代謝工程改造大腸桿菌合成L-組氨酸

李夢瑩，呂雪芹，劉延峰，李江華，堵國成，吳劍榮，劉龍*

1(江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)2(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

L-組氨酸，又名α-氨基-β-咪唑基丙酸，是分子中含有咪唑核的堿性氨基酸[1]。在營養學的范疇里，組氨酸被認為是嬰幼兒必需的氨基酸[2]。L-組氨酸具有多種生理功能，對生長、組織修復以及治療潰瘍和胃酸過多等均具有重要的作用，還可以作為添加劑用于治療過敏、風濕性關節炎以及貧血等疾病，因此，其被廣泛應用于醫藥食品等行業[3]。

生產組氨酸的方法主要有蛋白水解法、化學合成法和微生物發酵法。其中水解蛋白質是組氨酸生產最為傳統的方法[4]，但是，這種方法主要取決于富含天然蛋白質的資源(如血粉或大豆)的可用性，很難滿足人們對組氨酸日益增長的需求[5]；而通過化學合成法生產組氨酸容易產生外消旋混合物，通常被認為是“非天然”化合物，難以獲得食品藥品監督管理局的批準，也較難被消費者接受[5]；微生物發酵法是目前生產L-組氨酸的主流方法，因此L-組氨酸高產菌的選育成為當前的研究熱點。常用于生產L-組氨酸的微生物主要包括大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)和粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens，S.marcescens)。不少研究者采用誘變結合組氨酸類似物篩選法選育L-組氨酸高產菌株。比如，KINO等[6]以具有1，2，4-三咪唑丙氨酸抗性的突變E.coliATCC21318為出發菌株，經誘變處理后獲得1株組氨酸產量為14.2 g/L的菌株；以C.glutamicum為出發菌株，許益清等[7]通過定向進化選育出1株L-組氨酸為1～1.6 g/L的突變株；侯穎等[8]通過硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)、亞硝基胍(nitroso guanidine，NTG)和紫外(ultra violet，UV)逐級誘變，獲得1株高產L-組氨酸的S.marcescens突變菌株，L-組氨酸產量由最初的2.0 g/L提高到7.6 g/L?；瘜W誘變等非理性設計雖然能篩選出高產菌株，但該方法具有很大的盲目性和隨機性，往往很難獲得穩定的高產菌株[7]。

理性改造手段由于具有目的性強、勞動強度低、效果顯著、菌株穩定性好等優勢，目前已經被廣泛應用[3]。本研究首先對E.coliBL21(DE3)中L-組氨酸操縱子進行改造，解除L-組氨酸對于操縱子前導肽的調控；然后將來源于S.marcescensZJZ626[8]的ATP轉磷酸核糖基酶編碼基因hisG和核糖磷酸二磷酸激酶編碼基因Prs利用CRISPR/Cas9技術整合至基因組，獲得重組菌株B25，解除L-組氨酸對hisG的調控并增強前體物質5-磷酸核糖-1-焦磷酸 (5-phosphoribosy-l-pyrophosphate，PRPP)的合成；最終菌株B25中L-組氨酸的產量由最初的8.5 mg/L增加至5 574.63 mg/L。

1 材料與方法

1.1 宿主和質粒

本實驗所有質粒的構建均在E.coliDH5α中進行，出發菌株為E.coliMG1655和E.coliBL21(DE3)。菌株E.coliDH5α、E.coliMG1655、E.coliBL21(DE3)、S.marcescensZJZ626、C.glutamicumATCC130132，質粒pET28a(+)均為本實驗室保存，質粒pBSG11[9]為周哲敏教授贈送，菌株詳情見表1，質粒詳情見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20201221 005)，引物詳情見附表2。

表1 本文所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 載體構建和菌株獲取

1.2.1 載體構建和菌株獲取

使用附表2中的引物，以E.coliBL21(DE3)、C.glutamicumATCC130132、S.marcescensZJZ626的基因組和pBSG11、pET28a質粒為模板，經PCR擴增分別獲取hisG、hisG(C.glutamicum)、hisG(S.marcescens)序列和相應的線性化質粒，進一步通過Gibson組裝獲取重組質粒pBSG11-hisG和pET28a-hisG、pBSG11-hisG(C.glutamicum)和pET28a-hisG(C.glutamicum)、pBSG11-hisG(S.marcescens)和pET28a-hisG(S.marcescens)。采用類似的方法，獲取重組質粒pBSG11-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q、pBSG11-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q/N215I、pBSG11-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T23Q/N215I、pET28a-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281、pBSG11-hisG(S.marcescens)E271K、pET28-hisG(S.marcescens)E271K、pBSG11-hisGA10T、pBSG11-hisGC149Y、pBSG11-hisGA10T-C149Y-E271K、pET28a-hisGE271K、pET28a-hisGA10T、pET28a-hisGC149Y、pET28a-hisGA10T-C149Y-E271K、pBSG11-Prs、pBSG11-Prs(S.marcescens)。

1.2.2 基因組整合表達的菌株構建

以基因組motA位點整合hisG(S.marcescens)為例，首先以質粒pBSG11-hisG(S.marcescens)為模板擴增hisG(S.marcescens)基因，將Tac啟動子通過上游引物引入到目的基因前，以E.coliBL21(DE3)為模板擴增上下游同源臂。采用融合PCR的方法[10]進行上下游同源臂及目的基因的融合，從而構建整合框。

選擇整合位點motA，通過使用在線網站CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)對sgRNA進行打分及排名，從而獲得合適的sgRNA序列[11]。將位點motA的sgRNA設計為：5′-GCCGCAACAATACCAAACGC-3′，以實驗室保存的pTarget質粒為模板，以pT-motA-F/R為引物進行反向PCR擴增，42 ℃熱激90 s后，轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，單菌落測序正確后，獲得質粒pTarget-motA。

將質粒pTarget-motA及整合框同時按照文獻報道方法[12]轉化至含有pCas質粒的B1中，對測序正確的菌株進行質粒pTarget-mota及pCas9的消除，獲得重組菌株B16。采用上述類似的方法，獲取重組菌株M1、M2、B1、B2、B17、B18、B24、B25。

1.3 搖瓶發酵方法

挑取單菌落接種于2 mL 液體LB培養基(酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L)中，37 ℃、220 r/min過夜培養。按4%(體積分數)將種子液接種于含有15 mL發酵培養基(葡萄糖 40 g/L，酵母粉 2 g/L，(NH4)2SO416 g/L，K2HPO4·3H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·5H2O 0.005 g/L，CaCO330 g/L)的250 mL搖瓶中，30 ℃、220 r/min培養72 h。

1.4 粗酶液制備方法

挑取單菌落接種于含有100 mg/L氨芐霉素的2 mL 液體LB培養基中，37 ℃、220 r/min過夜培養。按4%(體積分數)將種子液接種于含有25 mL TB培養基(酵母粉 24 g/L，胰蛋白胨 12 g/L，K2HPO412.54 g/L，KH2PO42.31 g/L)的250 mL搖瓶中，37 ℃、220 r/min培養至OD600為0.6～0.8，添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，16 ℃過夜誘導培養。將上述誘導結束后的菌液于4 ℃、7 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液收集菌體，用250 mmol/L Tris-HCl(pH 8.1)洗滌2次，稀釋菌體至OD600為8.0，冰水浴超聲破碎后(功率300 W，工作4 s，間歇6 s，10 min)，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液。

1.5 酶活力的測定

hisG酶活力的測定是基于反應產物磷酸核糖三磷酸腺苷(phosphoribosyl adenosine triphosphate，PR-ATP)和隨后產生的磷酸核糖腺苷(phosphoribosyl adenosine monophosphate，PR-AMP)在290 nm處有較高的紫外吸收[13-15]。反應混合物(95 μL)：79 μL反應溶液[Tris 6.07 g/L、KCl 5.59 g/L、MgCl20.48 g/L，另外可根據研究需求加入50～200 mmol/LL-組氨酸、2～16 mmol/L一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、1～5 mmol/L阿卡地新(AICAR)，pH調至8.5]、1 μL 0.2 U/mL焦磷酸酶(pyrophosphatase，PPase)，5 μL 0.2 U/mL ATP，10 μL 0.5 μg/μL粗酶液。將上述反應混合物置于96孔板中，30 ℃溫浴5 min，加入5 μL 10 mmol/L PRPP，用5 μL的水替代PRPP用作空白對照。利用酶標儀測量該體系在290 nm、30 min內每30 s間隔的吸光度[16-17]。每分鐘增加1吸收峰對應100 μL體系中形成0.091 9 μmol PR-ATP[16]。

1.6 檢測方法

發酵液稀釋至合適濃度的范圍后，使用分光光度計測定其OD600值；采用SBA-40E系列生物傳感分析儀測定發酵液中葡萄糖濃度；采用HPLC對發酵液中L-組氨酸濃度進行定量分析，以鄰苯二甲醛進行發酵液柱前衍生，色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測器的檢測波長為338 nm，柱溫40 ℃，進樣量1 μL。具體的梯度洗脫程序如表2所示。

表2 本文梯度洗脫程序Table 2 Gradient eluting procedure used in this study

2 結果與分析

2.1 hisLGDCBHAFI操縱子前導區改造對L-組氨酸合成和細胞生長的影響

E.coli中合成L-組氨酸的途徑酶編碼基因組成1個 操縱子，基因順序為hisLGDCBHAFI。該操縱子受L-組氨酸調控：當L-組氨酸濃度高時，核糖體快速跳過操縱子中hisL編碼的前導肽，在hisL和hisG之間形成終止子，從而阻止轉錄的進行；當L-組氨酸濃度低時，核糖體與hisL基因結合，進行前導肽的合成[3](圖1-a)。為了解除L-組氨酸對操縱子的調控，用人工的開放閱讀框(hisL′-λattB′-trpE)[18-19]分別替換E.coliBL21 (DE3)、E.coliMG1655中的L-組氨酸操縱子的前導區(圖1-b)，得到菌株B1、M1。已知PurR是E.coli中響應嘌呤和嘧啶代謝的調節子，通過影響代謝前體PRPP和代謝中間物AICAR的合成量調控組氨酸代謝[18,20]，因而，為了解除PurR對L-組氨酸代謝的影響，敲除菌株B1、M1中的PurR基因[10,21]，依次得到菌株B2、M2。

ATP轉磷酸核糖激酶(E.coli中由hisG基因編碼)的催化是L-組氨酸合成通路中的第一步反應，也是L-組氨酸合成的限速步驟[16]。有研究發現，將E.coli中ATP轉磷酸核糖激酶的第271位谷氨酸突變為賴氨酸，可以在一定程度上解除L-組氨酸的反饋抑制[18]。因而，將該突變基因插入pBSG11質粒中，獲取重組質粒pBSG11-hisGE271K，并將其分別轉化至菌株E.coliBL21(DE3)、E.coliMG1655、B1、M1、B2、M2 中，得到菌株B3、M3、B4、M4、B5、M5。搖瓶發酵72 h后，結果如圖1-c所示，菌株B4的L-組氨酸產量最高，為872.50 mg/L，是對照菌株B3產量的3.68倍；同時，B4菌株的OD600是B3的0.48倍。上述實驗結果說明，操縱子前導區的改造對L-組氨酸的合成有較明顯的促進效果，因此，接下來的研究中選擇菌株B1為主要研究對象。

a-E.coli L-組氨酸合成路徑；b-替換L-組氨酸操縱子前導肽示意圖；c-不同菌株的L-組氨酸產量和OD600分析圖1 E.coli的L-組氨酸合成途徑及hisLGDCBHAFI操縱子前導區改造對L-組氨酸合成及細胞生長的影響Fig.1 Synthesis pathway of L-histidine in E.coli and effects of hisLGDCBHAFI operon′s leading area modification on L-histidine synthesis and cell growth

2.2 ATP轉磷酸核糖激酶hisG改造對L-組氨酸合成的影響

2.2.1 在B1中表達C.glutamicum來源hisG基因驗證其對L-組氨酸合成的影響

已有研究報道C.glutamicumATCC13032來源的hisG基因可以通過定點突變在一定程度上解除L-組氨酸的反饋抑制，進而提高C.glutamicum中L-組氨酸的產量[16,21]。因此將C.glutamicumATCC13032來源的天然hisG基因(C1)及其突變基因hisGG233H/T235Q(C2)、hisGG233H/T235Q /N215I(C3)、hisGS143F/Δ209-281(C4)插入pBSG11質粒中，獲取重組質粒并將其分別轉化至菌株B1，得到菌株B7、B8、B9、B10。同時，使用載體pBSG11過表達E.coli天然hisG基因(EG)，獲得重組質粒pBSG11-hisG，將其轉化至菌株B1中，獲得對照菌株B6。72 h搖瓶發酵結果顯示，菌株B8的L-組氨酸產量為1 070.79 mg/L，OD600為5.82(圖2-a)。

Ecoli天然hisG基因編碼的ATP轉磷酸核糖激酶，受到L-組氨酸的反饋抑制[22]，AMP[23]、AICAR[24]的競爭性抑制。為了驗證上述5種hisG基因所編碼的ATP轉磷酸核糖激酶在不同濃度抑制劑下的酶活，分別將EG、C1、C2、C3、C4插入表達載體pET28a，獲得重組質粒pET28a-hisG、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q/N215I、pET28a-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281，轉化至E.coliBL21(DE3)中，按照1.5中方法收集胞內上清液并利用SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。如圖2-b所示，5種hisG蛋白均成功表達，其中EG、C1、C2、C3表達量均高于C4。在反應體系中組氨酸濃度達到200 mmol/L時，C2、C3、C4仍能保持>60%的相對酶活力(圖2-c)。在AICAR濃度為0～3 mmol/L時，僅C2酶活力高于對照EG及C1；AICAR濃度達到5 mmol/L時，C1，C2、C3、C4的相對酶活為EG的1.15～1.45倍(圖2-d)。上述5種酶，在反應體系中含有2 mmol/L AMP時，酶活力均下降至20%以下(圖2-e)。

2.2.2 在B1中表達S.marcescens來源hisG基因驗證其對L-組氨酸合成的影響

實驗室存有1株經過誘變篩選后具有組氨酸結構類似物(3-氨基-1，2，4-三氮唑、6-巰基嘌呤、組氨酸甲酯、2-硫尿嘧啶、D-組氨酸)抗性的S.marcescensZJZ625[8]，使用附表2中引物克隆其hisG基因(S1)并進行測序(附表3)，同時對基因S1的271位氨基酸通過PCR進行定點突變，得到hisG(S.marcescens)E271K(S2)。在菌株B1中，使用pBSG11載體過表達上述基因S1、S2，得到菌株B11、B12。72 h搖瓶發酵結果顯示(圖3-a)，菌株B11的L-組氨酸產量達到1 480.42 mg/L，為對照菌株B6的10.86倍，OD600下降至5.57。271位氨基酸的突變雖然未對OD600產生明顯影響，但導致了產量的下降(894.80 mg/L)。

a-過表達C.glutamicum來源hisG菌株的L-組氨酸產量及OD600；b-C.glutamicum來源突變hisG的SDS-PAGE圖 [1-對照，2-pET28a-hisG，3-pET28a-hisG(C.glutamicum)，4-pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H-T235Q，5-pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H-T235Q-215I, 6-pET28a-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281]; c-hisG(C.glutamicum)在不同組氨酸濃度下的相對酶活力；d-hisG(C.glutamicum) 在不同AICAR濃度下的相對酶活力；e-hisG(C.glutamicum)在不同AMP濃度下的相對酶活力圖2 表達C.glutamicum來源hisG對L-組氨酸合成的影響Fig.2 Effect of expression of hisG from C.glutamicum on L-histidine synthesis

分別將S1、S2基因片段插入pET28a載體，獲得重組載體pET28a-hisG(S.marcescens)、pET28a-hisG(S.marcescens)E271K，將其轉化至E.coliBL21(DE3)，低溫誘導蛋白表達后，分析胞內上清液(圖3-b)。在反應體系中含有200 mmol/LL-組氨酸時，S1仍能保持64.57%的相對酶活力(圖3-c)；AICAR濃度在0～5 mmol/L，EG、S1、S2的酶活無明顯差異(圖3-d)；在AMP濃度為2 mmol/L時，S1仍能保持79.77%的相對酶活力(圖3-e)。

2.2.3 改造E.coli的野生型hisG基因并驗證其對L-組氨酸合成的影響

菌株S.marcescensZJZ625誘變前的基因序列未知，為了探究導致L-組氨酸產量提高的有效突變位點，將E.coliBL21(DE3)、S.marcescensSMDB11、S.marcescensZJZ625的hisG基因的氨基酸序列進行比對(圖4-a)，選擇S.marcescensZJZ625的hisG基因中與E.coliBL21(DE3)、S.marcescensSMDB11均不同的氨基酸位點，即為第10位與第149位氨基酸作為目標位點，同時由于已有研究報道271位氨基酸也為有效位點[18]，將E.coli天然hisG的第10、149、271位氨基酸分別進行突變以及3個位點同時突變，得到突變基因hisGA10T(E1)、hisGC149Y(E2)、hisGE271K(E3)、hisGA10T/C149Y/E271K(E4)，將其分別插入PBSG11載體，轉化至菌株B1，獲得菌株B13、B14、B4、B15。搖瓶發酵72 h后，如圖4-b所示，菌株B15的L-組氨酸產量最高(1 148.923 mg/L)，OD600為6.91。在E.coliBL21(DE3)中，使用pET28a載體表達E1、E2、E3、E4基因，低溫誘導E1、E2、E3、E4蛋白表達后，分析胞內上清液(圖4-c)。4種突變基因均在一定程度上解除了L-組氨酸的反饋抑制，在反應體系中含有200 mmol/LL-組氨酸時，仍能保持60%以上的酶活力(圖4-d)，但E4在4 mmol/L AICAR濃度下就失去酶活性 (圖4-e)，同時E4在反應體系中含有12 mmol/L AMP時仍能保持30%以上的酶活力(圖4-f)。

a-過表達S.marcescens來源hisG菌株的L-組氨酸產量及OD600；b-S.marcescens來源突變hisG的SDS-PAGE圖 [1-對照,2-pET28a-hisG,3-pET28a-hisG(S.marcescens),4-pET28a-hisG(S.marcescens)E271K]; c-hisG(S.marcescens)在不同組氨酸濃度下的相對酶活力；d-hisG(S.marcescens)在不同AICAR濃度下的相對酶活力；e-hisG(S.marcescens) 在不同AMP濃度下的相對酶活力圖3 表達S.marcescens來源hisG對L-組氨酸合成的影響Fig.3 Effect of expression of hisG from S.marcescens on L-histidine synthesis

2.3 基因組整合hisG基因對L-組氨酸合成和細胞生長的影響

基于上述菌株B11的L-組氨酸產量最高，并在200 mmol/LL-組氨酸、5 mmol/L AICAR、2 mmol/L AMP濃度下均能保持較高酶活力。通過Crisper-Cas9技術在菌株B1的mota[25]、chew[25]、poxb[26]位點依次進行了hisG(S.marcescens)基因的整合，獲得了菌株B16、B17、B18。如圖5所示，菌株B17產量為861.78 mg/L，為菌株B16的1.31倍；但菌株B18產量提高不明顯，OD600值也未發生明顯變化。因此，推測前體物質供應不足限制了L-組氨酸的生產。

圖5 基因組整合S.marcescens來源hisG對 L-組氨酸合成及細胞生長的影響Fig.5 Effects of genomic integration of hisG from S.marcescens on L-histidine synthesis and cell growth

2.4 前體供應關鍵基因Prs對L-組氨酸合成的影響

核酮糖-5-磷酸(ribulose-5-phosphate，R5P)經過磷酸核糖焦磷酸合成酶(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase，Prs)的催化生成L-組氨酸合成的前體物質PRPP[21]。為了增強前體物質PRPP的供應，在菌株B16、B17、B18中使用pBSG11載體過表達Prs基因，獲得菌株B19、B20、B21。搖瓶發酵72 h后，菌株B21產量達到2 119.28 mg/L，OD600達到9.83(圖6-a)。

為了驗證過表達S.marcescensZJZ625來源的Prs基因(附表4)對L-組氨酸合成的影響，構建重組質粒PBSG11-Prs(S.marcescens)，轉化至產量較高的菌株B20和B21，得到菌株B22、B23。72 h 搖瓶發酵結果顯示，過表達Prs(S.marcescens)比過表達E.coli的野生型Prs提高L-組氨酸產量效果更好，其中菌株B23的L-組氨酸產量提高至2 778.26 mg/L(圖6-b)。

將Prs(S.marcescens)在菌株B18的ylbG[27]、recA[27]位點依次進行基因組整合，得到菌株B24、B25。菌株B25搖瓶發酵72 h后，產量達到3 898.06 mg/L，是菌株B23的1.40倍(圖6-c)。若繼續延長發酵時間至96 h，菌株B24(OD600=6.45)、菌株B25(OD600=4.81)的L-組氨酸產量分別提高至5 040.69、5 574.63 mg/L，菌株B25 96 h消耗葡萄糖總量為72 h消耗葡萄糖量的1.24倍(圖6-d)。

a-E. coli BL21 (DE3)、S. marcescens ZJZ626和S. marcescens SMD11的hisG氨基酸序列對比圖；b-過表達E. coli 來源hisG菌株的L-組氨酸產量及OD600；c-E. coli來源突變hisG的SDS-PAGE圖(1-對照,2-pET28a-hisG, 3-pET28a-hisGA10T,4-pET28a-hisGC149Y,5-pET28a-hisGE271K,6-pET28a-hisGA10T/C149Y/E271K); d-hisG在不同組氨酸濃度下的相對酶活力；e-hisG在不同AICAR濃度下的相對酶活力；f-hisG在不同AMP濃度下的相對酶活力圖4 改造E.coli來源hisG對L-組氨酸合成的影響Fig.4 Effect of expression of hisG from E.coli on L-histidine synthesis

3 結論

L-組氨酸合成路徑較長，通過誘變單一地選育結構類似物抗性突變株并不會完全打通菌體內合成L-組氨酸的代謝途徑。本研究利用代謝工程思路對E.coliL-組氨酸合成的代謝途徑進行了改造，構建無質粒高產大腸桿菌。首先通過CRISPR/Cas9技術對組氨酸操縱子前導肽進行替換，解除了L-組氨酸對操縱子轉錄的調控。組氨酸合成途徑中的第一個酶(hisG)會受到L-組氨酸的反饋抑制以及AMP、AICAR的競爭性抑制，因此我們分析了表達C.glutamicum、S.marcescens、E.coli來源的不同hisG對L-組氨酸產量及細胞生長的影響，同時分析了hisG基因所編碼的ATP轉磷酸核糖激酶在不同濃度L-組氨酸、AMP、AICAR時的酶活力，最終選擇了對提高L-組氨酸產量效果最好，同時對3種抑制物均有較高耐受濃度的hisG(S.marcescens)進行基因組整合，整合3個拷貝hisG(S.marcescens)的菌株B18L-組氨酸產量提高至905.32 mg/L。在實驗過程中發現，菌株B18相對于基因組整合2個拷貝hisG(S.marcescens)的菌株B17產量提升并不明顯，推測前體物質供應不足限制了L-組氨酸的生成。所以嘗試過表達控制前體PRPP合成的基因Prs，產量提高至2 119.28 mg/L。接著又比較了S.marcescens來源的Prs對L-組氨酸產

a-在不同菌株中表達PBSG11-Prs質粒對L-組氨酸生產及細胞生長的影響；b-表達不同來源Prs對L-組氨酸生產及細胞生長的影響； c-不同拷貝數的Prs(S.marcescens)對L-組氨酸生產及細胞生長的影響；d-不同發酵時間對L-組氨酸生產、耗糖量及細胞生長的影響圖6 提高PRPP的合成對L-組氨酸產量及OD600的影響Fig.6 Effect of increasing PRPP synthesis on L-histidine titer and OD600

量的影響，發現其產量為過表達E.coli天然Prs菌株的1.31倍，將Prs(S.marcescens)進行2個拷貝的基因組整合后，獲得重組菌株B25，搖瓶發酵72 hL-組氨酸產量提高至3 898.06 mg/L，96 hL-組氨酸產量達到5 574.63 mg/L。該研究為實現更經濟的L-組氨酸工業生產奠定了基礎。