外源GABA對鹽脅迫下金花菜種子萌發及幼苗抗氧化能力的影響

趙嫚 陳仕勇 李亞萍 周青平 陳有軍 常馨丹

摘要：?以楚雄金花菜種子為研究材料，通過測定種子萌發特性、胚芽鮮質量、胚芽干質量、胚根鮮質量、胚根干質量、胚根長、超氧陰離子（O2·-）含量、過氧化氫（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶活性，研究外源GABA（γ-氨基丁酸）對鹽脅迫下金花菜種子萌發及幼苗生長的影響。結果表明，0.5～2.0 μmol/L GABA預處理提高了鹽脅迫下金花菜種子的發芽勢、活力指數，并顯著縮短了平均萌發時間。100 mmol/L鹽脅迫對幼苗胚芽鮮質量無影響，但顯著降低了胚芽干質量、胚根干質量、胚根鮮質量及胚根長，而0.5～2.0 μmol/L GABA預處理誘導了胚芽和胚根鮮質量、干質量及胚根長的增加。GABA預處理不同程度地提高了鹽脅迫下金花菜幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶 （POD）、過氧化氫酶 （CAT）和抗壞血酸過氧化物酶 （APX）活性，降低了O2·-、H2O2以及MDA含量。GABA能夠激活抗氧化酶活性，降低鹽脅迫誘導的氧化傷害和膜損傷，改善了金花菜在種子萌發階段的抗鹽性，且在0.5～2.0 μmol/L濃度范圍內均有效果。

關鍵詞：?金花菜;鹽脅迫;種子萌發;GABA;抗氧化保護

中圖分類號：?S54??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0310-07

Abstract：?Using the seed of Medicago polymorpha cv. Chuxiong as material， the effect of exogenous γ-aminobutyric acid （GABA） on seed germination and seedling growth under salt stress were determined by analyzing seed germination characteristics， fresh and dry weight of embryos and radicles， radicle length， superoxide anion （O2·-） content， hydrogen peroxide （H2O2） content， malonaldehyde （MDA） content and antioxidant enzyme activities. The results showed that the seed germination potential and vigor indexes of M. polymorpha cv. Chuxiong under salt stress were enhanced after pretreated with 0.5-2.0 μmol/L GABA， and the mean germination time was shortened. Salt stress with 100 mmol/L NaCl showed no effect on the fresh weight of embryos， but the dry weight of embryos and radicles， the fresh weight of radicles and radicle length were significantly reduced， while the pretreatment with 0.5-2.0 μmol/LGABA increased the fresh and dry weight of radicles and radical length. Pretreatment of GABA for M. polymorpha cv. Chuxiong seedlings under salt stress improved the activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT） and ascorbate peroxidase （APX）， decreased the contents of O2·-， H2O2 and MDA in varying degrees. The results suggest that GABA can activate the activities of antioxidant enzymes， reduce the oxidation damage and membrane injury induced by salt stress， leading to the improved salt tolerance of M. polymorpha cv. Chuxiong in seed germination stage， and the effective concentration scope of GABA is 0.5-2.0 μmol/L.

Key words：?Medicago polymorpha L.;salt stress;seed germination;γ-aminobutyric acid （GABA）;antioxidant protection

金花菜（Medicago polymorpha L.），又名南苜蓿、秧草、草頭等，是一種優質的苜蓿屬牧草，其具有蛋白質含量高，粗纖維含量低，品質優良，營養豐富等特點，同時也是一種食用蔬菜，含有豐富的鷹嘴豆芽素A、植物皂素、蛋白質、鈣和磷等，被認為是最富營養的野菜，此外金花菜還具有綠肥的功能[1-2]。金花菜主要分布于中國長江流域以南等沿海各?。ㄊ?、區），特別在江蘇、浙江、上海一帶分布較多。但沿海地區土壤鹽漬化相對嚴重，鹽脅迫也成為影響植物產量和品質的重要因素。土壤中鹽分的積累，降低了植物可利用的水的含量，并阻礙其對養分的吸收。因此，鹽脅迫使植物遭受光合抑制，擾亂代謝平衡，損傷細胞膜結構，最終抑制植物的生長和產量[3]。而如何提高植物的耐鹽性對于金花菜等植物的種植具有重要意義。

目前植物生長調節劑被廣泛應用于改善植物對逆境的抗性研究中。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）普遍存在于有機生物體中，是一類非蛋白氨基酸，研究發現，在干旱、鹽、熱等逆境脅迫下GABA大量積累[4]，但是其積累是因為植物的脅迫保護作用。GABA是一種信號分子，并與植物激素相互協調發揮作用，且在逆境脅迫下，GABA能夠發揮滲透調節、抗氧化保護以及清除活性氧的功能[5]。在逆境脅迫下，高效的抗氧化系統對豆科草類植物至關重要，研究發現抗氧化酶系統在豆科苜蓿屬植物抵御鹽脅迫中發揮了重要作用[6]。種子萌發是植物生命階段對鹽等逆境脅迫最為敏感的階段，近年來通過添加外源物質緩解植物鹽脅迫已經成為一個重要的研究方向，而GABA作為一種生理活性物質，能促進植物生長，在多種逆境脅迫中具有積極的調節作用。因此，本試驗研究GABA對鹽脅迫下金花菜種子萌發的影響，并探究GABA增強金花菜抗鹽害能力的生理機制，為鹽脅迫下GABA在金花菜種子萌發及早期幼苗生長應用中提供理論基礎。

1?材料與方法

1.1?供試材料

本研究中供試金花菜選用的是國審牧草品種楚雄金花菜（Medicago polymorpha cv. Chuxiong），種子由四川省草原科學院提供。

1.2?試驗設計

1.2.1?材料培養和處理?挑選出的金花菜種子經1%的NaClO消毒8 min，蒸餾水洗凈后待用。取上述種子分別于GABA溶液（濃度為0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L）浸泡2 h，該過程在避光條件下進行。本試驗共設6個處理，分別是： 1）對照（CK），將在0 μmol/L GABA溶液中浸種過的種子接種于蒸餾水浸濕的濾紙;2）鹽脅迫對照（N），將在0 μmol/L GABA溶液中浸種過的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙（根據前期鹽脅迫試驗篩選出適宜NaCl濃度為100 mmol/L [7]）;3）鹽脅迫+0.5 μmol/L GABA處理（0.5 μmol/L GABA+100 mmol/L NaCl，GN1），將在0.5 μmol/L GABA溶液中浸種過的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙;4）鹽脅迫+1.0 μmol/L GABA處理（1.0 μmol/L GABA+100 mmol/L NaCl， GN2），將在1.0 μmol/L GABA溶液中浸種過的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙;5）鹽脅迫+1.5 μmol/L GABA處理（1.5 μmol/L GABA + 100 mmol/L NaCl， GN3），將在1.5 μmol/L GABA溶液中浸種過的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙;6）鹽脅迫+2.0 μmol/L GABA處理（2.0 μmol/L GABA+100 mmol/L NaCl， GN4），將在2.0 μmol/L GABA溶液中浸種過的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙。每個處理設置4個重復，每個重復的培養皿放置50粒種子，每隔2 d更換1次濾紙。將培養皿置于光照培養箱內培養，培養條件為白天23 ℃/16 h，夜間18 ℃/8 h;每天記錄發芽數，連續培養觀察14 d。

1.2.2?測定指標及方法

1.2.2.1?種子萌發特性的測定?發芽率（GR）=14 d內種子發芽數/供試種子總數×100%;

發芽勢（GE）=4 d內種子發芽數/供試種子總數×100%;

發芽指數（GI）=∑Gt/t （Gt：第t d種子發芽數;t：相應發芽天數）[8];

平均萌發時間（MGT）=∑Gt×t/∑Gt （Gt：第t d種子發芽數;t：相應發芽天數）[9];

活力指數（VI）= GI×FW（GI：發芽指數，FW：幼苗的平均鮮質量）;

每個重復隨機挑選5株進行胚根長以及胚芽和胚根鮮質量、干質量的測定。

1.2.2.2?幼苗抗逆生理指標的測定?采用Velikova等[10]的方法測定樣品過氧化氫（H2O2）含量，采用Elstner等[11]的方法測定超氧陰離子（O2·-）濃度，采用愈創木酚顯色法[12]測定過氧化物酶（POD）活性，采用核黃素-NBT法[13]測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用紫外吸收法[12]測定過氧化氫酶（CAT）活性，采用Nakano等[14]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量[15]。

1.3?數據分析

本研究采用Excel 2019進行數據整理和繪圖，采用SPSS 25.0軟件進行方差分析，采用新復極差法進行多重比較。

2?結果與分析

2.1?外源GABA對鹽脅迫下金花菜種子萌發特性的影響

由圖1可知，100 mmol/L的NaCl影響了金花菜種子的萌發，外源GABA預處理顯著提高了金花菜種子的發芽勢、活力指數，縮短了平均萌發時間（P<0.05）。0.5～2.0 μmol/L GABA預處理的金花菜種子發芽勢比NaCl脅迫對照（N）分別提高了15.31%、18.01%、18.01%、22.97%（圖1A），活力指數分別提高了42.60%、40.43%、43.53%、34.23%（圖1D），平均萌發時間從2.34 d分別縮短到2.06 d、2.04 d、2.13 d、2.02 d（圖1E）。此外，在鹽脅迫下外源GABA雖然提高了金花菜種子的發芽率和發芽指數，但與鹽脅迫對照差異不顯著（P>0.05）（圖1B，圖1C）。

2.2?外源GABA對鹽脅迫下金花菜幼苗生長的影響

由圖2可知，與對照（CK）相比，鹽脅迫處理（N）顯著降低了金花菜幼苗胚芽干質量、胚根鮮質量、胚根干質量以及胚根長度（P<0.05），但對胚芽鮮質量無顯著影響（P>0.05）。鹽脅迫下，經0.5～2.0 μmol/L GABA預處理的金花菜幼苗胚芽鮮質量分別比CK顯著增高13.61%、20.34%、20.69%、15.75%， 0.5～1.5 μmol/L GABA預處理同樣顯著增加了胚根鮮質量。與鹽脅迫對照相比，GABA預處理顯著增加了鹽脅迫下金花菜幼苗胚芽干質量、胚根干質量以及胚根長度，其中經0.5～2.0 μmol/L GABA處理的金花菜幼苗胚芽干質量、胚根干質量、以及胚根長度恢復到正常水平，與CK相比無顯著差異（P>0.05）。

2.3?外源GABA對金花菜幼苗活性氧產生和膜損傷的影響

如圖3所示，鹽脅迫誘導金花菜幼苗O2·-、H2O2、MDA含量顯著增加，但是外源GABA有效緩解了鹽脅迫下三者的積累。與CK相比，鹽脅迫使金花菜幼苗超氧陰離子含量增加了51.34%，不同濃度的GABA預處理緩解了鹽脅迫誘導的O2·-的積累，且各GABA處理濃度之間無顯著差異，與鹽脅迫對照相比，僅1.0 μmol/L GABA處理顯著降低了O2·-含量（P<0.05）。同時，與鹽脅迫對照相比，0.5～2.0 μmol/L GABA處理顯著降低了H2O2和MDA含量，且其H2O2含量恢復到正常水平;除了0.5 μmol/L GABA處理外，其他GABA處理的MDA含量亦恢復到正常水平（圖3B，圖3C）。

2.4?外源GABA對金花菜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖4可知，鹽脅迫下，外源GABA對金花菜幼苗抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性有顯著的促進作用。與CK相比，鹽脅迫和鹽脅迫下不同濃度的GABA預處理顯著增加了幼苗SOD和POD活性，但在0.5～2.0 μmol/L GABA濃度范圍內，SOD和POD活性不隨GABA濃度的變化而變化。同樣的，鹽脅迫誘導金花菜幼苗CAT、APX活性增加，而鹽脅迫下GABA預處理進一步誘導2個酶活性增加，分別比鹽脅迫對照增加140.75%、59.79%、84.08%、89.34%和22.23%、13.48%、47.86%、38.41%，且0.5 μmol/L GABA預處理的金花菜幼苗CAT活性顯著高于其他濃度GABA預處理（P<0.05）。

3?討論

種子萌發是一個復雜的生理過程，容易受到干旱和鹽等非生物脅迫的影響[16]，同時研究發現種子萌發過程同樣受植物激素和生理活性物質的調控。GABA是一種非蛋白質氨基酸，由谷氨酸脫羧酶催化合成和多胺降解而來，易溶于水，其生化特性和脯氨酸、甜菜堿類似，是一種促進細胞正常生長的滲透調節物質，在植物的生長發育以及抵御環境脅迫中發揮作用[17]。本試驗探究了外源GABA對鹽脅迫下金花菜種子萌發的調控作用，發現0.5～2.0?μmol/L GABA能夠有效緩解鹽脅迫對金花菜種子萌發的抑制作用，主要表現在顯著提高了發芽勢、活力指數以及縮短了平均萌發時間，同時顯著增加了幼苗胚芽和胚根的鮮質量、干質量以及胚根長。張志清等[18]研究發現，小麥（Triticum aestivum L.）在萌發的0～8 h內，內源GABA含量逐步增加，羅黃穎等[19]研究發現，10 mmol/L的GABA同樣促進了鹽脅迫下設施番茄（Lycopersicon esculentum Mill）種子的萌發和幼苗生長。以上研究結果說明種子萌發需要GABA一定程度的積累，可能是由于其能夠促進乙烯的合成，而研究發現乙烯能夠消減鹽脅迫對種子萌發的抑制作用[20]，且不同植物所需的最適GABA濃度有差異。

鹽脅迫誘導ROS累積，對植物產生毒害作用，導致細胞膜損傷以及相關脂質過氧化，最終引起MDA含量增加，研究發現MDA的累積量可以反映植物受氧脅迫的程度[21]。如鹽脅迫誘導O2·-、H2O2以及MDA含量在黑麥草中顯著增加，而外源硅在緩解鹽脅迫的同時降低了三者的含量[22]。本研究結果表明，鹽脅迫誘導O2·-、H2O2、MDA含量顯著增加，但0.5～2.0 μmol/L GABA預處理降低了三者的含量，其中1.0 μmol/L GABA緩解O2·-積累的效果最好，各GABA濃度對H2O2的緩解效果無差異，而0.5 μmol/L GABA對MDA的緩解效果最差。由此說明，GABA同樣能夠緩解鹽脅迫引發的氧化脅迫對金花菜幼苗的傷害。

為維持活性氧代謝平衡，植物在長期的進化過程中已經形成一套完整的酶類和非酶類抗氧化系統，其中ROS清除酶包括：超氧化物酶歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）以及過氧化物酶（POD），這些抗氧化酶位于植物細胞的不同部位，但同時發揮清除活性氧的作用。研究發現，酶活性越高，植物受到逆境脅迫的傷害就越小[23-26]。本研究發現，鹽脅迫下金花菜幼苗SOD、POD、CAT、APX活性升高，但在鹽脅迫下0.5～2.0 μmol/L GABA預處理進一步誘導了抗氧化酶活性增加。Wang等[27]研究發現，GABA同樣提高了鹽脅迫下玉米抗氧化酶活性，也有研究發現在逆境脅迫下超表達乙烯誘導的轉錄因子JERF3能提高抗氧化酶活性[28]，而外源GABA能夠增加乙烯的合成，因此GABA可能通過影響植物激素含量及轉錄因子的表達，提高抗氧化酶活性，緩解逆境對植物的傷害。

4?結論

鹽脅迫降低了金花菜種子的發芽率和活力，并延長了平均萌發時間，抑制了幼苗地上部分和地下部分的生長。外源施用0.5～2.0 μmol/L GABA緩解了鹽脅迫對金花菜種子萌發的不利影響，通過提高SOD、POD、CAT以及APX活性，清除鹽脅迫誘導的ROS積累，降低了細胞膜過氧化產物MDA的累積，最終提高種子發芽率、種子活力及幼苗胚根、胚芽質量。

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（責任編輯：陳海霞）