推測一些未知功能的大豆GRAS基因的生物學功能。

本研究在大豆基因組中共鑒定出78個大豆GRAS家族基因，比擬南芥（33個）[6]、水稻（50個）[10]、白菜（46個）[28]、甘薯（70個）[14]的GRAS家族成員數量多，但是比棉花GRAS家族成員少（150個）。造成這一現象的原因可能是不同物種間基因組大小的差異，如大豆基因組大小為952.48 Mb，而擬南芥、水稻、白菜和甘薯的基因組大小分別為125.0 Mb、374.0 Mb、283.3 Mb和492.38Mb，棉花的基因組大小則為2 126.03 Mb。此外，需要特別注意的是，Wu等[29]在大豆中鑒定出106個GRAS家族基因，而本研究鑒定出的GRAS基因數量與之有所差異，可能是篩選方式不同所致。本研究鑒定GRAS基因時主要利用公共數據庫的數據，但同時參考我們自己測定的轉錄組結果中的GO注釋，或許我們的轉錄組測序結果中注釋的GRAS基因較實際要少一些，但本文研究的大豆GRAS基因均包含于已報道的106個基因中。Hirsch等[6]將擬南芥GRAS家族基因分為8個亞家族，包括LISCL、PAT1、SCL3、DELLA、SCR、SHR、LAS和HAM。而我們構建的擬南芥、水稻和大豆GRAS家族成員的進化樹分為12個亞族，但是LAS分支中不含有大豆GRAS基因，因此將大豆GRAS基因家族分為11個亞家族，包括LISCL、PAT1、SCL3、DELLA、SCR、SHR、HAM、SCL4/7、Os24、DLT和Gm10，其中Gm10亞族中的4個成員均來自大豆。說明大多數GRAS家族成員在進化上非常保守，而少數成員則在進化過程中具有物種特異性。此外，我們發現蛋白質上保守基序數量及分布位置相同的GRAS成員，其理化性質也類似，推測其基因也具有類似的功能，如GmGRAS27和GmGRAS77。

通常認為在系統進化樹上聚集在同一亞族的基因可能具有類似的功能[14，30-32]，因此我們分析了擬南芥、水稻和大豆GRAS基因家族的系統進化關系，為大豆GRAS家族基因功能的預測提供可靠的依據。進一步分析了大豆GRAS家族基因在不同組織中的表達模式，發現大豆GRAS家族基因在不同組織的表達模式存在差異，與之前報道的其他物種（如甘薯、白菜）中的表達情況類似[14]。有7個大豆GRAS基因（GmGRAS8、GmGRAS15、GmGRAS16、GmGRAS20、GmGRAS22、GmGRAS39和GmGRAS73）的表達水平在所有組織中均較高，說明這些基因可能在大豆生長發育的多個環節都具有重要功能。盡管Wu等[29]的研究已包含大豆GRAS家族全基因組學鑒定方面的工作，但是其未關注GRAS家族基因在鹽脅迫下表達模式分析。本研究通過對正常生長和NaCl處理的大豆進行轉錄組測序，分析了大豆GRAS家族基因在鹽脅迫后的表達情況，結果表明，有5個基因（GmGRAS6、GmGRAS14、GmGRAS15、GmGRAS33、GmGRAS69）的表達水平在鹽脅迫下顯著上調，而GmGRAS17、GmGRAS45、GmGRAS54、GmGRAS57和GmGRAS71的表達水平顯著下調。qRT-PCR分析結果顯示GmGRAS14、GmGRAS33和GmGRAS69在鹽處理6 h時表達水平均顯著上調，與轉錄組測序結果一致，且3個基因均在鹽處理12 h時上調倍數最高，分別為3.67倍、5.92倍和5.82倍;而GmGRAS17、GmGRAS54和GmGRAS57的表達水平在鹽處理6 h、12 h時均顯著下調，與轉錄組結果一致。通過系統進化分析、鹽脅迫下的表達模式分析以及qRT-PCR檢測，可初步推測大豆GRAS家族基因在生長發育過程和鹽脅迫響應方面具有重要功能。本研究也為大豆GRAS基因功能的進一步研究及利用該家族基因培育大豆耐鹽新品種提供了理論依據。

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（責任編輯：張震林）