美薔薇花粉離體萌發條件及貯藏特性研究

宋 華， 朱 瑩， 鄧 蓮， 杜 瑩， 劉 娜

(北京市植物園，北京市花卉園藝工程技術研究中心，城鄉生態環境北京實驗室， 北京 100093)

利用耐寒性強的薔薇與現代月季進行遠緣雜交，是培育耐寒月季的主要途徑之一。美薔薇(Rosabella)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)灌木，為中國特有種，在北方多個地區均有分布，自然分布海拔可達1 700 m[1]，是薔薇屬優良的耐寒種質資源。有研究指出，美薔薇與現代月季雜交親和性較強[2]，可作為培育優良耐寒月季的親本。由于目前美薔薇尚未在園林綠化中大量栽培利用，其自然分布多在山區且花期較晚，因此，在利用自然分布的美薔薇為父本與現代月季進行遠緣雜交時，需將其花粉貯藏至第二年使用。經過長期貯藏后，花粉能否保持較高活力是雜交成敗的關鍵。

花粉貯藏過程中，生活力受到貯藏溫度、濕度等外界因素的影響。一般認為，薔薇屬植物花粉常溫保存時間較短，活力保持不足一個月[3-4]。低溫低濕的貯藏條件更利于花粉保存。超低溫保存可以大大延長花粉的保存時間[5]，但需要特殊的設備。-20 ℃冷凍保存是節約能源、簡便易行的貯藏條件。有研究指出，某些月季品種花粉在-20 ℃冷凍保存，活力可以維持一年以上，而且在190 d內，與在-80 ℃保存的活力差異不大[6]。薔薇屬不同種(品種)間花粉貯藏特性差異較大[6-7]，關于美薔薇花粉貯藏特性的研究未見報道。

花粉離體培養法接近花粉自然萌發狀況，是測定花粉生活力的常用方法之一?；ǚ垭x體萌發受蔗糖、鈣、硼、生長素等多種因素的影響[8]。薔薇屬不同種(品種)花粉適宜的培養基不同[9-11]，美薔薇花粉萌發的相關研究較少。本試驗擬篩選美薔薇花粉萌發的最適培養基，并研究不同干燥劑及貯藏溫度對美薔薇花粉活力的影響，以探索美薔薇花粉長期貯藏特性，為其在月季遠緣雜交育種中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

美薔薇(RosabellaRehder & E. H. Wilson)花粉于2017年6月19日采自北京市門頭溝區靈山，09：30—10：30時收集即將開放的花苞，13：00時用鑷子將花苞內的花藥取下，所有花藥混合后，置于硫酸紙上，室溫條件下(25 ℃，相對濕度為30%～40%)干燥約20 h，收集花粉用于花粉離體萌發測定及貯藏試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1花粉萌發最佳培養基的篩選

選用L16(45)正交試驗，各因子水平見表1，各處理重復3次，每重復觀察3個視野，每個視野花粉總數不少于50粒，統計花粉萌發率及花粉管長度。

表1 正交試驗設計

1.2.2花粉貯藏方法及活力檢測

將美薔薇花粉分成小份，每份約2 mg，用硫酸紙包好。一部分放入裝有硅膠或有無水氯化鈣的離心管中，置于4 ℃冷藏保存，貯藏90 d、180 d、270 d時各取出1管進行花粉活力測定；另一部分放入不加干燥劑的離心管中，分別置于4 ℃和-20 ℃保存，貯藏90 d、180 d、270 d、360 d、450 d、540 d、630 d時，各取出1管進行花粉活力測定。以篩選出的最佳花粉萌發培養基進行花粉培養，各處理重復3次，每重復觀察3個視野，每個視野花粉總數不少于50粒，統計花粉萌發率。

1.2.3花粉萌發率及花粉管長度的測定

花粉培養參考趙宏波等[12]的方法并稍有改動，用吸管吸取一定量的培養液滴在載玻片上，用毛筆把花粉均勻地散在培養基上，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，室溫條件下培養6 h后用Olympus CX 31顯微鏡觀察并用攝像系統截取圖片。

花粉離體萌發以花粉管長于花粉直徑為標準。

花粉萌發率(%)=(視野內萌發的花粉數/視野內的花粉總數)×100%。

使用ImageJ圖像處理系統進行花粉管長度測量，每個處理每個重復隨機選擇10根花粉管測量；萌發數量不足10根的測量所有花粉管長度。

1.2.4雜交授粉方法

2018年5月13日，在北京市植物園月季育種基地進行雜交授粉。母本選用“金獎章”(R.‘Gold Medal’)及“粉后”(R.‘Queen Elizabeth’)2個月季品種，各挑選50朵即將開放的花苞，用鑷子小心地把雄蕊去除，套袋。2018年5月14日，用毛筆將貯藏的美薔薇花粉輕刷在母本柱頭上，套袋。2018年10月8日統計各雜交組合的結實率及單果種子數。

結實率(%)=(結實數/授粉數) ×100%;

單果種子數(粒)=收獲的種子總數/結實數。

1.3 數據處理

采用SPSS 16.0軟件進行數據分析；用OriginPro 9.1軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同因子對美薔薇花粉萌發的影響

對正交試驗結果進行主效應分析可知(表2、表3)，蔗糖、H3BO3、CaCl2、MgSO4·7 H2O、KNO3等5因子對美薔薇花粉萌發率及花粉管長度均有極顯著影響(p<0.01)。按影響大小排序，影響花粉萌發率的因子依次為CaCl2>蔗糖>MgSO4·7 H2O>KNO3>H3BO3(表2)，即CaCl2對美薔薇花粉萌發率影響最大，其次為蔗糖；影響花粉管長度的因子依次為CaCl2>蔗糖>KNO3>MgSO4·7 H2O>H3BO3(表3)。

表2 影響花粉萌發率的主效應分析

表3 影響花粉管長度的主效應分析

正交試驗均值(表4)表明，不同因子對花粉萌發的影響規律不完全相同。蔗糖濃度較低時(50～100 g·L-1)，隨著蔗糖濃度的增加，美薔薇花粉萌發率及花粉管長度均逐漸升高；濃度為100 g·L-1時花粉萌發率為19.00%，是蔗糖濃度為50 g·L-1時的3.2倍；花粉管長度為88.80 μm，是蔗糖濃度為50 g·L-1時的1.73倍；蔗糖濃度超過100 g·L-1時，花粉萌發率及花粉管長度隨蔗糖濃度的增加而逐漸下降，蔗糖濃度為200 g·L-1時花粉萌發率及花粉管長度均為最低；說明蔗糖最佳濃度為100 g·L-1，過高或過低均不利于美薔薇花粉萌發。不添加H3BO3時花粉萌發率較低、花粉管長度較短，分別為7.31%及41.53 μm；添加0.1 g·L-1H3BO3時，花粉萌發率及花粉管長度顯著提高至14.26%和67.23 μm；H3BO3濃度高于0.1 g·L-1時，花粉萌發率顯著降低；說明H3BO3最佳濃度為0.1 g·L-1，過高或過低均不利于美薔薇花粉萌發。不添加CaCl2時花粉萌發率為18.45%、花粉管長度為90.43 μm，顯著高于其他水平；CaCl2濃度為0.1 g·L-1時花粉萌發率及花粉管長度顯著降低，分別為10.09%和56.55 μm，說明添加CaCl2不利于美薔薇花粉萌發。MgSO4·7 H2O、KNO3對美薔薇花粉萌發率的影響趨勢類似，不添加MgSO4·7 H2O或KNO3時，花粉萌發率最低，隨著濃度的增加花粉萌發率顯著提高，較高濃度(0.2 g·L-1、0.3 g·L-1)時花粉萌發率無顯著差異；花粉管長度變化趨勢與花粉萌發率不同，雖然MgSO4·7 H2O濃度為0.3 g·L-1時、KNO3濃度為0.2 g·L-1時花粉管長度顯著高于其他水平，但在低濃度時，花粉管長度沒有隨濃度的增加而上升，MgSO4·7 H2O濃度為0.2 g·L-1、KNO3濃度為0.1 g·L-1時花粉管長度出現了顯著下降。

表4 不同因子水平對美薔薇花粉萌發率和花粉管長度的影響

2.2 不同營養成分組配對美薔薇花粉萌發的影響

綜合考慮花粉萌發率及花粉管長度(表4)可知，不同因子的最佳水平分別為：蔗糖為100 g·L-1，H3BO3為0.1 g·L-1，CaCl2為0，MgSO4·7 H2O為0.3 g·L-1，KNO3為0.2 g·L-1。這與正交試驗中的6號處理的培養基配比吻合(表1)。在正交試驗16個處理中，6號處理的花粉萌發率為40.26%、花粉管長度為166.77 μm，均顯著高于其他處理(表5)。因此可以推斷，美薔薇花粉萌發最佳培養基為6號培養基，即10%蔗糖+0.1 g·L-1H3BO3+0.3 g·L-1MgSO4·7 H2O+0.2 g·L-1KNO3。

表5 美薔薇花粉在正交試驗中的萌發率及花粉管長度

2.3 不同干燥劑對花粉活力的影響

4 ℃貯藏溫度下，無論是否使用干燥劑，美薔薇花粉活力都隨著貯藏時間的延長而降低(圖1)。貯藏90 d時，使用無水氯化鈣干燥劑的花粉萌發率最低，為27.33%；ck的花粉萌發率最高，為33.00%。貯藏180 d時，使用無水氯化鈣干燥劑的花粉萌發率較高，15.54%的花粉具有活力；使用硅膠干燥劑和ck的花粉活力較低，萌發率分別為11.50%和11.24%。方差分析表明，不同處理間的花粉萌發率無顯著差異，說明使用干燥劑并不能顯著延緩花粉活力的降低；無論是否使用干燥劑，4 ℃貯藏270 d時美薔薇花粉萌發率均低于10%。

圖1 不同干燥劑對美薔薇貯藏花粉活力的影響(p<0.05)Fig.1 Effects of different desiccant on pollen viability of Rosa bella pollen in storage(p<0.05)

2.4 不同貯藏溫度對花粉活力的影響

美薔薇花粉活力隨著貯藏時間的延長而下降，但不同溫度貯藏的花粉壽命不同(圖2)。4 ℃貯藏90 d時，花粉萌發率為33.00%；貯藏180 d時，花粉萌發率迅速降低，為11.33%；貯藏270 d時花粉萌發率低于10%；貯藏360 d的花粉不再萌發，失去活力。-20 ℃冷凍的花粉貯藏前期(90～270 d)活力下降較為緩慢，貯藏270 d時，花粉萌發率為32.71%，與新鮮花粉相比，萌發率僅降低了20.2%；貯藏270 d后，花粉萌發率迅速下降，貯藏360 d時花粉萌發率為19.88%，為新鮮花粉萌發率的48.5%；貯藏450 d時花粉萌發率不足10%；貯藏540 d時花粉萌發率為3.04%，基本喪失活力。-20 ℃更利于花粉長期保存。

圖2 不同貯藏時間不同貯藏溫度對美薔薇花粉活力的影響Fig.2 Effects of different storage times and temperatures on the vigor of Rosa bella pollen

2.5 利用雜交育種驗證貯藏花粉活力

利用貯藏330 d的美薔薇花粉與月季品種進行人工授粉，結果(表6)表明，4 ℃貯藏330 d的花粉與月季品種雜交后不能結實，花粉已失去活力。-20 ℃貯藏330 d的花粉與2個月季品種雜交后均可以結實，結實率均超過50%；美薔薇貯藏花粉與“粉后”及“金獎章”的雜交單果種子數分別為8.45粒和1.38粒。說明-20 ℃不添加干燥劑貯藏330 d的花粉具有活力，應用于月季雜交育種中是可行的。

表6 美薔薇花粉貯藏330 d后在雜交中的結實情況

3 結論與討論

花粉離體萌發受蔗糖、鈣、硼、生長素等多種因素的影響[8]。本研究中，蔗糖、鈣、硼、鎂、鉀等5因子均對美薔薇花粉萌發率及花粉管伸長有顯著影響。適宜美薔薇花粉萌發的蔗糖濃度為100 g·L-1，與單瓣黃刺玫花粉萌發研究結果一致[13]；也有研究認為，5%～8%[14]、15%[15]或20%[9]的蔗糖溶液更利于薔薇屬植物花粉的萌發，這種差異應該是由不同種類植物的花粉萌發特性差異導致。低濃度的H3BO3(0.1 g·L-1)顯著促進美薔薇花粉萌發，與王澤翻等[13]、王嵐嵐等[16]的研究結果相似。一般認為外源Ca2+可以促進花粉萌發[17]，但本研究結果表明，添加CaCl2不利于美薔薇花粉萌發，與短梗冬青花粉萌發條件[18]一致。鎂和鉀是植物體內重要元素，對油茶花粉萌發有明顯的促進作用[19]，但對核桃[17]和某些月季品種[16]花粉萌發沒有顯著影響。本研究結果顯示，高濃度的MgSO4·7 H2O或KNO3(0.2～0.3 g·L-1)可顯著提高花粉萌發率及花粉管長度；但MgSO4·7 H2O或KNO3濃度低于0.2 g·L-1時，花粉管長度并不隨濃度變化呈規律性變化，可能由于鈣或蔗糖對花粉管的伸長影響更大，且本研究未考慮不同因子間的交互作用，具體原因有待進一步研究。

適宜的花粉貯藏方法可以延長花粉壽命。有研究表明，比較干燥的環境(相對濕度30%～40%)中代謝過程減弱和呼吸作用降低，能夠較長時間保持花粉的活力[20]。本研究中，2種干燥劑不能顯著延緩美薔薇花粉活力的降低，可能由于花粉收集干燥時室內空氣相對濕度較低，花粉貯藏時已較為干燥，所以干燥劑的使用對花粉活力變化影響不大。本研究結果表明，貯藏溫度是影響花粉長期保存的主要因素，-20 ℃冷凍貯藏利于美薔薇花粉的長期保存，花粉活力可以保持一年以上，與Giovannini等[6]研究結果一致。

本研究中，美薔薇花粉萌發率偏低，最高萌發率為40.26%，顯著低于平陰玫瑰品種新鮮花粉萌發率(80%以上)[21]。一方面，花粉離體萌發受培養組分、培養溫度[17]、pH值[22]等多方面影響，具體萌發條件還需進一步優化。另一方面，花發育時期也是影響花粉活力的重要因素[15]，本研究中為了保證花粉純度，選擇收集的花苞均未開放，花粉萌發率偏低是否受花發育時期影響還需進一步研究。