基于血液代謝組學技術的甲氨蝶呤抗類風濕性關節炎作用機制研究

蔡蕭君 李宇 胡楊 吳圓圓 王欽 王旭玲

摘要 目的：采用代謝組學技術探究甲氨蝶呤抗類風濕性關節炎的作用機制。方法：采用佐劑性關節炎（AIA）方法復制大鼠類風濕性關節炎模型，采用經典足腫脹度指標評價模型復制程度，并給予甲氨蝶呤進行治療。收集血液樣本采用代謝輪廓技術表征疾病發生發展及給予藥物干預后的代謝水平，采用MSE數據采集模式全成分獲取各組大鼠的實驗過程中的生物學信息，并通過模式識別、富集分析等手段以整體分析到局部的聚焦分析方法獲取與類風濕性關節炎相關的核心代謝酶及血液生物標記物。進而闡明類風濕性關節炎的發病機制及甲氨蝶呤的作用機制。結果：非靶向代謝輪廓分析顯示，甲氨蝶呤對類風濕性關節炎大鼠的整體代謝由明顯的干預作用，代謝輪廓由模型狀態向空白組狀態發生偏移，從整體代謝角度證明甲氨蝶呤對類風濕性關節炎鼠有良好的療效。通過正交偏最小二乘判別分析中的S圖聚焦獲取類風濕性關節炎大鼠血液相關代謝異常標記物，如鳥苷五磷酸腺苷、葡萄醛酸膽紅素、鳥苷二磷酸、硬脂酸等。通路分析顯示來發現類風濕性關節炎大鼠主要涉及脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、嘧啶代謝、戊糖和葡萄糖醛酸化、嘌呤代謝。結論：甲氨蝶呤對類風濕性關節炎大鼠有良好的治療作用。通過整體的對脂肪酸生物合成等代謝通路中關鍵代謝酶及代謝標記物的調節作用可能起到抑制類風濕性關節炎的作用。

關鍵詞 甲氨蝶呤;類風濕性關節炎;非靶向代謝組學;花生四烯酸;生物標記物

Comprehensive Serum Metabolomics Analysis with the Inhibitory Effect

of Methotrexate on Rheumatoid Arthritis Inflammation

CAI Xiaojun，LI Yu，HU Yang，WU Yuanyuan，WANG Qin，WANG Xuling

（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine Harbin 150036，China）

Abstract Objective：To explore the anti-rheumatoid arthritis mechanism of methotrexate by using metabonomic techniques.Methods：The model of rheumatoid arthritis in rats was replicated by adjuvant arthritis （AIA）.The replication degree of the model was evaluated by classical foot swelling index and treated with methotrexate.Serum samples were collected to characterize the occurrence and development of diseases and the metabolic level after drug intervention by metabolic profiling technology.Biological information of each group of rats was obtained by MSE data acquisition mode during the experiment.Core metabolic enzymes related to rheumatoid arthritis were obtained by pattern recognition，enrichment analysis and other methods.The pathogenesis of rheumatoid arthritis and the action mechanism of methotrexate were further elucidated.Results：Non-targeted metabolic profile analysis showed that methotrexate had an obvious intervention effect on the overall metabolism of rheumatoid arthritis rats，and the metabolic profiles shifted from model state to blank group state.It was proved that methotrexate had a good effect on rheumatoid arthritis rats from the point of view of overall metabolism.The blood-related metabolic abnormality markers such as guanosine Pentaphosphate adenosine，glucuronic acid bilirubin，guanosine diphosphate，stearic acid，in rheumatoid arthritis rats were obtained by S-map focusing in orthogonal partial least squares discriminant analysis.Pathway analysis showed that fatty acid biosynthesis，starch and sucrose metabolism，pyrimidine metabolism，pentose and glucuronidation，purine metabolism were mainly involved in rheumatoid arthritis rats.Conclusion：Methotrexate has a good therapeutic effect on rheumatoid arthritis rats.The regulation of key metabolic enzymes and metabolic markers in metabolic pathways such as fatty acid biosynthesis，starch and sucrose metabolism，pyrimidine metabolism may play a role in inhibiting rheumatoid arthritis.

Keywords Methotrexate; Rheumatoid arthritis; Mon-targeted metabonomics; Arachidonic acid; Biomarkers

中圖分類號：R274.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.010

類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種慢性全身性炎癥性自身免疫性疾病，影響身體不同部位，不可避免地引起關節疼痛、腫脹和功能喪失[1]。RA顯著影響生命質量，導致患者嚴重殘疾。目前對類風濕性關節炎患者的常規治療，包括改善病情抗風濕藥和生物制劑，并不令人滿意。據我們所知，關于類風濕關節炎的發病機制還沒有統一的理論。因此，有必要尋找一種敏感性和特異性較高的早期診斷標志物。

代謝組學是研究疾病與代謝關系的最新方法之一。幾種分析技術已被廣泛應用于代謝物的測定，包括質譜、磁共振成像氫譜和液相色譜-質譜[2]。值得注意的是，新出現的證據表明RA易感性可能與代謝紊亂有關[3-4]。代謝組學方法可以提供對整個代謝過程的洞察，并確定代謝物和相關代謝途徑的差異[5]。最近的證據也表明，代謝組學方法是表征RA代謝變化的有效工具[6-8]。

臨床實踐中甲氨蝶呤被視為RA的標準一線藥物，在60%以上的RA患者中取得了滿意的治療效果[9-12]。然而，這種治療效果背后的詳細機制尚未完全闡明。本研究采用代謝組學技術對其進行研究，并對甲氨蝶呤的體內外治療效果進行評價。確定了甲氨蝶呤治療后代謝概況的總體觀點，為類風濕性關節炎的發病機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雄性SD大鼠（150±20）g，5～6周齡，清潔級，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，合格證編號：SCXK-（軍）2018-004。無菌動物房中飼養，模擬自然光規律給予周期為12 h的光照調節，溫度和相對濕度分別為（20±5）℃和（40±5）%。所有大鼠自由給予標準飲食和自來水。

1.1.2 藥物

甲氨蝶呤片（通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22022674）。

1.1.3 試劑與儀器

UPLC-G2Si-HDMS系統（Waters公司，美國，型號：UPLC-MS）;XPE105分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士，型號：XPE105）;RUPT-Ⅲ超純水機（山東新瑞分析儀器有限公司，型號：RUPT-Ⅲ）;YLS-7A型足跖容積測量儀（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司，型號：YLS-7A）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

大鼠實驗前適應性喂養7 d后，按照體質量隨機分為空白組、模型組和給藥組，每組8只。模型組和給藥組大鼠足跖皮內注射弗氏完全佐劑0.1 mL（連續2 d），誘導類風濕性關節炎?？瞻捉M大鼠足跖皮內注射生理鹽水0.1 mL。造模第14天后測定足跖腫脹度。

1.2.2 給藥方法

將甲氨蝶呤片劑研碎并均勻混懸于0.5% CMC-Na，濃度0.1 mg/mL[13]。實驗第15天給藥組大鼠灌胃給予甲氨蝶呤溶液（1 mL/100 g），連續7 d，空白組和模型組灌胃等量的生理鹽水。

1.2.3 檢測指標與方法

檢查各組大鼠的一般形態學及足腫脹程度。

1.2.3.1 一般形態學觀察與代謝樣本的制備 實驗期間觀察各組大鼠的一般形態學，如精神狀態、活動情況、皮毛、飲食等。實驗第22天，采用主動脈取血方法采集各組大鼠血液，離心（4 ℃，3 500 r/min，10 min，離心半徑13.5 cm）得血清，于-80 ℃保存。臨用時，取100 μL血清，置于1.5 mL離心管中，加入100 μL的甲醇，渦旋30 s，離心（4 ℃，10 000 r/min，15 min，離心半徑13.5 cm）得上清液，35 ℃下氮氣吹干，100 μL甲醇復溶，再次離心（4 ℃，10 000 r/min，15 min，離心半徑13.5 cm），用0.22 μm微孔濾膜濾過，取上清液即得代謝樣本。

1.2.3.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相A：0.1%乙腈、流動相B：0.1%甲酸水，梯度洗脫;柱溫：40 ℃;流速：0.3 mL/min;進樣量：3 μL。血液梯度洗脫方法見表1。

1.3 統計學方法

采用組學分析平臺MetaboAnalyst對血液代謝物組數據進行預處理。采用Ezinfo 2.0（瑞典Umetrics公司）進行化學計量學分析，最后通過偏正交最小二乘判別分析篩選類風濕性關節炎大鼠血液生物標記物。以t檢驗方法考察空白組、模型組間的各項統計學差異結果，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般形態學結果

空白組大鼠精神狀態較好，活動規律正常、行動自如、皮毛光滑圓潤，進食和飲水在實驗整體階段都無異常。造模第14天，與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡、活動不便、部分大鼠出現后肢癱瘓現象、需要依靠前肢進行移動、毛色枯黃、瘦弱，后肢出現明顯的關節紅腫和變性狀態，生命狀態極差。

2.2 足腫脹程度結果

實驗第1天，各組大鼠足腫脹程度相似，差異無統計學意義。造模后，即實驗第14天，模型組和給藥組大鼠出現明顯的足腫脹現象，差異有統計學意義（P<0.05）。即證明類風濕性關節炎模型復制成功。見表2。

2.3 代謝組學分析

各組大鼠血液代謝指紋如圖1所示，差異無統計學意義你，通過將維度處理，得到顯示組間差異最大的二維圖譜。見圖2。代謝輪廓的得分圖顯示3組件分布明顯，其中給藥組處于空白組和模型組間，證明給予甲氨蝶呤后，疾病狀態下的大鼠的整體代謝水平有一定程度的好轉趨勢，整體代謝向空白組靠攏。

為達到儀器和數據的可靠性，本研究采用QC樣本（質控樣本）在數據采集各個階段進行監督，并顯示與主成分分析中。

進一步對空白組和模型組的生物樣本進行正交偏最小二乘判別分析分析，得到對分組貢獻明顯的差異標記物。見圖3。共鑒定出12個與類風濕性關節炎大鼠血液生物標記物。見表3。

生物標記物含量變化如圖5所示，可以看到通過甲氨蝶呤治療后，各生物標記物都向正常狀態回調。通路富集結果顯示類風濕性關節炎大鼠的代謝主要涉及脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、嘧啶代謝、戊糖和葡萄糖醛酸化、嘌呤代謝。見圖6。最后通過Metscape軟件構建代謝通路示意圖。見圖7。

2.4 生物標記物鑒定

生物標記物的結構鑒定是代謝組學的重點和難點，本部分直接采用以標準品建立質譜庫的人類代謝組數據庫HMDB進行匹配鑒定。根據記載的不同碰撞能下碎片信息進行比對，作為生物標記物的判定依據，以LysoPE（0∶0/24∶0）的鑒定結果為例。見圖4。

3 討論

尿苷三磷酸是合成RNA的主要原料之一。據報道，尿苷三磷酸和維生素B12的聯合應用對壓迫性神經痛具有顯著治療效果。與單獨服用維生素B12比較，尿苷三磷酸和維生素B12聯合服用對無嚴重不良事件患者的疼痛緩解方面具有更顯著的統計優勢[14]，骨髓基質細胞脂肪生成失調和成骨可能會導致骨質疏松癥。在激活p2y2受體后，尿苷三磷酸可通過調節骨髓基質細胞的成骨和成脂分化來延緩骨質疏松癥的進展[15]。因此，模型組中尿苷三磷酸的失調可能導致骨關節病。近年來有一系列相關研究結果證明甲氨蝶呤對尿苷三磷酸的代謝發揮調控作用，同時甲氨蝶呤對骨損傷有一定程度的保護作用，通過2方面的協同起效，最終達到治療類風濕性關節炎的目的[16]。

維生素D3-23羧酸是維生素D的活性形式，具有增加鈣磷吸收、促進生長和骨鈣化、維持血液中檸檬酸鹽正常水平、防止腎代謝中氨基酸丟失等生理功能[17]。對煙曲霉抗原的免疫反應可引起過敏性疾病，即過敏性支氣管肺曲霉病，同時增加CD4+T細胞中白細胞介素-13反應。能抑制這種過敏反應，改善過敏性支氣管肺曲霉病患者的病情[18]。另外，其具有免疫調節和抗炎活性。研究表明，維生素D3-23羧酸在許多自身免疫疾病如類風濕性關節炎、多發性硬化和骨質疏松癥的進展中起著關鍵作用[19]。許多研究表明，缺乏陽光和維生素D3-23羧酸會導致硬化和骨質疏松癥;因此，補充維生素D3-23羧酸對骨質疏松癥患者是非常有效的治療方法[20]。骨質疏松癥與動脈粥樣硬化高度相關。這2種疾病的并行進展增加了冠狀動脈和骨折的風險。維生素D3-23羧酸缺乏可大大增加骨折風險，并導致繼發性甲狀旁腺功能亢進和冠狀動脈鈣化[21-22]。鎂中鈣質酸含量顯著增加，說明維生素D3-23羧酸含量降低，降低了免疫系統的調節能力。近年來，研究發現作為白血病的靶向性藥物甲氨蝶呤在治療過程中對維生素有很好的調節作用[23]，后者在骨生長和發育都有重要作用。由此推斷甲氨蝶呤在類風濕性關節炎患者治療過程中起到對維生素調節的作用。

二十二碳六烯酸（DHA）是人體必需的多不飽和脂肪酸。DHA具有多種生物學活性，如幫助腦細胞發育、延緩衰老、改善血液循環和降低血脂。此外，二十二碳六烯酸還可以預防風濕性關節炎。據報道，DHA能抑制骨髓源性巨噬細胞的增殖和分化，誘導成熟破骨細胞的凋亡。最終，DHA導致骨吸收細胞數量減少。DHA可以通過生物衍生作用生成一種新型的生物活性脂質遞質。這些內源性遞質可以作用于特定的G蛋白偶聯受體以抑制炎性反應。模型組中的DHA含量顯著增加，表明人體對RA引起的炎性反應有應激反應，給予甲氨蝶呤治療后二十二碳六烯酸含量成回調趨勢，證明甲氨蝶呤對二十二碳六烯酸有一定程度的調節作用，近年來研究表明甲氨蝶呤可能通過對G-Protein受體120的調節達到調節DHA目的[24]。

本研究利用非靶向代謝組學分析樣本中所有可測量的分子，包括化學未知物。但是，用非靶向代謝組學進行量化的能力極為有限，需要我們對甲氨蝶呤治療的類風濕關節炎患者進行靶向研究。此外，作為一種經典的化學治療藥物，抑制潛在靶點后的未知不良反應還需要我們進一步評價。

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（2019-10-16收稿 責任編輯：徐穎）

基金項目：黑龍江省自然科學基金面上項目（H2017043）

通信作者：蔡蕭君（1975.12—），男，博士，主任醫師，研究方向：神經精神的基礎研究，內分泌代謝病藥物研究，E-mail：ssycxj@163.com