基于腸道菌群介導的炎性反應研究黃芪多糖對結腸炎相關癌癥的作用

劉雷蕾 馬淑然

摘要 目的：探討黃芪多糖（APS）對結腸炎相關癌（CAC）小鼠和結腸癌細胞中腸道細菌誘導的Toll樣受體-4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）信號通路的影響。方法：將40只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為對照組（n=10），模型組（n=15）和APS組（n=15）。模型組和APS組由氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉制成CAC模型。對照組和模型組給予0.9%氯化鈉注射液，APS組給予100 mg/kg APS灌胃14 d。動物研究中，通過HE染色方法檢測小鼠中結腸直腸的病理狀況;通過16S rDNA測序分析腸道菌群的特征;通過酶聯免疫吸附試驗測定脂多糖濃度;免疫組化法檢測結腸組織中TLR4和NF-κBp65蛋白的表達。體外研究中，進一步驗證了APS對人結腸癌細胞增殖和遷移的影響，運用MTT測定和劃痕實驗用于評估細胞活力測定;通過免疫熒光檢測NF-κBp65的核轉位;Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達。結果：測序結果表明，模型組以革蘭氏陰性菌擬桿菌屬為主，APS組腸道菌群多為革蘭氏陽性菌乳球菌屬和雙歧桿菌屬;APS組LPS、TLR4和NF-κBp65蛋白的表達水平明顯低于模型組;APS可以抑制LoVo細胞和HCT116細胞的增殖和遷移能力;APS（40 μg/mL）可抑制NF-κB的核轉位，降低N-cadherin蛋白的表達，增加E-cadherin蛋白的表達。結論：APS通過抑制革蘭氏陰性病原體，減少LPS的釋放，抑制TLR4/NF-κB信號通路，阻止CAC的發生，且APS可有效抑制人結腸癌細胞的EMT過程，有效控制腫瘤的增殖和遷移。

關鍵詞 結直腸癌;腸道菌群;脂多糖;黃芪多糖;核因子κB

Study on the Mechanism of Astragalus Polysaccharide on Colitis-Related Cancer Based

on the Inflammatory Response Mediated By Intestinal Flora

LIU Leilei，MA Shuran

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 10029，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Astragalus polysaccharide（APS）on intestinal bacteria induced Toll-like reeeptor-4 / nuclear factor-κB（TLR4/NF-κB）signaling pathway in colitis-associated cancer（CAC）mice and colon cancer cells.Methods：A total of 40 C57BL/6J male mice were randomLy divided into a control group（10 mice），a model group（15 mice），and an APS group（15 mice）.The model group and APS group were made CAC model by azoxymethane and sodium dextran sulfate.The control group and model group were given 0.9% sodium chloride injection，and the APS group was given 100 mg/kg APS by gavage for 14 days.In this study，the Histopathological Examination method was used to detect the pathological conditions of colorectal in mice.Characteristics of intestinal flora were analyzed by 16S rDNA sequencing.Lipopolysaccharide concentrations were determined by enzyme 1inked immunosorbent assay.Expressions of TLR4 and NF-κB p65 proteins in colon tissue were detected by immunohistochemistry.In the in vitro study，we further validated the effects of APS on proliferation and migration of human colon cancer cells.The MTT assay and Scratch test were used to evaluate cell viability assays.The nuclear translocation of NF-κB p65 was detected by immunofluorescence.Western blot was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin proteins.Results：Sequencing results showed that Gram-negative bacteria（Bacteroides）were commonly detected in the model group，and intestinal flora in APS group were mostly Gram-positive bacteria（Lactococcus and Bifidobacterium）.Expression levels of LPS，TLR4，and NF-κB p65 proteins in APS group were significantly lower than those in the model group.APS can inhibit the proliferation and migration of LoVo cells and HCT116 cells; APS（40 μg/mL）can inhibit the nuclear translocation of NF-κB，reduce the expression of N-cadherin protein，and increase the expression of E-cadherin protein.Conclusion：APS can prevent CAC by inhibiting Gram-negative pathogens，reducing the release of LPS and inhibiting TLR4/NF-κB signaling pathway.And APS can effectively inhibit the EMT process of human colon cancer cells and effectively control tumor proliferation and migration.

Keywords Colorectal carcinoma; Intestinal flora; Lipopolysaccharide; Astragalus polysaccharide; Nuclear factor κB

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.008

最新全球癌癥統計數據《全球癌癥報告》顯示2018年結腸直腸癌（Colorectal Carcinoma，CRC）新增180萬例患者，占比10.2%，位居癌癥發病率的排行榜第3名。從死亡病例數字來看，結腸癌死亡率僅次于肺癌，位居第2，有88.1萬人死于結直腸癌，占比9.2%[1]。最近10年來，伴隨著飲食、肥胖和生活方式的改變，中國CRC的發病率和死亡率呈現上升趨勢[2]。目前對結直腸癌的治療主要是通過手術、放化療以及免疫治療等手段，然而仍有將近40%～50%的CRC患者在確診后5年內死亡[3]。最新臨床研究顯示，在用抑制負性免疫調節治療癌癥的藥物PD-1或PD-L1治療時，部分患者對藥物反應降低，主要因為患者存在腸道菌群失調情況，需要治療時配合調節腸道菌群才能提高藥物應答率[4]。因此，促使我們尋求有效的輔助治療辦法，以改善CRC的治療。

目前一些中藥已經被證實具有多靶點，多通道，低不良反應，延長生存期，減輕疼痛，改善生命質量的廣譜抗腫瘤作用。例如由黃芪和女貞子（2∶1，w/w）組成的貞芪扶正膠囊常作為外科手術的輔助用藥，以提高免疫力，促進癌癥患者免疫功能的恢復[5]。藥理研究表明，黃芪水提取物具有多種生物學功能。黃芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS）是黃芪的主要成分，在控制炎性反應和氧化應激，維持和調節腸內穩態中起到關鍵作用[6]。APS已被廣泛用于抑制腫瘤生長，細胞侵襲和血管生成，以及誘導細胞凋亡的研究中[7]。APS可以調節Wnt，p53和NF-κB各種癌癥信號通路，并與特定的轉錄分子相互作用，發揮抗腫瘤作用[8]。在臨床聯合治療中，APS聯合鼻咽癌一線化療藥順鉑可通過調節Bax/Bcl-2比值和半胱天冬酶增強鼻咽癌細胞的化療敏感性[9]。

長期存在的慢性炎性反應是炎性反應性腸病中結直腸癌的關鍵誘發因素，由炎性反應性腸病發展成的結直腸癌叫作結腸炎相關癌癥（Colitis-associated Cancer，CAC）。在CRC中CAC占到15%～20%的比例[10]。在CAC進展中，包括NF-κB，IL-6/STAT3，COX-2/PGE2和IL-23/Th17在內的多種促炎途徑被激活，通過誘導產生炎性反應遞質而促進腫瘤發生，上調抗細胞凋亡基因的表達，刺激腫瘤細胞增殖以及血管生成[11]。作為腸黏膜生物屏障的重要組成，腸道菌群與受損腸道黏膜之間的相互作用同樣在CAC的發生和發展中起到了重要作用[12]。上皮間充質轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）是一種上皮細胞失去上皮特性而獲得間質細胞表型的生物學過程，主要與細胞間的黏附中斷、細胞極性喪失和細胞離散導致的惡性腫瘤的侵襲和轉移相關[13]。腫瘤微環境可促使癌細胞之間相互作用，通過自分泌和/或旁分泌生長因子、細胞因子和細胞外基質蛋白等誘導EMT的發生[14]。EMT的發生受多種信號通路和細胞因子的調控，其中NF-κB信號通路對腫瘤細胞發生EMT有重要影響。

因此，我們假設天然藥物APS可通過調節腸道菌群，抑制菌群介導的炎性反應和EMT，而發揮抗癌作用。在目前的工作中，為了檢驗這個假設，我們建立了AOM/DSS誘導的CAC小鼠模型，并證明了APS在調節腸道菌群和抑制炎性反應方面有積極作用。同時，APS在體外抗腫瘤活性檢測中，已被證實具有抗人結腸癌細胞LoVo增殖和遷移的作用，且對EMT的發生有抑制作用。我們的發現表明APS具有治療CAC的潛力并就其可能的機制提供新的有用線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 人結腸癌細胞LoVo細胞和HCT116細胞，購自美國模式培養物研究所（American Type Culture Collection，ATCC）。所有細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的RPMI1640完全培養液于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養，24 h貼壁后更換新的培養液，繼續培養，隔日換液，待細胞鋪滿培養瓶底面積的90%時進行傳代。SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，6周齡，18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2014-0004;飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所，飼養環境為SPF級[溫度（20±2）℃，相對濕度60%，氣流速度≤0.18 m/s]。

1.1.2 藥物 黃芪多糖（上海吉至生化科技有限公司，貨號：C54200-25 g）

1.1.3 試劑與儀器 青霉素-鏈霉素雙抗溶液（HyClone公司，美國，貨號：SV30010）;胎牛血清（HyClone公司，美國，貨號：SV30087.01）;RPMI1640培基（HyClone公司，美國，貨號：SH30203.05）;氧化偶氮甲烷AOM（sigma公司，美國，貨號：A5486）;葡聚糖硫酸鈉DSS（MP公司，美國，貨號：02160110-CF）;E.Z.N.A. Stool DNA Kit（Omega公司，美國，貨號：M4015-02）;小鼠脂多糖ELISA試劑盒（天津貝爾格萊科技有限公司，貨號：A-2631）;小鼠NF-κB抗體（CST公司，美國，貨號：6956）;小鼠TLR4抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1717）;小鼠E-cadherin抗體（CST公司，美國，貨號：14472）;小鼠N-cadherin抗體（CST公司，美國，貨號：14215）;DyLight488-羊抗兔IgG熒光二抗（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1127）;光學顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：BX51T-PHD-J11）;離心機（Eppendorf公司，德國，型號：5430）;菌群測序平臺（北京諾禾致源科技股份有限公司，型號：HiSeq2500 PE250）;多功能板讀板機（Thermo公司，德國，型號：Multiskan FC）;凝膠成像系統（Bio Rad公司，美國，型號：MP5000）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 CAC小鼠模型采用AOM聯合DSS周期性誘導建模法（圖1A）。本次實驗共分為3組，共計40只小鼠，空白組（n=10），模型組（n=15）和觀察組（n=15）。除空白組外，其余小鼠先予10 mg/kg的AOM腹腔注射，再以蒸餾水和普通飼料喂養1周，第2周將飲水換為濃度2%的DSS溶液自由飲用，第3、4周撤去DSS溶液，仍恢復蒸餾水喂養;如此1周DSS加2周蒸餾水喂養為1個致炎周期，總共重復3個致炎周期完成建模。

1.2.2 給藥方法 根據人與小鼠之間藥物劑量換算方法，觀察組組小鼠以100 mg/kg的黃芪多糖APS灌胃。模型組和空白組予以0.2 mL生理鹽水灌胃。連續灌胃給藥14 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 組織病理學評價 治療結束后處死全部小鼠，取結腸組織并固定于中性福爾馬林液中，固定24 h以后，執行常規脫水及石蠟包埋，使用石蠟切片機4 μm切片。將待染色的切片于65 ℃烘箱中放置0.5 h后，常規HE染色，用適當濃度的中性樹膠封片，用于顯微鏡拍攝分析。根據結腸標本組織學病變評分標準[15-17]進行光鏡下評價。見表1。

1.2.3.2 腸道菌群基因測序 取100 mg糞便樣本加入2 mL離心管中，按照E.Z.N.A.TMStool DNA Kit操作步驟進行提取，得到純化的基因組DNA后，釆用紫外分光光度計分別檢測總DNA在260 nm和280 nm兩處的吸光度，觀測總DNA的濃度和OD 260/OD280的比值。純化的基因組存放-20 ℃保存待測。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2.3.3 酶聯免疫吸附試驗檢測血清LPS濃度?? 治療結束后首先用10%水合氯醛麻醉劑麻醉小鼠，隨后從小鼠眼眶采取全血，室溫自然凝固10 min，用低溫高速離心機以4 ℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，提取上清液，按照ELISA試劑盒操作規程測定血清LPS水平。圖3A展示了本次檢測的標準曲線及計算方程，R2=0.981 9提示線性良好。

1.2.3.4 免疫組織化學染色檢測TLR4和NF-κB蛋白表達 實驗束后解剖小鼠腹腔，于距肛門2.5 cm處取0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm結腸組織塊浸泡于中性甲醛溶液中固定。結腸組織脫水和包埋后切片。把切片后的組織放入1%甲醇雙氧水中，室溫浸泡10 min后洗凈，再用pH為6.0的0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液浸泡。山羊血清室溫封閉20 min。一抗TLR4（1∶200）和NF-κB p65（1∶100）4 ℃孵育過夜。PBS洗凈后滴加二抗IgG（1∶200）37 ℃孵育20 min。加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育20 min。使用二氨基聯苯胺（DAB）顯色，用蘇木素復染細胞核1 min后在光學顯微鏡下觀察。按照免疫組化染色評分標準[18]評分。見表2。

1.2.3.5 細胞活力檢測 分別取對數生長期的LoVo細胞和HCT116細胞，于96孔板上每孔加入200 μL 2.5×104個/mL的細胞。待細胞貼壁后，棄去舊培養液，每孔分別加入200 μL用RPMI 1640培基配制的160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL和5 μg/mL濃度的APS溶液和終濃度為1 μg/mL LPS，空白對照組加200 μL的RPMI1640培基。分別于加藥干預24 h、48 h和72 h后棄去培養液，加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，置于細胞培養箱中孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，避光搖勻后放入多功能酶標儀測定溶液在570 nm處的吸光度，得到OD值，計算細胞增殖抑制率。取對數生長期的LoVo細胞和HCT116細胞，消化后離心，以完全培養基重懸細胞，以2×105個/mL的濃度，每孔2.5 mL接種于六孔板中，待細胞鋪滿孔底后，用槍頭沿著直尺垂直于六孔板劃痕。繼續加藥培養24 h和48 h，觀察80 μg/mL的APS對HCT116細胞轉移的影響，以及40 μg/mL的APS對LoVo細胞遷移的影響。

1.2.3.6 細胞免疫熒光檢測NF-κB p65分布 將對數生長期的LoVo細胞種于六孔板并分組。加40 μg/mL的APS干預48 h后吸去培基，每孔加入2 mL的4%多聚甲醛固定15 min，吸除多聚甲醛，每孔加入1 mL 0.1%TritonX-100室溫通透5 min，再用PBS清洗3次，每孔加入1 mL 3%BSA室溫封閉30 min，棄去封閉液，每孔加入適量用3%BSA稀釋過的NF-Κb p65抗體（1∶500），置于冰上搖勻后存放于4 ℃冰箱過夜，孵育一抗。從冰箱中取出后于37 ℃恒溫箱中復溫45 min，用PBS清洗3次，每孔加入用1%BSA稀釋過的DyLight488-羊抗兔IgG熒光二抗（1∶400），室溫避光孵育1 h。于暗處吸除二抗，以PBS洗滌3次，每孔加入1 mL細胞核染液DAPI（5 μg/mL），室溫孵育，吸除DAPI后，加入1滴（50 μL）的抗熒光淬滅封片液，于熒光顯微鏡下觀察NF-κB p65在細胞質和細胞核中的分布。

1.2.3.7 蛋白質印跡分析檢測NF-κB、E-cad、N-cad蛋白表達 將對數生長期的LoVo細胞種于六孔板并分組。加40 μg/mL的APS干預48 h后吸去培基，加入300 μL預冷的RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制劑PMSF），充分裂解后，13 000×g 4 ℃離心10 min，取上清液即蛋白提取物。按照BCA試劑盒說明測定蛋白濃度。來自每個樣品的20 μg蛋白質通過8%的SDS-PAGE電泳分離膠，并轉移到PVDF膜上。在室溫下用含5%BSA的TBST（0.1%）封閉2 h，將PVDF膜與一抗（NF-κB p65 1∶1 000;E-cad 1∶1 000;N-cad 1∶1 000;β-Actin 1∶500）在4 ℃下孵育過夜。取出PVDF膜，用TBST沖洗3次，5 min/次。之后加入相應的二抗（用5%的BSA按照1∶10 000稀釋），置于搖床上室溫孵育1.5 h，結束后用TBST沖洗PVDF膜5次，于凝膠成像系統，曝光成像，導出條帶圖片，采用Image J軟件分析條帶的灰度值，計算出不同條帶的相對灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的數據采用均數±標準差（±s）表示，2組間分析用Unpaired T test，多組間分析用one-way ANOVA分析。不符合正太分布的數據采用中位數（percent25，percent75）和平均秩進行統計描述，用Mann-Whitney檢驗分析不同組之間的差異性。所有檢驗均以雙側檢驗為顯著性水準，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APS改善了CAC模型鼠健康狀況和生存指數? 空白組小鼠在整個造模期以及后續治療期皆表現出良好的生長狀態，體質量穩定增長，糞便情況正常。在AOM/DSS造模過程中，小鼠在DSS致炎刺激后表現出明顯的體質量下降，活動狀態減緩，部分小鼠出現稀便或便血;在停止DSS刺激后的雙蒸水喂養階段，小鼠體質量逐漸恢復增長，便血減少;經過反復的致炎刺激小鼠最終體質量降為（17.83±0.86）g。見圖1B。在整個治療期（第11、12周），模型組小鼠精神狀態萎靡，便質稀，毛發雜亂，活動少，進食和飲水相對較少，治療終點體質量維持在（18.02±2.05）g。觀察組小鼠表現出較好的活動和精神狀態，進食和飲水相對增加，稀便減少，治療終點體質量恢復到（24.05±2.74）g，明顯高于模型組（P<0.01）。根據Log-rank（Mantel-Cox）存活曲線。見圖1C。從第11周到實驗結束，APS的治療提高了經AOM/DSS造模處理的小鼠的存活率（P<0.05）。此外，經AOM/DSS刺激后，模型組與空白組比較，結腸長度明顯縮短（P<0.01）。與模型組比較，觀察組的結腸長度明顯增長（P<0.01），提示APS能夠緩解由DSS致炎刺激導致的結腸短縮。見圖1D。

2.2 APS減少結腸腫瘤和改善非典型增生 實驗結束后縱向剖開結腸，統計分析各組小鼠結腸腫瘤個數和腫瘤大小差異。腫瘤大小以Load值表示，即單只小鼠全部腫瘤的長徑乘短徑之和。AOM/DSS周期性誘導小鼠形成結腸腫瘤的發病率為100%。如圖2A所示，模型組小鼠結腸腫瘤個數為（13.50±3.10）個。見圖2B。模型組單只小鼠腫瘤大小Load值為（50.17±22.84）mm2。治療結束后，觀察組腫瘤個數為（4.33±1.63）個，Load值為（19.00±28.32）mm2。APS（100 mg/kg）雖然沒有阻止腫瘤的發生，但是明顯降低了腫瘤個數（P<0.01）和大?。≒<0.05）。HE染色病理結果圖2E可見，空白組腸黏膜各層結構清晰，形態正常，局部黏膜下層未見增生和腫瘤。模型組腸黏膜各層結構欠清晰，可見重度異型增生，細胞異型性明顯，層次增多，極像紊亂，腺管結構紊亂，部分腺體有融合，異型腺體限于黏膜層，全部隱窩缺損，廣泛的粒細胞分布伴顯著浸潤。觀察組腸黏膜各層結構清晰，腸絨毛形態欠規整，可見低或中度異型增生。圖2C描述了各組非典型增生評分情況。模型組結腸組織非典型增生評分中位數為3，percent25為2.75，percent75為3，與空白組比較顯著增高（P<0.01）。觀察組腸組織非典型增生評分中位數為1，percent25為1，percent75為2，與模型組比較明顯降低（P<0.01）。

2.3 APS抑制CAC小鼠腸道炎性反應 病理結果見圖2E（HE染色，×400），空白組腸黏膜未見明顯炎性細胞浸潤。模型組全部隱窩缺損，廣泛的粒細胞分布伴顯著浸潤，炎性反應評分中位數為4，percent25為3，percent75為4。經APS治療后，結腸組織中部分隱窩缺損，偶有粒細胞浸潤，呈輕度炎性反應，炎性反應評分中位數為1.5，percent25為1，percent75為2，與模型組比較明顯降低（P<0.01）。見圖2D。實驗進一步用ELISA法檢測了各組小鼠血清中致炎物質LPS的濃度。見圖3B?？瞻捉M小鼠血清LPS濃度為（9.25±1.30）U/L，模型組LPS平均水平為（18.99±2.86）U/L，顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，APS治療后LPS平均水平為（8.99±1.44）U/L，顯著降低（P<0.01）。

研究已經證實在CAC發展中，腸道微生物屏障損傷，菌群移位，腫瘤細胞表達的TLR4可感知到革蘭氏陰性菌裂解后釋放出的內毒素LPS，進而向下通過激活MyD88/TRAF6通路活化NF-κB，進一步擴大炎性反應[19]。本研究在接下來的實驗中，用免疫組化的方法檢測了各組小鼠結腸組織中TLR4蛋白（圖3C）和NF-κB p65蛋白（圖3D）的表達情況?？瞻捉MTLR4蛋白和NF-κB p65蛋白著色淺棕色呈弱陽性，IHS評分為（1.17±0.75）分和（1.00±0.63）分。與空白組比較，模型組TLR4和NF-κB p65的IHS評分為（12.83±2.71）分和（9.33±2.34）分，蛋白著色呈深棕色或棕褐色，表達水平顯著提高（P<0.01）。與模型組比較，觀察組TLR4和NF-κB p65的IHS評分為（3.67±2.07）分和（3.83±2.04）分，蛋白著色呈淺棕色，表達水平降低（P<0.05）。見圖3E。

2.4 APS改善CAC小鼠腸道菌群 本研究以97%的一致性將測序所得序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），并對OTUs的代表序列進行物種注釋。圖4A中，物種累積箱形圖（Species Accumulation Boxplot）描述了隨著樣本量的增加物種多樣性增加的分析，提示此環境中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多。如圖4B所示，用shannon指數反映樣品內的微生物群落的多樣性，并通過組間比較發現模型組shannon指數為（5.40±0.25）低于空白組（6.35±0.27）（P<0.05），經APS處理后，shannon指數升高到（6.09±0.32），高于模型組（P<0.05）。提示APS可以改善菌群多樣性。

根據屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前25的菌屬，根據其在每個組中的豐度信息，從物種和分組2個層面進行聚類，繪制出熱圖。如圖4C所示，空白組以Akkermansia、Alloprevotella、Allobaculum、Desulfovibrio和Lachnospiraceae為主。而模型組中Bacteroides、Erysipelatoclostridium和Prevotellaceae聚集較多，Akkermansia、Alloprevotella、Allobaculum和Lachnospiraceae的含量較低。經APS處理后，Lactococcus、Parasutterella、Bifidobacterium和Lachnospiraceae聚集較多。為了尋找Species分類水平，3組樣本之間優勢物種的差異，選取種分類水平上平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖[20]，可以直觀看出模型組優勢物種為Bacteroides_acidifaciens，空白組優勢物種為Helicobacter_ganmani，觀察組優勢物種為Lactobacillus_animalis和Lactococcus_piscium（圖4D）。研究進一步用LEfSe分析組與組之間差異有統計學意義Biomarker[21]，即組間差異顯著的物種。如圖4E所示，空白組和模型組比較，模型組的Biomarker為Bacteroides和Prevotellaceae;空白組的Biomarker為Alloprevotella和Allobaculum。如圖4F所示，模型組和APS組比較，模型組的Biomarker為Bacteroidales_bacterium_ph8。

2.5 APS抑制LoVo細胞和HCT116細胞增殖和遷移 研究已經證實1 μg/mL LPS作用48 h時可明顯促進結腸癌細胞LoVo和HCT116的增殖。本研究先用LPS（1 μg/mL）刺激結腸癌細胞LoVo和HCT116，再給予不同濃度APS干預，用MTT測定法測定了APS對這2種細胞活力的影響。如圖5A，B所示，160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL和5 μg/mL濃度的APS對結腸癌細胞LoVo和HCT116有不同的抑制作用，其中40 μg/mL的APS對LoVo細胞的抑制作用明顯，濃度80 μg/mL的APS對HCT116抑制作用明顯。這些發現表明，適宜濃度的APS可以抑制CRC細胞增殖。

本研究還通過劃痕實驗證實了40 μg/mL的APS作用于LoVo細胞48 h可以抑制其遷移能力，而80 μg/mL的APS作用于HCT116細胞48 h也可以抑制其遷移能力。如圖5C，D所示，LPS（1 μg/mL）刺激結腸癌LoVo細胞和HCT116細胞24 h和48 h后皆明顯增強了腫瘤細胞的增殖和遷移能力，在加入適宜濃度APS后，劃痕面積未見明顯縮小，證實APS對結腸癌LoVo細胞和HCT116細胞的遷移能力有抑制作用。

2.6 APS抑制LPS誘導的LoVo細胞NF-κB p65核轉位 已經有同類研究證實LPS可經TLR4/NF-κb信號通路活化NF-κB[22]。實驗利用免疫熒光法直觀地觀察到APS對NF-κB p65的影響。見圖6。NF-κB p65在LoVo細胞中呈現出低表達。LPS（1 μg/mL）刺激結腸癌LoVo細胞48 h后，NF-κB p65在LoVo細胞的細胞核和細胞質中表達皆升高。再予以40 μg/mL的APS處理后，NF-κB p65在細胞中的表達減少，且主要集中在細胞質中，入核情況減少，說明APS可以抑制NF-κB的活化。本研究還用WB的方法檢測了細胞中總NF-κB p65蛋白的含量，相對于空白組而言，LPS處理的模型組細胞中NF-κB p65蛋白灰度值有所升高（1.25±0.49），而經APS（40 μg/mL）處理后，灰度值明顯下降（0.63±0.17）（P<0.01）。見圖7。

2.7 APS抑制LPS誘導的LoVo細胞EMT 研究表明NF-κB激活后進入細胞核后可與特定基因結合，抑制E-cadherin（E-cad）的表達，促進N-cadherin（N-cad）的表達，從而促使EMT發生[23]。本研究進一步用WB的方法測定了EMT發生的相關蛋白E-cadherin和N-cadherin的相對灰度值。見圖7。觀察組相對空白組的E-cadherin蛋白表達量為（1.39±0.22），顯著高于模型組（0.54±0.15）（P<0.01）。觀察組相對空白組的N-cadherin蛋白表達量為（0.62±0.16），顯著低于模型組（1.76±0.73）（P<0.01）。這樣的結果說明APS（40 μg/mL）可以通過抑制NF-κB活化，減少N-cadherin蛋白的表達，增加E-cadherin蛋白的表達，而達到抑制腫瘤細胞遷移的效果。

3 討論

由腸道炎性反應，到不典型增生，再到癌變的途徑是目前比較公認的結直腸癌發生發展的病理進程[24]。本研究建立的AOM/DSS模型[25]，即是將腸上皮細胞暴露于慢性炎性反應環境中，造成細胞中各種突變接連發生累積，并且在長期的炎性刺激中產生免疫耐受，逃脫免疫清除，發生隱窩細胞增生，進而使結腸上皮發生瘤變，最終導致腫瘤形成。在這一過程初期，腸黏膜屏障損傷，菌群移位，致病物質造成的炎性刺激可使免疫細胞如巨噬細胞被募集到病灶處，并分泌細胞因子，發揮抗感染作用和修復受損組織作用[26]。但在菌群失調持續存在的情況下，腸黏膜長期被炎性因子和趨化因子包圍，形成炎性微環境，進一步導致抗感染-修復平衡失衡，激活了腸上皮細胞原癌基因，最終導致惡化[27]。本研究造模結束后小鼠呈現出消瘦、精神萎靡、毛發雜亂無光澤以及活動度差等一般表現。解剖后發現于結直腸縮短，且遠端出現明顯腫瘤，成瘤率100%。經HE染色病理提示細胞異型性明顯，層次增多，極像紊亂，腺管結構紊亂，部分腺體有融合，異型腺體限于黏膜層，伴有廣泛的炎性細胞浸潤，符合結直腸癌病理評判標準。且進一步檢測模型小鼠血清中LPS水平，2倍高于正常小鼠血清LPS濃度。LPS可以繼續擴大炎性反應程度，加速腫瘤的形成和發展，符合實驗需求。

炎性反應與腫瘤的發生發展之間還需要借助腫瘤微環境中的細胞因子和轉錄因子產生一些促癌因子，誘導細胞增殖和存活因子的生成，從而促進腫瘤發生發展。LPS可由腸道中革蘭氏陰性菌裂解死亡后釋放出來。也就是說在CAC模型鼠中血清LPS的升高與腸道中革蘭氏陰性菌裂解死亡相關[28]。本研究通過菌群測序發現CAC模型小鼠腸道菌群豐度與正常小鼠比較明顯減小，結構多樣性和復雜性降低。在菌屬水平，CAC小鼠腸道中擬桿菌屬所占比例最大。擬桿菌屬是一類革蘭氏染色呈陰性、無芽孢、專性厭氧的小桿菌。擬桿菌正常寄居于人和動物的腸道、口腔、上呼吸道和生殖道。因長期應用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等，而使機體免疫功能紊亂或菌群失調時，能導致內源性感染。比較重要的擬桿菌包括脆弱擬桿菌和產黑色素擬桿菌。脆弱擬桿菌主要存在于腸道，比腸內的大腸桿菌多100～1 000倍，在臨床標本中，為闌尾炎和敗血癥的常見菌。Dejea C M等[29]研究發現脆弱擬桿菌還可以和一種大腸桿菌psk+Escherichia coli通過相互作用形成一種生物膜，進而損壞結腸黏膜，引發結直腸癌。

革蘭氏陰性菌細胞壁主成分LPS可與TLR4結合形成復合物。這個復合物會激活MyD88/TRAF6信號通路[30]，進而使IκB蛋白的上游激酶IKK復合物磷酸化激活。被激活的IKK可磷酸化下游的IκB-α。IκB-α是NF-κB抑制蛋白，被磷酸化后又可發生泛素化而降解，從而釋放出NF-κB p65/p50二聚體。沒有了IκB-α的束縛，p50會拽著NF-κB p65入核。NF-κB p65可識別特定的DNA序列，并與之結合，調控靶基因而發揮生物學效應[31]。研究指出在CAC小鼠模型中，敲除上皮細胞中的特異性IκB激酶β（Inhibitor of Nuclear Factor κ-βkinase，IKK-β），干預NF-κB激活的經典途徑，可使小鼠體內的腫瘤數量明顯下降[32]。

EMT是上皮細胞在轉移過程中獲得運動和入侵能力的基本程序。在此過程中，細胞失去其上皮細胞特征，如E-cadherin和Zonula Occludens-1等細胞-細胞黏附蛋白，并獲得間充質性狀，如N-cadherin和波形蛋白（Vimentin）等前體細胞骨架蛋白。E-cadherin下調，N-cadherin蛋白上調，可使細胞形成偽足，獲得侵襲能力，對腫瘤的浸潤和轉移起到促進作用。具有EMT表型的細胞甚至可以作為單個細胞侵入，因此，探索EMT發生的機制對于提高患者的生存至關重要。有研究指出NF-κB能夠與基因上的轉錄因子Snail和ZEB基因位點結合，促進相應轉錄因子表達，進而抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和橋粒斑蛋白的表達，同時上調N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）的表達，以促進EMT的發生[33]。本研究在體外實驗部分已經證實，LPS可以通過NF-κB途徑誘導人結腸癌細胞發生EMT。

同領域研究者已證實黃芪多糖可減少炎性細胞浸潤，降低NF-κBp65 mRNA及其蛋白質的表達水平，從而發揮免疫保護作用[34]。在本研究中，通過CAC模型小鼠體內實驗可見，灌服黃芪多糖后小鼠體質量升高，一般狀態好轉，有利于恢復小鼠的體質量和精神活動狀態。解剖后觀察成瘤情況，黃芪多糖雖然沒有完全抑制腫瘤生長，但是在減少成瘤數目和大小上有積極作用。在病理診斷上，炎性反應程度和不典型增生程度也可被黃芪多糖改善。本在研究還證實了黃芪多糖可以改善CAC模型小鼠腸道菌群豐度和多樣性。研究中發現黃芪多糖可以上調Lactobacillus和Lactococcus的豐度。Grimoud J等[35]根據抗炎和抗人結腸癌HT-29細胞增殖作用體外篩選出有效的益生菌和合生元，其中短雙歧桿菌，乳球菌和Oligoalternan可以顯著抑制增殖。而這種增殖抑制的作用機制同樣是通過調控HT-29細胞對LPS誘發的炎性反應應答而實現的，LPS增加了其生物傳感器TLR4的表達，而益生菌或合生元的介入，可以降低這種炎性反應傳導。本研究經體外實驗發現黃芪多糖對LPS誘導的人結腸癌LoVo細胞NF-κB活化有抑制作用，并且通過劃痕實驗直觀的觀察到黃芪多糖可以抑制LPS誘導的細胞遷移。由此可以推斷黃芪多糖對人結腸癌LoVo細胞EMT的發生也有一定影響。因此，本研究進一步研究了黃芪多糖對人結腸癌LoVo細胞的遷移的影響。在EMT的發生中，E-cad下調，N-cad蛋白上調，使細胞形成偽足，獲得侵襲能力，對腫瘤的浸潤和轉移起到促進作用。本實驗對EMT發生的相關蛋白NF-κB p65、E-cad和N-cad作了測定，發現黃芪多糖可以降低NF-κB p65和N-cad蛋白的含量，升高E-cad蛋白的含量。因此，可以初步認為APS在抑制人結直腸癌細胞的遷移上也有明顯效果，并且這種效果的產生是由于TLR4/NF-κB信號通路被抑制。

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（2019-09-16收稿 責任編輯：王明）

基金項目：中國博士后科學基金面上項目（2019M650596）

作者簡介：劉雷蕾（1989.10—），男，博士后，助理研究員，研究方向：中醫基礎理論和中醫藥治療脾胃病基礎研究，E-mail：lightlong@126.com

通信作者：馬淑然（1964.11—），女，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：天人相應中醫理論臨床與實驗研究，E-mail：mashuran64@sina.com