鹽脅迫對毛竹實生苗形態生理生化特征的影響

侯思璇 李傳哲 劉國華 楊蒙 鄭毅 姚文靜

摘要：為探究鹽脅迫對毛竹生長發育的影響，分析了不同濃度NaCl溶液（0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mmol/L）脅迫條件下毛竹3個月生實生苗形態生理生化特征的變化。隨著鹽脅迫濃度的增高，毛竹實生苗的葉片卷曲程度增加，葉片黃化現象嚴重;葉片MDA含量呈上升趨勢，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量呈先升后降的趨勢，在50.0 mmol/L NaCl脅迫6 h時達到最高;在≤50.0 mmol/L NaCl條件下，毛竹實生苗葉片氮藍四唑（NBT）、二氨基聯苯胺（DAB）、Evans blue染色程度與對照條件相似，在>50.0 mmol/L NaCl濃度下，毛竹實生苗葉片與對照條件相比染色程度加深、面積增大。以上結果揭示了毛竹實生苗具有一定的耐鹽性（<50.0 mmol/L），為毛竹耐鹽能力鑒定和鹽堿地區毛竹的竹林培育提供了科學依據。

關鍵詞：毛竹;鹽脅迫;形態;生理生化特征;生化染色

中圖分類號： Q945.78;S795.701 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0136-05

竹子屬于禾本科竹亞科，具有生長迅速、可再生性強、適應性強等特點[1]。竹子用途非常廣泛，可作筍用、觀賞用、生活用、工藝制品用、建材用等[2]。此外，竹資源在保持生態平衡和應對氣候變化等方面也發揮著獨特作用[3]。但竹林的分布具有明顯的地帶性和區域性，主要集中在氣候溫潤的長江以南地區，在寒冷、干旱及鹽堿地區幾乎沒有生長[4-5]。因此鑒定竹種的抗逆能力，篩選出一些耐寒、耐旱、耐鹽堿的優良竹苗，有效地篩查、選擇、拓寬竹子在我國的種植范圍，可大大提高竹子產量。

目前已有不少學者對環境脅迫下竹子的生長發育、生理、生化等方面進行了研究，為竹子抗逆能力鑒定提供了科學的理論依據[6]。例如，胡俊靖等綜述了水分脅迫對竹子膜脂過氧化、抗氧化酶活性、滲透調節物質、光合生理特性等的影響，分析了竹子在水分脅迫條件下的生理適應與響應規律[7];應葉青等的試驗表明，干旱脅迫條件下毛竹幼苗的光合速率、蒸騰速率、葉綠素a和葉綠素b含量與對照條件相比均有所下降，超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量等與對照相比則明顯增加[8];易守理等研究表明，大葉慈竹主要依靠較高的SOD和CAT活性抵御低溫傷害，慈竹則憑借較高的SOD 和過氧化物酶（POD）活性來抵御低溫傷害[9]。

我國江蘇沿海灘涂面積（68.7萬hm2）較大，約占全國灘涂面積的25%，且以1 300 hm2/年的速度不斷增長[10]。植樹造林是沿海灘涂鹽堿地改良的一個重要措施，然而沿海灘涂地區土壤含鹽量較高，適生樹種少。在高鹽脅迫條件下苗木難以存活是制約沿海灘涂植樹綠化的關鍵因素[11]。作為一種生長速度快、可再生性強、適應性強、用途廣泛的非木質植物資源，竹子成為生長效益和經濟效益較高的首選綠化栽培植物之一[1-3]。其中毛竹（Phyllostachys edulis）生長密度大，是我國分布最廣、蓄積量最大、經濟價值最高的重要經濟竹種，我國90%的竹材都來源于毛竹[3]，因此對其鹽脅迫適應性的研究十分重要。但至今還未有鹽脅迫對毛竹實生苗生長發育影響的系統研究。本研究分析不同濃度NaCl對毛竹3個月生實生苗形態生理生化方面的影響，探究毛竹實生幼苗在鹽脅迫條件下的生長發育規律，以填補毛竹實生苗耐鹽能力研究的空白。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗時間為2019年10月至2020年6月，地點為南京林業大學（118°48′42″E，32°04′34″N）。

1.2 試驗材料處理

毛竹種子采自廣西壯族自治區桂林市靈川縣。將種子播于泥炭土 ∶ 黃棕壤 ∶ 珍珠巖=12 ∶ 12 ∶ 1（體積比）的土壤中，置于20～24 ℃、光照/黑暗周期為12 h/12 h的植物光照培養箱中培養3個月。待毛竹幼苗長出4～6張葉片時，選擇長勢較好的健康幼苗連根帶土整體挖出，用水洗凈根部放入水中繼續培養1周（圖1）。

水培1周后，將毛竹幼苗分別放在0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mmol/L的NaCl溶液中進行處理，編號為0～5號，每個處理3次生物學重復，每次生物學重復10株幼苗。分別在3、6、24 h的時間點觀察毛竹實生苗的形態變化，并進行破壞性取樣用于各項生理指標測定和生化染色觀察。

1.3 生理生化指標的測定

毛竹葉片SOD活性采用抑制氮藍四唑（NBT）光還原法測定，POD活性采用愈創木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍 G-250 染色法測定，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定[12-14]。毛竹葉片NBT、二氨基聯苯胺（DAB）和Evans blue染色參考煙草葉片的染色方法[15]。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對毛竹實生苗形態的影響

毛竹實生苗的外部形態變化是植物受到鹽脅迫時最直觀的反應。如圖2所示，處理3 h，200.0 mmol/L NaCl溶液下的小部分幼苗葉片稍有卷曲，其余濃度下的幼苗均無明顯變化（圖2-A）;處理6 h，100.0、200.0 mmol/L NaCl溶液處理的毛竹幼苗葉片已經有明顯卷曲，50.0 mmol/L NaCl溶液處理的幼苗也開始發生葉片卷曲的現象（圖2-B）;處理24 h，50.0、100.0、200.0 mmol/L NaCl溶液處理的毛竹幼苗均出現葉片卷曲的現象，并且隨著濃度的升高，卷曲葉片的數量越多、程度越大（圖2-C）。其中，100.0、200.0 mmol/L濃度下的毛竹葉片已經完全卷曲，葉片也有發黃的跡象。結果表明，低濃度的NaCl溶液（<50.0 mmol/L）對毛竹實生苗形態的影響不大，但長時間、高濃度的NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）處理會使毛竹幼苗葉片發生明顯的卷曲、黃化。隨著時間的推移和鹽濃度的增加，毛竹幼苗被脅迫的程度增加。

2.2 NaCl脅迫對毛竹實生苗生理指標的影響

如圖3所示，毛竹葉片SOD、POD、CAT活性隨著NaCl溶液濃度的增高呈現先升后降的趨勢。在低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫下，隨著NaCl濃度的增加SOD、POD、CAT活性明顯增加，隨著脅迫時間增加酶活性變化明顯，脅迫處理6 h時酶活性最大。高濃度NaCl溶液脅迫下，SOD、POD、CAT活性明顯下降，酶活性隨脅迫時間延長變化不明顯。以上結果表明，低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫下，毛竹葉片所受到的脅迫程度較低，產生的有害物質較少，植物體內抗氧化酶活性的提高足以清除植物體內產生的有害物質，毛竹葉片受到的損害較小;高濃度NaCl溶液（>100.0 mmol/L）脅迫下，植物體內的酶活性無法完全催化分解有害物質，導致植物膜和組織受到不可逆的嚴重損傷。毛竹葉片MDA含量隨著NaCl溶液濃度的增高和脅迫時間的增長，呈明顯上升趨勢。

當NaCl溶液濃度≤100.0 mmol/L時，MDA含量變化隨脅迫時間延長變化較小;當NaCl溶液濃度達到200.0 mmol/L時，MDA含量隨脅迫時間延長變化明顯，在脅迫24 h時達到最高。以上結果表明，NaCl溶液濃度越高脅迫時間越長，毛竹葉片中MDA積累越多，質膜受損害程度越大，低濃度的鹽脅迫對毛竹幼苗影響較小，高濃度的鹽脅迫會嚴重迫害毛竹質膜。毛竹葉片可溶性蛋白質含量隨著NaCl溶液濃度的升高，呈現先上升后降低的趨勢。低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫可刺激毛竹有機體合成可溶性蛋白質，提高自身的防御功能。高濃度NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）脅迫破壞了毛竹葉片細胞生物膜及細胞內滲透系統，可溶性蛋白質合成受阻，含量下降。毛竹葉片游離脯氨酸含量隨著NaCl溶液濃度升高也呈先升后降的趨勢。低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫條件下，毛竹葉片脯氨酸含量增高趨勢明顯，脅迫處理6 h時達到最大值;高濃度NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）脅迫時，毛竹葉片游離脯氨酸含量明顯下降。高濃度鹽脅迫導致植物體合成脯氨酸的能力降低。

2.3 NaCl脅迫下毛竹實生苗葉片生化染色

逆境脅迫條件下，植物體內的活性氧平衡遭到破壞，活性氧的積累導致植物膜結構損害和細胞死亡。生化染色可區分出植物活細胞，有活性的細胞有外排功能不被染色。如圖4所示，當NaCl溶液濃度較低時（<50.0 mmol/L），毛竹葉片染色程度與對照條件下類似。隨著NaCl溶液濃度的增高和脅迫時間的延長，毛竹葉片被染色的區域變大、顏色變深，表明毛竹葉片細胞死亡數量增多。在NaCl濃度為200.0 mmol/L時，毛竹葉片染色顏色最深。說明毛竹實生苗在高濃度NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）處理下，體內活性氧的積累量自身不可消除，葉片細胞大量死亡，有機體受到不可逆的傷害。

3 討論與結論

逆境脅迫會影響植物的正常生長發育，導致植物形態、生理、生化等多方面發生變化[15]。形態上主要表現為葉片萎蔫變黃、葉面積減少、葉片脫落等。生理水平上的變化可從一系列生理、生化指標中反映出來，如抗氧化酶活性、活性氧（H2O2、O-2·、·OH等）積累、死細胞數目等[15-19]。SOD是廣泛分布于植物體內的一種抗氧化金屬酶，在有機體內起氧化與抗氧化平衡的作用[16]。POD是普遍存在于植物體內的一種氧化還原酶，參與植物的光呼吸作用和乙醛酸循環，其活性與植物的代謝強度和抗逆能力存在一定關系[17]。MDA是生物體內自由基和脂質氧化生成的，其產生會加劇膜的損傷，影響線粒體部分關鍵酶活性和呼吸復合鏈[18]。CAT普遍存在于各種生物有機體細胞中，可催化細胞中的過氧化氫轉化為無害或傷害較小的其他物質以降低對植物機體造成的損害[19]。植物為了抵抗逆境脅迫會啟動防御系統，清除植物體內的活性氧等有害物質。當植物受到的傷害過大，植物體內有害物質的產生與清除失去平衡，可能會導致不可逆的細胞內穩態失衡如脂質過氧化、膜損傷、酶失活等，最終導致細胞死亡[17-19]。

本研究以毛竹3個月實生幼苗為研究對象，分析了不同濃度NaCl溶液對其形態生理生化方面的影響。低濃度鹽脅迫條件下，毛竹幼苗形態上的變化較小。但在高濃度鹽脅迫下，毛竹實生苗葉片就會發生明顯卷曲、黃化。隨著鹽脅迫濃度的增高和脅迫時間的延長，毛竹實生苗葉片MDA含量呈上升趨勢，與觀音竹、綠竹MDA含量隨鹽分脅迫的加重而提高的試驗結果[20-21]一致。毛竹實生苗葉片SOD、POD、CAT活性表現為先升高后降低的規律，與不同濃度鹽脅迫下白竹及其他植物如柳樹、素馨屬植物、李屬彩葉植物等的酶活性表現出先升后降的趨勢[22-25]一致。毛竹實生苗葉片游離脯氨酸含量隨著鹽濃度的增高也出現先增后減的趨勢，與綠竹、大頭典、吊絲單隨脅迫強度的增強和脅迫時間的延長而增加的結果[26]不同，但與其他植物在不同濃度鹽脅迫后游離脯氨酸含量變化的研究結果[23-25]一致。生化染色結果表明，毛竹實生苗葉片染色程度隨著鹽濃度增加而加深，間接說明在高濃度鹽脅迫下毛竹實生苗葉片會積累大量活性氧，造成細胞的大量死亡。綜上，在一定鹽濃度范圍內，毛竹實生苗可通過調節自身內部物質和抗氧化酶活性降低外界脅迫對植物機體造成的傷害。毛竹實生苗所能承受的鹽濃度為50 mmol/L（約0.3%），低于綠竹、大頭典、吊絲單等所能忍受的鹽分質量（0.4%）[26]和觀音竹所能承受的鹽分質量（0.5%）[20]，可能原因是選取的竹子苗期不同，毛竹為3個月生實生苗，而其他研究中選取的竹子為成苗。

我國鹽堿地面積大、分布范圍廣，長江以北地區和諸多沿海地區，特別是江蘇沿海地區的土壤中往往鹽含量過高，限制了竹子的生長范圍。目前利用種子培育實生苗是篩選優良無性系和竹類植物種質創新的有效途徑[27]。確定了毛竹實生苗的耐鹽限度，能有效地篩查、選擇和拓展毛竹實生苗造林的區域，或者通過土壤改良使其適宜毛竹實生苗的生長，為拓寬毛竹在江蘇沿海灘涂鹽堿地的種植范圍、提高江蘇省毛竹產量提供理論依據。

參考文獻：

[1]凡美玲，方水元，馮俊嬌，等. 4個竹種高生長模型的比較[J]. 竹子學報，2018，37（2）：64-70.

[2] Liese W，Khl M. Bamboo：the plant and its uses [M]. Heidelberg：Springer，2015.

[3]姚文靜，王 茹，王 星，等. 毛竹實生苗生長發育規律及其模型擬合研究[J]. 西部林業科學，2020，49（3）：14-20，28.

[4]李正才，傅懋毅，姜景民，等. 毛竹天然林表型特征的地理變異研究[J]. 林業科學研究，2002，15（6）：654-659.

[5]周本智，傅懋毅，楊校生，等. 我國能源竹類植物資源及其開發潛力[J]. 世界林業研究，2006，19（6）：49-52.

[6]景 雄，蔡春菊，范少輝，等. 環境脅迫下竹類植物生態適應性研究進展[J]. 世界林業研究，2018，31（4）：36-41.

[7]胡俊靖，陳衛軍，郭子武，等. 水分脅迫對竹子生理特性影響的研究進展[J]. 西南林業大學學報，2015，35（1）：91-95.

[8]應葉青，郭 璟，魏建芬，等. 干旱脅迫對毛竹幼苗生理特性的影響[J]. 生態學雜志，2011，30（2）：262-266.

[9]易守理，雷 霆，高素萍. 低溫脅迫對兩種叢生竹抗氧化劑活性影響的研究[J]. 北方園藝，2010（19）：153-156.

[10]郭文琦，張培通，李春宏，等. 沿海灘涂綠化樹種選擇和耐鹽性評價[J]. 江蘇農業科學，2014，42（10）：175-177.

[11]張 健，李玉娟，李 敏，等. 江蘇沿海灘涂鹽堿地綜合改良技術[J]. 安徽農學通報，2011，17（12）：172.

[12]孔祥生，易現峰. 植物生理學實驗技術[M]. 北京：中國農業出版社，2008：252-264.

[13]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000：182-192.

[14]王晶英. 植物生理生化實驗技術與原理[M]. 哈爾濱：東北林業大學出版社，2003：133-136.

[15]姚文靜. 楊樹轉錄因子ERF76基因耐鹽功能研究[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2016：62-64.

[16]Alscher R G，Erturk N，Heath L S. Role of superoxide dismutases （SODs） in controlling oxidative stress in plants[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（372）：1331-1341.

[17]Xie Z X，Duan L S，Tian X L，et al. Coronatine alleviates salinity stress in cotton by improving the antioxidative defense system and radical-scavenging activity[J]. Journal of Plant Physiology，2008， ?165（4）：375-384.

[18]Gill S S，Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：909-930.

[19]Yao W J，Wang L，Zhou B R，et al. Over-expression of poplar transcription factor ERF76 gene confers salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Journal of Plant Physiology，2016，198：23-31.

[20]吳幼容，鄭郁善. 觀音竹對鹽脅迫的生長及生理生化響應[J]. 福建林學院學報，2012，32（1）：23-27.

[21]鄭郁善，鄭容妹，姚慶端. 鹽分脅迫對沿海沙地綠竹生理生化的效應[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），2003，32（4）：478-481.

[22]何開躍，郭春梅. 鹽脅迫對3種竹子體內SOD、POD活性的影響[J]. 江蘇林業科技，1995，22（4）：11-14.

[23]季琳琳，吳中能，劉俊龍，等. NaCl脅迫對兩種柳樹幼苗生理特性的影響[J]. 東北農業大學學報，2014，45（1）：77-82.

[24]程淑娟，唐東芹，劉群錄，等. 鹽脅迫下的2種素馨屬植物生理特性[J]. 福建林學院學報，2012，32（1）：33-38.

[25]胡曉立，李彥慧，陳東亮，等. 3種李屬彩葉植物對NaCl脅迫的生理響應[J]. 西北植物學報，2010，30（2）：370-376.

[26]鄭容妹. 沿海沙地引種綠竹等竹子的抗鹽抗旱機理研究[D]. 福州：福建農林大學，2003.

[27]姚文靜，王 茹，王 星，等. 3個竹種實生竹苗質量評價研究[J]. 西北林學院學報，2020，35（5）：116-121.