唾液miRNA-144miRNA-21聯合檢測對食管癌的診斷價值

古佳升， 吳偉東， 劉清峰， 桃卓嫣

食管癌是一種較常見的消化道惡性腫瘤，根據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)發布的報告[1]估計，全球每年食管癌新發患者約57.2萬例，病死人數約50.9萬例，其中有近一半新發病例和超過一半的死亡病例發生在亞洲地區，而中國的食管癌患者人數居全球首位。廣州市疾病預防控制中心2020年發布的《2004-2016年廣州市食管癌發病趨勢分析》[2]表明，相比于城區，郊縣和農村地區的食管癌發病率上升趨勢明顯。治療食管癌的關鍵在于早期發現、早期診斷、早期治療。miRNAs作為一種參與了細胞間信號傳遞的非編碼RNA在細胞信號轉導方面發揮著極為重要的作用。miRNA-144是一種新發現的食管癌標志物，但關于其作用機制尚未形成完善的結論。本課題組的前期研究[3]發現，食管癌患者唾液中miRNA-144呈高表達，且特異度高。檢測唾液中的miRNA具有成為診斷食管癌新方法的潛力[4]。miRNA-21與多種惡性腫瘤的血管侵襲能力有關，其在惡性腫瘤患者血漿中呈明顯高表達，且由于唾液腺有豐富的血供，故其在唾液中也可檢出[5-6]。鑒此，本研究旨在分析miRNA-144、miRNA-21在食管癌患者唾液中的表達情況，探討這兩種miRNA基因標志物的聯合檢測在食管癌早期診斷中的價值及意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年1月至2019年5月暨南大學附屬廣州市紅十字會醫院心胸外科收治的食管癌患者85例(病例組)，均經病理活檢與免疫組化檢查確診，其中男37例，女48例，年齡均>60歲。根據美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和國際抗癌聯盟(International Union Against Cancer,UICC)分期標準[7]，0期14例，Ⅰ期22例，Ⅱ期11例，Ⅲ期11例，ⅣA期15例，ⅣB期12例。另同期招募本地社區來我院體檢的健康志愿者32名作為對照組，其中男18名，女14名，年齡均>60歲。兩組排除標準：(1)有高血壓、糖尿病及冠心病等慢性病史者；(2)有肝炎、結核及艾滋病等傳染性疾病者；(3)有染色體異常等遺傳病史者；(4)有其他惡性腫瘤者；(5)標本采集期間有口腔潰瘍、口腔惡性腫瘤、牙周炎等口腔相關疾病者。

1.2樣本采集 在唾液標本采集之前4 h內，受試者須禁食、禁飲，無抽煙、喝酒行為。棉簽蘸取2%的檸檬酸后輕輕擦拭唾液腺開口處，每30 s擦拭1次，待唾液流出時使用無菌負壓吸痰器收集唾液，共5次，每次收集約2 ml唾液，共采集10 ml。在完成標本收集工作2 h內，將收集好的唾液置入4 ℃容器中，以3 000 r/min離心15 min以去除細胞沉淀以及食物殘渣，-80 ℃保存備用。

1.3唾液miRNA-144、miRNA-21檢測 參考既往研究[4]方法，取恒溫箱保存的唾液標本置入1.5 ml EP管，采用Trizol法提取總RNA。應用cDNA反轉錄試劑盒(MBI Fermentas，加拿大)進行反轉錄，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。應用Bio-Rad CFX96的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀，以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增(50 μl體系)，miRNA-144、miRNA-21引物序列見表1，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PD)作為內參，結果以2-ΔΔCt法進行計算。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以溴化乙錠染色，采用凝膠成像儀進行掃膜成像。

表1 miRNA-144、miRNA-21引物序列

2 結果

2.1兩組唾液中miRNA-144、miRNA-21表達水平比較 病例組唾液中miRNA-144、miRNA-21的表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組唾液中miRNA-144、miRNA-21表達水平比較 [M(P25，P75)，相對表達量]

2.2食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21表達水平與病理分期的關聯性分析結果 食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21表達水平與病理分期存在關聯性(P<0.05)。見表3。在0期～ⅣB期，miRNA-144、miRNA-21表達水平呈上升趨勢。Spearman秩相關分析結果顯示，miRNA-144和miRNA-21與臨床分期呈正相關(rs=0.556，P=0.000；rs=0.575，P=0.000)。

表3 食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21在各分期中的表達水平比較相對表達量]

2.3唾液中miRNA-144和miRNA-21聯合檢測在食管癌患者中的診斷價值 以病理活檢結果作為金標準，ROC曲線法分析結果顯示，唾液中miRNA-144和miRNA-21對食管癌均具有較好的診斷價值，且當聯合兩指標時，診斷效能進一步提升。見圖1，2；表4。

圖1 食管癌患者唾液中miRNA-144的ROC曲線圖

圖2 食管癌患者唾液中miRNA-21的ROC曲線圖

表4 唾液中miRNA-144和miRNA-21對食管癌的診斷價值

3 討論

3.1食管癌是一種比較常見的消化道惡性腫瘤，由于中國人口基數大，全球有近一半的食管癌發生于我國，人數居全球首位[1]。食管癌早期癥狀不明顯，故其早期篩查和診斷主要采用有創傷性方法，包括食管拉網脫落細胞檢測技術、消化道內鏡技術等[8-9]。這些篩查技術在檢查的過程中會給患者造成創傷，且檢查費用較高，難以實現較大規模的人群篩查，早期篩查率低。大部分食管癌患者確診時已屬中晚期，失去根治性手術機會[10]。而如果患者能在早期通過準確、有效的檢測手段發現病灶，并接受手術切除或免疫治療等方式，生存率可高達90%[11]。因此，為了實施預防管理和提高食管癌的治療效果，探尋一種檢測精準、便捷且成本低廉的食管癌無創篩查技術和產品，具有重要意義。

3.2唾液是一種唾液腺分泌的弱酸性液體，由于唾液腺血供豐富，唾液中含有廣泛的蛋白質、電解質和核酸，且這些物質來源廣泛，可反映個體的生理狀態[12-15]。miRNAs參與了細胞的生長、分化、凋亡和免疫過程，并在惡性腫瘤的發生、發展中也發揮著重要的作用[13，16-18]。2009年Park等[19]研究發現，口腔癌患者唾液及唾液上清液中至少有50種miRNA呈高表達，且其降解速度慢，穩定性較好。這為以miRNAs為標志物對消化道腫瘤進行早期鑒別提供了思路。

3.3如今，唾液檢測作為一種無創性的檢測技術，愈來愈多的研究集中于相關標志物的開發，其中包括對遠端組織和器官惡性腫瘤的檢測[15，18，20]。Setti等[21]通過系統評價的方式驗證了唾液中的miRNAs可作為癌癥診斷的可靠生物標志物。為了保證實驗結果的可靠性，本研究方法參考了最新的唾液分離與定量檢測方法[22]。本課題組的既往研究[4]發現，miRNA-144在食管癌患者的唾液及唾液上清液中呈高表達，為進一步研究其在食管癌早期篩查中的應用價值提供了理論依據。而近期也有研究[3]間接驗證了miRNA-144是影響食管癌患者預后的一個獨立危險因素。另外，有多項研究[6，23]表明，miRNA-21在消化道惡性腫瘤患者的血液中呈高表達，同時也有研究[5，24]顯示其在唾液中可以檢出。本研究結果顯示，與健康者相比，食管癌患者唾液中miRNA-144、miRNA-21的表達水平顯著提高，且與患者的病理分期存在關聯性，隨著腫瘤浸潤進展以及遠處轉移的增加，唾液中兩種miRNA的表達水平上升。ROC曲線分析結果顯示，miRNA-21和miRNA-144診斷食管癌的ROC曲線下面積分別為0.785、0.777，提示兩種標志物均具有較好的診斷價值，且當聯合兩者檢測時，診斷效能進一步提升。

3.4相比于內鏡活檢等檢查，目前唾液檢測對于遠處腫瘤的診斷價值仍然有限，但其易采集、非侵入的優勢值得關注，且患者更易接受，更適宜大規模人群的篩查。本研究針對miRNA-144、miRNA-21的發現可作為未來開發食管癌快速檢測試劑盒及儀器的理論基礎。但是本研究也存在一些不足之處：(1)研究針對>60歲的健康人群及食管癌確診患者進行檢測，沒有納入良性病變組，這使得研究結論難以在鑒別食管異常增生或潰瘍的良惡性方面推廣。(2)研究未能在手術后或化療治療后隨訪患者唾液中miRNA-144、miRNA-21表達水平的變化情況，未能評判miRNA-144、miRNA-21對于預測患者預后的價值。在后續的研究中，我們將對此進行完善，以進一步評價miRNA-144、miRNA-21在食管癌患者早期篩查診斷及預后預測中的價值。

綜上所述，食管癌患者唾液中miRNA-144、miRNA-21的表達水平呈高表達，其聯合檢測具有應用于食管癌早期篩查診斷的潛力。