西太平洋沿海石斑魚屬魚類DNA條形碼及分子系統進化研究

梁日深 唐豐壽 何浩斌 汪 健 李江濤 李清清 陳軼之 林 蠡 張 凱

(1. 仲愷農業工程學院動物科技學院, 廣東省水環境與水產品安全工程技術研究中心, 廣東省水禽健康養殖重點實驗室,廣州市水產病害與水禽養殖重點實驗室, 廣州 510225; 2. 深圳市里維生鮮科技開發有限公司, 深圳 518052)

石斑魚屬(Epinephelus)隸屬鱸形目(Perciformes), 鱸亞目(Percoidei), 鮨科(Serranidae)石斑魚亞科(Epinephelinae), 是石斑魚亞科中物種數量最多的一個屬, 廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶海域, 是珊瑚礁的重要魚類, 也是重要的海洋經濟名貴食用魚類。世界上石斑魚屬98種[1], 我國約40余種, 主要分布于東海及南海[2—6]。

形態上, 石斑魚屬魚類近緣物種十分相似, 許多種類在外部形態特征如體色和斑紋都非常接近,且許多種類體色與斑紋還會隨著個體的發育發生巨大變化, 幼魚與成魚的形態截然不同[1,3]。另外,在不同的生活環境及生理應激狀態下, 許多石斑魚的體色花紋會出現明顯變化, 給傳統基于外部性狀的系統分類帶來巨大的困擾, 許多種類的分類與命名存在巨大爭議[1—6]。如云紋石斑魚(Epinephelus moara)與褐石斑魚(Epinephelus bruneus), 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)與馬拉巴石斑魚(Epinephelus malabaricus), 均存在同種異名的分類爭議。在分子水平研究上, Craig等[7]最先針對東太平洋及西大西洋分布石斑魚類進行較為系統的分子分類學研究。而對于西太平洋分布的種類, 國內也有部分研究報道, 如丁少雄等[8]利用16S rRNA及莊軒等[9]利用Cytb基因分析我國近海20余種石斑魚屬魚類系統分類關系; 陳興漢等[10]基于Cytb基因分析南海10種石斑魚屬魚類的分類關系等。但上述研究主要是圍繞石斑魚亞科的研究中涉及部分石斑魚屬的種類, 針對西太平洋石斑魚屬的詳細系統演化關系研究還存在一定空白。

DNA條形碼(DNA Barcoding)技術是通過一個標準目的基因的DNA序列分析而進行物種鑒定的技術, 它能在分子水平上成功區分物種, 為物種分類提供一種快速有效的辨別方法[11,12]。在魚類上,該基因是線粒體細胞色素C 氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因5′端一段長度為648 bp 的片段, 在前期許多研究中已驗證其可作為許多魚類有效的DNA條形碼基因。如Pereira等[13]利用COⅠ條形碼序列對新熱帶區的254 種淡水魚類進行分子鑒定, 其中252 種魚類能被清晰區分, 并確定23個隱存種; 張楠等[14]基于DNA條形碼技術對江門沿岸海域夏季魚卵的鑒定, 獲得魚卵個體有效線粒體COⅠ序列信息217個, 成功鑒定魚卵5目14科19屬20種(未知種2種)。TMO-4C4是一個單拷貝的核基因, 被認為是與肌聯蛋白titin相似, 與肌肉組裝和靜息張力有關,最初由Streelman和Karl[15]分離, 目前國外廣泛用于魚類的系統發育研究[16—18], 解決了許多魚類分類爭議問題, 而國內利用TMO-4C4標記進行魚類系統進化研究的相對較少[19]。本研究選擇COⅠ和TMO-4C4基因, 線粒體DNA與核DNA標記相結合, 共同分析西太平洋35種石斑魚分子系統分類關系, 同時探討COⅠ基因在石斑魚屬物種分子鑒定的有效性,為解決石斑魚屬分類爭議問題及物種有效鑒定提供分子水平依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

石斑魚屬魚類樣品于2018—2019年在中國廣東、福建、海南和香港等沿海地區的水產市場及漁港碼頭進行野外采集, 另有部分種類采集于菲律賓、印度尼西亞和澳大利亞等西太平洋國家。最后共獲得石斑魚屬魚類樣品35種共142個個體。采集標本根據《Grouper of the World》[1]、《中國魚類分類檢索》[2]和《臺灣魚類志》[3]等主要分類資料進行初步形態鑒定。所有樣品取肌肉或鰭條于95%酒精中固定, 用于實驗室總基因組DNA的提取。石斑魚樣品種類與來源見表1。

表1 實驗材料的種類和采集地Tab. 1 Species and localities of experimental samples

1.2 總基因組DNA的提取

取約50 mg酒精固定的樣品組織, 利用動物組織DNA提取試劑盒 (天根生化科技有限公司), 按照使用說明書進行提取。最后提取的總基因組DNA溶解于100 μL滅菌蒸餾水, 電泳檢測, –20℃保存備用。

1.3 PCR擴增和測序

本研究擴增的基因片段為線粒體COⅠ基因與核基因TMO-4C4。參考文獻[20], 選擇擴增COⅠ基因片段的通用引物為COⅠ-F1: 5′-TCAACYAATCA YAAAGATATYGGCAC-3′和COⅠ-R1: 5′-ACTTCYG GGTGRCCRAARAATCA-3′。擴增TMO-4C4基因片段的引物為TMO-4C4-F1: 5′-GAAAAGAGT GTTTGAAAATGA-3′和TMO-4C4-R1: 5′-CATC GTGCTCCTGGGTGACAAAGT-3′[15]。PCR反應體系總體積為50 μL, 其中包括PCR Mix反應混合液(天根生化科技有限公司)25 μL、滅菌蒸餾水21 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA樣品2 μL。PCR反應條件為94℃預變性5min, 94℃變性30s,55℃退火30s, 72℃延伸1min, 設置35個循環, 最后72℃再延伸5min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 純化回收后送天一輝遠生物技術有限公司雙向測序。

1.4 數據分析方法

測序所得序列運用 BioEdit 軟件查看序列結果并輔助測序峰圖進行人工校正, 序列經NCBI的Blastn工具進行相似性檢索, 驗證序列的準確性。利用Clustal W[21]軟件進行排序比對, 去掉兩端冗余序列, 得到一致序列進行后續的分析計算。利用MEGA 7.0[22]軟件計算序列的堿基組成、序列轉換顛換值、保守位點、變異位點和遺傳距離(基于Kimura-2-Parameter模型)等數據。系統進化樹的構建采用最大似然法及貝葉斯法, 以石斑魚亞科的鰓棘鱸屬2種魚類作為外類群。利用jModelTest 2.1.5進行最佳進化模型預測[23], 最大似然樹在RAxML 8.0[24]軟件中完成, 分支的置信度采用重復抽樣分析方法,重復抽樣的次數為1000次。貝葉斯法分析在Mr Bayes 3.1.2[25]軟件中完成, 隨機選取起始樹, 計算1000000代, 取樣代數100, 系統進化樹節點置信度由后驗概率(Posterior probabilities)提供。

2 結果

2.1 序列特征分析

擴增獲得35種142個石斑魚個體COⅠ序列同源片段為636 bp, 利用MEGA 7.0軟件分析可知, 序列中 A、T、G和C 堿基平均含量分別為24.4%、29.9%、17.8%和27.9%, 其中 A+T 含量(54.3%)高于 G+C 含量(45.7%), 編碼212個氨基酸, 無堿基插入與缺失。在 636 bp編碼序列中, 密碼子第1位4種堿基含量差異不大, 其中G-1 (30.0%)最高, T-1(18%)最低; 密碼子第2位, T-2 含量(42.0%)最高, 明顯高于其他3種堿基, A-2(15.1%)最低; 密碼子第3位中T-3、A-3和C-3三種堿基含量相差不大, 而G-3含量最低(8.9%), 表現出明顯的反 G 偏倚。在 G+C含量中, 密碼子第 1位點 G+C 含量(55.9%)高于第2和第3位(42.5%, 38.7%)。此外, 在長度為 636 bp序列中, 除去外類群, 保守位點 403 個(63.4%), 變異位點 233(36.6%), 簡約性信息位點 205 (32.2%)。

在TMO-4C4基因中, 同源序列為486 bp, 編碼162個氨基酸。堿基A、T、G和C平均含量分別為28.2%、25.1%、27.1%和19.6%, A+T含量(53.3%)高于G + C(46.7%)。密碼子第1與第2位4種堿基含量差異較大, 密碼子第1位堿基含量最高為G-1(43.0%), 最低是C-1(14.2%), 密碼子第2位最高是A-2(37.6%), 最低是G-2(9.6%), 明顯的反G偏倚。而密碼子第3位4種堿基含量分布較為平均, 均在20%—30%。序列的保守位點443個(67.5%), 變異位點43個(32.5%), 簡約性信息位點23個(18.6%)。與COⅠ基因相比,TMO-4C4基因序列保守, 變異位點數遠低于COⅠ基因, 物種間序列差異性較小。

基于Kimura 2-Parameter 模型計算COⅠ與TMO-4C4基因序列轉換與顛換之比值分別為4.104和2.772, 兩基因轉換明顯大于顛換。另外, 基于DAMBE7[26]軟件對COⅠ與TMO-4C4基因轉換顛換突變飽和分析。根據分析所得的散點圖, 隨著遺傳距離的增大, 轉換與顛換均呈線性遞增趨勢, 轉換增加的速率大于顛換增加的速率, 顯示COⅠ與TMO-4C4基因均未突變飽和, 可用于后續進化樹的分析。另外, 匯總出COⅠ與TMO-4C4基因序列核苷酸平均變異情況(表2)。在COⅠ基因中, 相同堿基對平均555個, 轉換堿基對63個, 顛換堿基對18個;TMO-4C4基因相同堿基對平均479個, 轉換堿基對5個, 顛換堿基對2個。兩基因轉換與顛換均屬第3密碼子出現最多(表2)。這可能與密碼子第3位發生的堿基替換不易造成氨基酸突變, 而第 1和第 2位點的替換容易引起氨基酸突變有關。

表2 COⅠ與TMO-4C4基因片段堿基轉換和顛換數Tab. 2 Numbers of transition and transversion of COⅠ and TMO-4C4 gene sequences

利用MEGA 7.0基于Kimura 2-parameter模型計算出35種石斑魚COⅠ與TMO-4C4種內與種間遺傳距離。在COⅠ基因中, 除去外類群, 在35種石斑魚中, 種內遺傳距離為0.000—0.008, 其中吊橋石斑魚種內遺傳距離最大, 為0.008, 其次是波紋石斑魚與青石斑魚, 均為0.006, 其他種類種內遺傳距離均不大于0.005, 平均遺傳距離為0.0027, 顯著低于Hebert等[11]所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020(2%)。35種石斑魚屬魚類種間平均遺傳距離為0.144, 是種內平均遺傳距離的48倍, 其中種間遺傳距離最大為玳瑁石斑魚與網紋石斑魚(0.202), 其次是蜂巢石斑魚與霜點石斑魚(0.200); 種間遺傳距離最小為云紋石斑魚與褐石斑魚(0.027), 其次是斜帶石斑魚與馬拉巴石斑魚(0.036), 均大于Hebert等[11]設定的種間遺傳距離2%的遺傳差異。這表明COⅠ基因可以清晰區分石斑魚屬不同物種。

在TMO-4C4基因中, 遺傳距離是0.000—0.030,平均遺傳距離為0.015, 可知核基因TMO-4C4比線粒體基因COⅠ保守很多, 遺傳距離最大在南海石斑魚與鞍帶石斑魚之間(0.032), 其次是網紋石班魚與鞍帶石斑魚(0.029); 遺傳距離最小值為0.000, 兩物種間序列無顯著差異, 如褐石斑魚與云紋石斑魚,斜帶石斑魚與瑪拉巴石斑魚, 細點石斑魚與藍棕石斑魚等。TMO-4C4序列十分保守, 在親緣關系很近的物種間存在的遺傳差異極小, 甚至無法區分物種。

2.2 分子系統進化關系分析

基于COⅠ、TMO-4C4和COⅠ+TMO-4C4聯合序列, 以鰓棘鱸屬中2種鰓棘鱸作為外類群進行進化樹構建。根據jModelTest 2.1.5預測, 3種序列最佳核苷酸替代模型均為GTR + G + I, 系統進化樹利用最大似然法及貝葉斯法2種方法進行構建。每種序列基于2種方法構建的進化樹進行合并, 樹上的節點分別為最大似然法支持率及貝葉斯法后驗概率(圖1、圖2和圖3)。其中基于COⅠ+TMO-4C4聯合序列構建的進化樹各節點支持率及后驗概率相對較高, 物種分類地位比較清晰, 這里主要針對COⅠ+TMO-4C4聯合序列構建的系統進化樹進行分析。在進化樹上, 同種石斑魚不同個體均能聚在一起, 形成該石斑魚種內單系分支。鑒于個體樣品數量多, 在進化樹無法一一顯示, 故進化樹圖片僅匯總35種石斑魚種間聚類關系, 每種石斑魚后標明樣品個體數。35種石斑魚大致分成兩大類群, 類群Ⅰ由細點石斑魚和藍棕石斑魚等22種石斑魚聚成, 類群Ⅱ由吊橋石斑魚和小點石斑魚等13種石斑魚組成。兩大類群中親緣關系較近的石斑魚又聚成一些小分支, 部分物種在進化樹上以高支持率聚成姐妹種, 如細點石斑魚與藍棕石斑魚、白背石斑魚與花點石斑魚、吊橋石斑魚與小點石斑魚、螢點石斑魚與珊瑚石斑魚、云紋石斑魚與褐石斑魚、斜帶石斑魚與馬拉巴石斑魚等。

圖1 35種石斑魚屬魚類基于COⅠ序列利用最大似然法與貝葉斯法構建的分子系統進化樹Fig. 1 Molecular phylogenetic trees of 35 Epinephelus fish based on COⅠ sequences constructed by maximum likelihood and Bayesian inference method

圖2 35種石斑魚屬魚類基于TMO-4C4序列利用最大似然法與貝葉斯法構建的分子系統進化樹Fig. 2 Molecular phylogenetic trees of 35 Epinephelus fish based on TMO-4C4 sequences constructed by maximum likelihood and Bayesian inference method

圖3 基于COⅠ+TMO-4C4聯合序列利用最大似然法與貝葉斯法構建的石斑魚屬35種魚類分子系統進化樹Fig. 3 Molecular phylogenetic trees of 35 Epinephelus fish based on COⅠ+TMO-4C4 combined sequences constructed by maximum likelihood and Bayesian inference method

3 討論

3.1 COⅠ序列在石斑魚屬分類的可行性

前期研究表明,COⅠ基因在許多魚類上已被驗證可作為鑒定的標準DNA條形碼序列, 可有效區分物種。目前在慈鯛科[27]、鯉科[28]、石首魚科[29]、鲿科[30]和裂腹魚亞科[31]等魚類上均驗證COⅠ基因可作為其物種識別標準序列。Hebert等[11]對11個門13320個物種的COⅠ基因分析得出物種內的COⅠ遺傳距離基本小于2%。同時其提出, 利用COⅠ序列有效鑒定物種的關鍵是種間遺傳距離必須大于種內遺傳距離10倍以上。本研究的35種石斑魚共142個個體樣品中, 種內平均遺傳距離為0.003, 種間平均遺傳距離為0.143, 種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的47倍, 遠大于Hebert 等[11,12]提出的10倍差異值。另外, 石斑魚屬魚類種內遺傳距離為0.000—0.008, 均低于Hebert等[11]推薦的0.020(2%)作為物種鑒定最小遺傳距離; 種間遺傳距離為0.030—0.202, 均高于0.020(2%)的臨界值, 辨析度清晰?？梢奀OⅠ基因在石斑魚屬魚類的分子系統分類上, 可作為有效的DNA條形碼基因, 區分石斑魚屬內種間不同的物種。

3.2 基于DNA 條形碼序列的石斑魚屬魚類關系分析

石斑魚屬是石斑魚亞科中種類最多的一個屬,我國分布40余種[2—6], 本研究采集35種, 基本囊括目前我國分類資料有記載的常見代表種類, 具有一定代表性?；贑OⅠ及TMO-4C4基因構建的ML系統進化樹, 35種石斑魚形成兩個平行分支。這與丁少雄等[8]利用16S rRNA和莊軒等[9]利用Cytb構建的石斑魚類分子系統進化結果一致。Schoelinck等[32]對分布印度-西太平洋石斑魚亞科魚類研究同樣發現在石斑魚屬內存在2個分支。丁少雄等[8]在其西太平洋石斑魚研究基礎上結合東太平洋和大西洋石斑魚16S rRNA數據聯合分析發現, 石斑魚屬兩大分支依然存在。其推測石斑魚屬共同祖先在演化初期先分化為兩大支系, 兩大支系種類再進一步種間分化并輻射分布于全球各海區。本研究基于COⅠ及TMO-4C4構建的進化樹石斑魚也形成兩個分支, 聚類于兩分支上的石斑魚種類與前人研究基本一致[7,8,32], 結果也支持丁少雄等[8]關于石斑魚系統演化的觀點。

云紋石斑魚(E. moara)與褐石斑魚(E. bruneus)在前期分類研究中一直存在爭議[1—3,33—36]。Heemstra等[1]編著的《Groupers of the World》認為兩者是同種異名。Fishbase的魚類名錄中也僅記錄褐石斑魚(E. bruneus)的信息,E. moara為其同種異名[33]。而成慶泰等[2]所著《中國魚類系統檢索》中根據側線孔鱗數目差異、前鰓蓋骨隅角有大棘還是鋸齒認為褐石斑魚和云紋石斑魚是兩個不同物種。郭明蘭等[34]比較了云紋石斑魚與褐石斑魚體表形態及骨骼系統, 發現兩者存在顯著差異, 認為云紋石斑魚是區別于褐石斑魚的有效種。Liu等[35]基于外部形態特征及內部構造, 結合線粒體全基因組序列比較分析云紋石斑魚與褐石斑魚的差異, 支持云紋石斑魚是有效的物種。本研究測定分析了形態初步鑒定為云紋石斑魚與褐石斑魚的COⅠ序列差異,發現兩者遺傳距離為0.030, 大于 Hebert等[11]設定區分物種最小遺傳距離2%。系統進化樹上云紋石斑魚與褐石斑魚緊密聚為一支, 關系十分接近, 但兩者種內不同個體均能聚成獨立的物種單系分支, 沒有交叉聚集在一起, 進化樹的枝條長度也能有效把兩種魚區分, 因此本研究也支持前人研究的結果,認為云紋石斑魚和褐石斑魚是石斑魚屬2個獨立的物種, 不是同種異名[34,35]。

斜帶石斑魚與馬拉巴石斑魚(也叫點帶石斑魚)在分類上也長期存在爭議與混淆, 前期研究也存在把兩種石斑魚相互誤鑒的情況[33,36,37]?！吨袊~類系統檢索》[2]及《中國魚類分類及分布名錄》[6]僅有記載點帶石斑魚一種。而Heemstra等[1]根據幽門盲囊數的差異將斜帶石斑魚與馬拉巴石斑魚確定為2個種。沈世杰[2]主編的《臺灣魚類志》根據頭部與體部是否有白斑, 胸鰭鰭條數差異將斜帶石斑魚與點帶石斑魚區分開。但由于兩種魚體表斑點與花紋過于相似, 目前許多資料對這兩種石斑魚依然存在誤鑒, 在水產養殖生產中更是相互混淆, 存在混養與雜交的情況。本研究的斜帶石斑魚與馬拉巴石斑魚COⅠ基因遺傳距離為0.036,大于Hebert等[11]設定的2%臨界值, 遺傳分化達到種間水平。在進化樹上, 兩者緊密聚成姐妹分支, 但種內不同個體依然形成獨立的物種單系分支, 顯示是獨立的物種。

在系統進化樹上, 部分石斑魚以較高的支持率聚成緊密的姐妹分支, 如細點石斑魚與藍棕石斑魚、白背石斑魚與花點石斑魚、吻斑石斑魚與巨石斑魚、螢點石斑魚與珊瑚石斑魚等。比較這些石斑魚相互間形態特征, 在體型、斑紋和體色上均非常接近, 形態分類上也容易發生誤鑒[1,33]。如細點石斑魚與藍棕石斑魚身體均藍色, 尾鰭截形, 主要區別是細點石斑魚身體布滿黑色細小斑點, 而藍棕石斑魚無此特征。在石斑魚市場上兩者均稱為“藍瓜子斑”, 容易混淆, 也存在用藍棕石斑魚冒充細點石斑魚的現象。白背石斑魚與花點石斑魚斑紋異常相似, 兩者體呈棕褐色, 身體密布有棱角褐色斑點,淺色部分構成了網狀花紋, 背鰭基部均有黑白相間斑紋, 細微區別為白背石斑魚背鰭基部有一條貫通的白色帶, 而花點石斑魚沒有。吻斑石斑魚與巨石斑魚體色淡黃色, 背部存在多塊深色暗斑, 身體與各鰭均密布棕色小斑點, 巨石斑魚斑點偏圓形, 吻斑石斑魚斑點偏多邊形。螢點石斑魚與珊瑚石斑魚體灰褐色, 頭部尖, 體型修長, 尾鰭圓形, 螢點石斑魚身體具白色不規則圓斑, 珊瑚石斑魚具黑色斑點。在分子水平上, 部分前人研究構建的石斑魚亞科分子系統進化樹也顯示這些石斑魚存在較近的親緣關系, 進化樹上也聚集在一起[28,39]。本研究中, 在COⅠ遺傳距離上, 細點石斑魚與藍棕石斑魚(0.044)、白背石斑魚與花點石斑魚(0.056)、吻斑石斑魚與巨石斑魚(0.046)、螢點石斑魚與珊瑚石斑魚(0.063)相互間的遺傳距離也較小, 遠低于石斑魚屬種間平均遺傳距離(0.144), 表明許多石斑魚進化過程中,外觀表型進化與分子進化的趨勢一致, 形態相似的種類其分子水平也接近。該結果可為揭示石斑魚近緣物種分類關系, 澄清分類爭議提供理論依據,針對形態相似的類群, 結合分子水平信息, 可更科學有效明晰石斑魚屬各物種間的分類關系。