miRNA101對人牙囊細胞成骨分化的影響

張 驄，劉 暢

（吉林大學口腔醫院正畸科，長春 130021）

牙囊屬于一種松散的外胚間源性結締組織，它在萌發期間圍繞著正在發育的牙胚［1］。牙囊細胞來自于牙胚發育中的牙囊組織，被認為是成牙骨質細胞、牙周膜細胞和成骨細胞的前體細胞。以往研究表明，牙囊細胞具有多向分化潛能，其在一定條件誘導下可向成骨方向分化牙囊細胞包含由牙周膜（PDL），牙槽骨和礦化的牙骨質組成的牙周組織的祖細胞，它對于牙根和牙齒發育的協調至關重要［2-3］。文獻研究表明，分離的人類牙囊細胞（DFC）能夠分化成礦化細胞。而人口腔中的鈣化組織就是由牙齒成牙骨質樣細胞或由牙槽骨成骨細胞樣細胞組成［4-5］。然而，牙囊細胞向功能細胞（如成骨細胞/成牙骨質細胞）分化的調節機制仍知之甚少。因此，如何誘導牙囊細胞成骨定向分化成為牙齒硬組織結構再生研究的關鍵之一［6］。

微小RNA（miRNA）是干細胞生長發育中非常重要的調節因子［7］。這些短的RNA（大約22nt）是屬于一類非編碼內源性RNA，可以通過結合其靶蛋白的編碼信使RNA（mRNA）的30個非翻譯區來調節基因表達［8］。而且，miRNA能夠通過轉錄后基因的表達沉默來影響翻譯抑制和mRNA分裂［9］。在胚胎干細胞自我更新中miRNA同樣起著關鍵的作用，而且它們對于調節干細胞分化、骨骼肌發育、神經發生、壓力和免疫反應都有著非常重要的作用［10-11］。一個miRNA可以靶向數百個基因，同樣，一個基因則可以被多個miRNA靶向調控，然后有研究報道，miRNA更傾向與靶向調控轉錄因子［12］。

雖然關于miRNA調控成骨轉錄分化的研究很多，但是直到目前為止，DFCs中miRNA表達與成骨轉錄因子的表達之間的關系仍然未被闡述清楚。為了研究miRNA在DFC成骨分化過程中的作用，本研究采用體外轉染和RT-PCR技術，研究了miRNA101在牙囊細胞成骨分化期間的差異表達，首次揭示了miRNA101在人牙囊細胞成骨分化過程中的關鍵作用。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑DMEM培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Gibco，美國）；總RNA抽提試劑盒（Giagen GmbH公司，德國）；逆轉錄反應和實時定量聚合酶鏈反應（quantitativereal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）；試劑盒（TaKaRa公司，日本）；超凈工作臺（ESCO，加拿大）；細胞培養箱（Thermo Scientific，美國）；DFCs（ALL Cells，美國）；miRNA101模擬物（Qiagen，Hilden，Germany）；RT-PCR儀（Bio-rad，美國）；引物由軟件primer5設計，Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養DFCs培養于含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養基中，溫度37℃，CO2含量5%。每兩天換液一次，待細胞長滿皿底70%～80%時用0.25%胰酶按1：2 傳代，取第3 代細胞用于實驗。

1.2.2 成骨分化誘導為了成骨分化，將基本培養基替換為誘導成骨分化的培養基（ODM）。ODM的組成成分為：DMEM、10%FBS、10-7M地塞米松、100mM磷酸抗壞血酸、10mMβ-甘油磷酸和20mM HEPES緩沖液。

1.2.3 轉染和RNA分離細胞以每孔6×104個接種于6孔板，當細胞密度達到80%～90%時，進行miRNA轉染實驗。miRNA-101用無血清培養稀釋至5mM，然后加入HiPerfect轉染試劑，混合均勻，室溫孵育15～20min（具體操作步驟見試劑盒說明書），亂序siRNA作為對照。然后將轉染復合物加入孔板中，于孵箱中培養24h。孵育24h后更換完全培養基繼續培養48h。實驗終點時用miRNeasy mini Kit提取總RNA。用miScript miRNA PCR Array 試劑盒進行PCR分析，具體操作見試劑盒說明書。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測細胞以每孔6×104個接種于6孔板，miRNA轉染48h后，收集各組細胞裂解液，采用LabAssayTM ALP檢測試劑盒檢測細胞裂解液中的ALP活性。各組細胞裂解液的ALP活性值均用相應的細胞總蛋白濃度予以校準，求得各組ALP活性值。

1.2.5 qRT-PCR檢測成骨相關基因的表達細胞以每孔1×105個接種于6孔板，轉染誘導后48h，采用RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set試劑盒抽提細胞總RNA，經逆轉錄反應合成相應cDNA，β-actin為內參基因。配制real-time PCR 10μL反應體系，進行qRTPCR定量檢測分析（具體應參數及操作步驟均參考試劑盒使用說明書）。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.3 統計學分析SPSS 17.0軟件進行統計分析，行單因素方差分析，以LSD法進行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨分化對miRNA101表達的影響ODM培養基誘導DFCs成骨分化第3天和第7天進行總RNAs提取和檢測。結果見圖1。結果顯示，與正常培養基相比，ODM培養基誘導第3天時miRNA101的表達略微升高，沒有顯著性差異。ODM培養基誘導第7天時，miRNA101的表達顯著升高，實驗結果具有統計學差異。

圖1 誘導DFCs成骨分化對miRNA101表達的影響（**P<0.01，n=3）

2.2 miRNA101模擬物對成骨分化相關基因表達及ALP活性的影響為了探討miRNA101對DCFs成骨分化的影響，本研究用miRNA101模擬物體外轉染DFCs細胞。并用miScript miRNA PCR Array檢測miRNA101表達情況；LabAssayTM ALP檢測試劑盒檢測ALP活性；qPCR檢測成骨分化相關基因表達情況，結果見圖2、圖3和圖4。由圖2結果可知，與Control組和siNT組相比，miRNA101模擬物轉染過后顯著增加miRNA101的表達。為探討miRNA101高表達過后DFCs成骨分化情況，實驗進一步檢測了ALP活性及成骨相關基因OCN和Runx2的表達情況，結果見圖3和圖4。由實驗結果可知，與對照組相比，miRNA101高表達組的ALP活性顯著增加，結果具有統計學差異。成骨相關基因Rnux2和ALP mRNA的表達也顯著升高，而OCN mRNA的表達不受miRNA101表達的影響。實驗結果提示miRNA101能夠促進DFCs細胞的成骨分化。

圖2 miRNA101模擬物對DFCs的miRNA101表達的影響（***P<0.001，n=3）

圖3 miRNA101模擬物對DFCs的ALP活性的影響（***P<0.001，n=3）

圖4 miRNA101模擬物對成骨分化相關基因表達的影響（**P<0.01，n=3）

2.3 miRNA101對成骨轉錄因子SATB2表達的影響為進一步探討miRNA101誘導成骨分化的相關機制，實驗進一步測定了成骨相關標記物的表達情況。結果表明miRNA101轉染過后成骨轉錄因子SATB2的基因表達顯著增加（見圖5）。實驗結果表明miRNA101參與DFCs的成骨分化，可能機制為調控成骨轉錄因子SATB2的表達。

圖5 miRNA101模擬物對成骨轉錄因子表達的影響（***P<0.001，n=3）

3 討論

外胚間充質干細胞DFCs的使用對于體外研究牙槽成骨細胞和成牙骨質細胞分化具有非常大的好處，在臨床應用中也具有巨大的前景［4］。盡管迄今為止對DFC中成骨分化的信號傳導途徑有了很深入的研究，但是對于miRNA在DFCs成骨分化中的作用仍然難以闡述清楚。研究表明miR144、miR125b和miR-20a在小鼠和人的3T3細胞、間充質干細胞以及人脂肪組織來源的干細胞的成骨分化中具有重要的調節作用［13-15］。但是關于miRNA對DFCs成骨分化的作用及其具體機制尚未有深入研究。

本實驗研究中表明，在長期培養的DFC中，miRNA101的基因表達顯著增加。而與標準培養基相比，在ODM培養基的誘導下，miRNA101的表達進一步顯著增加。有研究表明miRNA101能夠抑制在礦化性牙周膜細胞中差異表達的PLAP1的表達，而PLAP-1是公認的抑制的牙周韌帶礦化的負調節因子［16］。這些研究表明miRNA101能夠通過影響成骨分化標志物的表達而參與調節成骨分化相關因子的表達。本研究還發現miRNA101模擬物轉染DFCs后顯著增加了成骨分化相關標志物的表達及ALP活性。而且miRNA101尤其增加了DFC中SATB2的表達，SATB2作為成骨分化的重要轉錄因子，對DCFs成骨起到重要調節作用［17］。

本研究首次揭示了miRNA101可能通過調控DCFs中成骨轉錄因子SATB2的表達來調節成骨分化。由于SATB2為新近發現的轉錄因子，其轉錄調控功能區域（包括啟動子區、增強子區）的具體定位尚不明確，有待進一步深入探索。鑒于SATB2 在成骨分化中的核心作用，其具體機制的進一步研究將推動骨形成機制的闡明及相關骨代謝疾病的合成治療，具有巨大的市場應用前景。

本研究證明了miRNA101具有明顯的促進人牙囊細胞成骨細胞分化的效果，并且其可能機制通過調節成骨分化關鍵轉錄因子SATB2的表達來調節DFCs的成骨分化。