假交替單胞菌JMUZ2重組κ-卡拉膠酶的異源表達和酶學性質

張成昊，朱艷冰，陳艷紅，姜澤東，倪輝，李清彪，2

（1 集美大學食品與生物工程學院，福建廈門361021； 2 廈門大學化學化工學院，福建廈門361005）

引 言

卡拉膠（carrageenans）是從麒麟菜、石花菜、鹿角菜等紅藻類海草中提煉出來的水溶性硫酸化多糖，具有β-D-半乳糖和α-D-半乳糖通過β-1，4 糖苷鍵和α-1，3 糖苷鍵交替連接形成的骨架結構[1]?？ɡz因1,4-連接殘留物中存在或不存在3,6-脫水-D-半乳糖，以及硫酸鹽基團的數量和位置不同[2]，被分為kappa（κ-）、lambda（λ-）、iota（ι-）三種[3]，其中κ-卡拉膠是食品工業中常用的膠凝劑、增稠劑和穩定劑。

天然κ-卡拉膠分子量大，黏度高，溶解性差，不易吸收。研究表明，κ-卡拉膠的降解產物κ-卡拉膠寡糖分子量和黏度降低，溶解性好，易吸收，并且具有多種有益生物活性，包括免疫調節[4]、抗腫瘤[5]、抑制血管生成[6]、抗氧化[7]、抗病毒[8]等。目前，卡拉膠的降解方式主要有化學降解法[9-10]、物理降解法[11-12]和生物降解法[13-15]。其中，利用卡拉膠酶的酶解法制備卡拉膠寡糖具有專一性強、反應條件溫和、反應過程易于控制等優點，具有更強的應用優勢[16-17]。

κ-卡拉膠酶主要由海洋細菌產生，主要包括弧菌屬[18]、溶解噬纖維菌[19]、伸長假單胞菌[20]、食鹿角菜假交替單胞菌[21]和微泡菌屬[22]等。Liu等[23]從黃海腐爛海藻中分離到一株產κ-卡拉膠酶的細菌Pseudoalteromonas porphyraeLL1，對該菌株的胞外κ-卡拉膠酶進行純化，獲得分子量為40×103的κ-卡拉膠酶，該酶的最適溫度和最適pH 分別為55℃和8.0。Zhou 等[24]報道了假交替單胞菌WZUC10 的κ-卡拉膠酶，該酶的分子量為45×103，最適溫度和最適pH 分別為30℃和7.5。本研究將假交替單胞菌JMUZ2 κ-卡拉膠酶基因進行異源表達和純化，研究重組酶的酶學性質及酶解產物，為該κ-卡拉膠酶的工業化應用奠定理論基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

菌株和質粒：假交替單胞菌菌株JMUZ2 和大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）以及pET-28a 載體均由本實驗室保存。

主要試劑：T4 DNA 連接酶、Primer STAR?HS DNA Polymerase、EcoRI 和HindⅢ，TaKaRa 公司；金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠6FF，GE Healthcare Life Sciences 公司；κ-卡拉膠和ι-卡拉膠，深圳恒生生物科技有限公司；瓊膠，青島聚大藻業集團有限公司；海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉和巖藻聚糖，上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純產品。

1.2 κ-卡拉膠酶重組表達質粒的構建

卡拉膠酶基因的上游引物序列F: 5'-TATGAATTCTGCGAGTAGTGAGAGTTAGCTTAAC-3'（劃線部分為EcoRI 酶切位點），下游引物序列R：5'-CCCAAGCTTTAACTTGCTCATT-GTCACTTGCTT G-3'（劃線部分為HindIII 酶切位點）。以假交替單胞菌JMUZ2的基因組DNA為模板，進行卡拉膠酶基因擴增，反應程序：95℃預變性5 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 次循環；72℃延伸10 min。

PCR 產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，待大小正確后，用DNA 純化試劑盒進行純化回收。運用限制性內切酶分別對目的基因和表達載體進行酶切反應，瓊脂糖凝膠電泳后使用膠回收試劑盒純化回收PCR 產物后連接pET-28a 載體后轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，在含卡那霉素抗性培養基上培養，挑取陽性克隆進行菌液PCR 和測序驗證，從而獲得含有κ-卡拉膠酶表達載體pET-28acar。

1.3 κ-卡拉膠酶的誘導表達和純化

將含有重組質粒pET-28a-car 的菌液按照1%的接種量接種于50 ml LB 液體培養基（含50 μg/ml卡那霉素），37℃、180 r/min 培養12 h，進行菌種的活化，按照1%的接種量轉接到200 ml LB 液體培養基（含50 μg/ml 卡那霉素）中，37℃、180 r/min 培養至OD600達到0.6～0.8。加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，16℃低溫誘導表達18 ～ 24 h。將誘導表達的菌液于5000 r/min，4℃下冷凍離心15 min，舍去上清，菌體沉淀用15 ml 預冷的溶解緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，15 mmol/L 咪唑，pH 8.0）重新溶解。在冰浴條件下，進行超聲破碎，將破碎后的裂解液4℃、12000 r/min 離心25 min，獲得上清液，即為粗酶液。參照GE Healthcare Life Sciences公司的金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠6FF 使用說明書，利用親和層析對重組蛋白進行分離純化。采用SDSPAGE分析測定蛋白的分子量。

1.4 κ-卡拉膠酶的活力測定

利用DNS 法[25]測定酶的活力。取490 μl 含有κ-卡拉膠的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 8.0），加入10μl 重組酶，50℃反應15 min 后，加入500 μl DNS 試劑，沸水浴10 min 后室溫冷卻，于波長520 nm 處測定吸光值。以上述條件下每分鐘釋放1 μmol 半乳糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.5 κ-卡拉膠酶的酶學性質研究

1.5.1 底物專一性研究 將重組酶分別加入到含有0.5%（質量分數）的不同底物溶液（κ-卡拉膠、ι-卡拉膠、瓊膠、羧甲基纖維素鈉、巖藻聚糖和海藻酸鈉）中，利用DNS 法測定酶的活力，研究酶的底物專一性。

1.5.2 溫度對酶活性和穩定性的影響 在不同溫度下測定重組κ-卡拉膠酶活力，研究酶的最適反應溫度。將重組酶分別在不同溫度下放置1 h 后，測定酶的殘余活力，研究溫度對酶穩定性的影響。

1.5.3 pH 對酶活性的影響 分別在不同pH 條件下測定κ-卡拉膠酶的活力，研究酶的最適反應pH，所用緩沖液為50 mmol/L 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 3.0～6.0），磷酸鈉緩沖液（pH 6.0～8.0），Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0），甘氨酸-NaOH 緩沖液（pH 9.0～11.0）。

1.5.4 金屬離子對酶活性的影響 參照銀小倩等[26]方法進行金屬離子對酶活性影響測定。

1.5.5 添加試劑對酶活性的影響 將重組酶分別置于終濃度為1 mmol/L 和10 mmol/L 抑制劑EDTA和還原試劑（β-巰基乙醇和DTT）、0.1%和1%（質量分數或體積分數）去垢劑（SDS、Tween 20、Tween 80、Triton X-100 和CTAB）、2.5 mol/L 和5 mol/L 變性劑（尿素和鹽酸胍）中，25℃溫浴30 min后，測定酶的殘余活力，研究各種添加試劑對酶活性的影響，以未經添加試劑處理的酶活力為100%。

1.5.6 酶的動力學參數測定 測定重組酶在不同κ-卡拉膠底物濃度下的酶活力，利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法求出酶的Km和Vmax值。

1.6 κ-卡拉膠酶解終產物分析

重組酶（3 U）加入到10 ml 0.5%（質量濃度）κ-卡拉膠底物溶液中，40℃反應2 h 后，補加1.5 U κ-卡拉膠酶，繼續反應12 h 后補加6 U 酶，24 h 后再補加3 U 重組酶，繼續反應，并測定體系的還原糖含量，當還原糖含量穩定不再變化時，沸水浴滅活10 min，加入3 倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，離心取上清液，利用旋轉蒸發儀將無水乙醇去除，再用冷凍干燥儀將樣品凍干，獲得κ-卡拉膠酶解終產物。配制1.0 mg/ml 酶解產物溶液，經0.22 μm 微孔膜過濾，進樣量為5 μl 注入LC-MS 系統分析，LCMS條件參照Jiang等[25]的報道。

1.7 酶解產物的抗氧化活性測定

取1.6 節中的酶解產物，參照Zhu 等[27]的方法進行抗氧化活性測定。相同濃度條件下，以VC為陽性對照。

1.8 κ-卡拉膠酶的生物信息學分析

在碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzyme，CAZy）數據庫中搜索、下載來自不同家族的典型κ-卡拉膠酶的基因序列，利用ClustalX2 和MEGA7.0 軟件構建κ-卡拉膠酶的系統發育樹。運用ESPript 3.0 進行κ-卡拉膠酶蛋白質多序列比對分析。采用SMART 工具預測κ-卡拉膠酶的蛋白質結構域。利用SWISS-MODEL 進行蛋白質結構的三維模建，采用Discovery Studio 2019 軟件顯示蛋白質的空間結構。

2 實驗結果與討論

2.1 重組κ-卡拉膠酶的生物信息學分析

從本實驗室保存的假交替單胞菌JMUZ2 克隆得到κ-卡拉膠酶基因，該基因由1116 個堿基對組成（GenBank 登錄號為MW265950），編碼372個氨基酸殘基的蛋白質，理論分子量為41.8×103。與序列相似性高的其他卡拉膠酶的多重序列比對表明，該重組κ-卡拉膠酶含有EIDVVELTQ 保守區[圖1(a)，黑色框區域]。將目的蛋白序列與NCBI蛋白數據庫進行比對，結果表明，它與來源于Pseudoalteromonas tetraodonis的κ-卡拉膠酶（BAJ61957.1）有100%的相似性，與來源于Pseudoalteromonassp.P1-25 菌株的κ-卡拉膠酶（KPZ57234.1）有96.77%的相似性，與來源于Pseudoalteromonassp. QY203 的κ-卡拉膠酶（AFV39914.1）有96.51%的相似性。系統發育進化分析顯示，假交替單胞菌JMUZ2 κ-卡拉膠酶與來自Pseudoalteromonascarrageenovora（WP 104644224.1）的卡拉膠酶和來自Pseudoalteromonas distincta（WP 149602722.1）的卡拉膠酶在同一分支[圖1(b)]，而它們屬于GH16 家族代表成員，因此，假交替單胞菌JMUZ2的κ-卡拉膠酶屬于GH16家族。

結構域分析顯示，假交替單胞菌κ-卡拉膠酶包含編碼GH16 家族κ-卡拉膠酶功能域（7～270 位氨基酸殘基）和一個細菌免疫球蛋白結構域（294～371位氨基酸殘基）。將假交替單胞菌κ-卡拉膠酶的蛋白質序列通過SWISS-MODEL 進行三維模型的構建，模板為來自Zobellia galactanivorans的κ-卡拉膠酶晶體結構（PDB 登錄號5ocq.1.A），覆蓋范圍為2～272 位氨基酸，覆蓋率達68%，序列相似性高達97.46%。三維建模結果顯示，該結構覆蓋了κ-卡拉膠酶的催化結構域，富含β-折疊，由多個反向平行的β-折疊組成，呈β-果凍卷狀[圖2(a)]。將假交替單胞菌κ-卡拉膠與模板結構進行疊合發現二者的結構在空間位置上高度重疊，靠近N 端的Glu138 和Asp140 預測為假交替單胞菌κ-卡拉膠酶活性中心的催化殘基[圖2(b)]。

2.2 重組κ-卡拉膠酶的表達純化及底物特異性

利用Ni-NTA agarose 親和純化，得到重組κ-卡拉膠酶蛋白，SDS-PAGE 分析[圖3(a)]顯示，與對照（道2和道3）相比，誘導后陽性轉化子的樣品有明顯的融合蛋白表達條帶（道4），純化后獲得重組蛋白（道5），分子量大小為約48.8×103。以κ-卡拉膠為底物，該κ-卡拉膠酶的比活力達11.0 U/mg，略高于海洋細菌Pseudoalteromonas tetraodonisJAM-K142的κ-卡拉膠酶Cgk-K142 的比活力（8.1 U/mg）[28]。底物特異性分析結果如圖3（b）所示，重組酶對κ-卡拉膠有很好的水解作用，對ι-卡拉膠有較低的水解能力，對瓊膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉和巖藻多糖幾乎不降解，說明該酶對κ-卡拉膠具有良好的底物特異性，這與Kobayashi等[28]的κ-卡拉膠酶的底物特異性結果一致。

2.3 重組κ-卡拉膠酶的酶學性質

圖2 假交替單胞菌JMUZ2 κ-卡拉膠酶的三維建模（黃色:模板5ocq;藍色:所建模型）Fig.2 Three-dimensional modeling of κ-carrageenase from Pseudoalteromonas sp.JMUZ2

圖3 重組κ-卡拉膠酶的SDS-PAGE分析（a）和底物特異性（b）Fig.3 SDS-PAGE analysis(a)and substrate specificity(b)of the recombinant κ-carrageenase

圖4 溫度對重組κ-卡拉膠酶活性（a）和穩定性（b）的影響Fig.4 Effects of temperature on the enzymatic activity(a)and the thermal stability(b)of the recombinant κ-carrageenase

2.3.1 重組κ-卡拉膠酶的最適反應溫度和溫度穩定性 在不同溫度下測定重組κ-卡拉膠酶的活力，結果顯示，該κ-卡拉膠酶的最適反應溫度為50℃[圖4(a)]，高于來源于Pseudoalteromonassp. ZDY3 的κ-卡拉膠酶[29]（45℃）。該酶的溫度穩定性分析[圖4(b)]顯示，κ-卡拉膠酶在40℃處理1 h 后仍具有81.1% 的殘余活力；在45℃處理15 min，酶保留51.6%的殘余活力，繼續處理1.5 h 后，酶活力基本喪失；在50℃處理5 min，酶活力就降低至48.2%，處理1.5 h 后酶活力基本喪失。本研究中的κ-卡拉膠酶的溫度穩定性高于Pedobacter hainanensisNJ-02來源的κ-卡拉膠酶（在40℃放置1 h，保持70%酶活力）[30]、Zobelliasp.ZM-2來源的κ-卡拉膠酶（在45℃放置15 min，約有20%酶活力）[31]。

2.3.2 重組κ-卡拉膠酶的最適反應pH 在不同pH條件下測定重組κ-卡拉膠酶的活力，結果如圖5 所示，重組酶在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 8.0）時活力最高，而且相同pH 時，在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中的酶活力比Tris-HCl 緩沖液中高，這可能是因為Na+對酶活力有促進作用。另外，重組酶在pH 7.0～8.0 之間保持了較高的活力，而在pH 3.0 和11.0 時基本沒有活力。 來源于海洋細菌Pseudoalteromonas porphyrae[23]和Vibriosp. CA-1004[32]的κ-卡拉膠酶的最適pH 均為8.0，與本研究中菌株JMUZ2的κ-卡拉膠酶的最適pH相同。

2.3.3 金屬離子對重組κ-卡拉膠酶活性的影響

不同金屬離子對κ-卡拉膠酶穩定性的影響見圖6。從圖中可以看出，K+對重組酶基本沒有影響，低濃度的Na+對κ-卡拉膠酶也沒有影響，但高濃度時有促進作用。Mn2+、Mg2+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Zn2+對重組κ-卡拉膠酶表現出不同程度的抑制作用，高濃度的Cu2+、Fe2+和Fe3+對重組酶的抑制作用最顯著。Liu等[31]的研究結果同樣發現K+和Na+對來源于Zobelliasp. ZM-2 的κ-卡拉膠酶活性沒有影響，而Cu2+對該酶的抑制作用很顯著。

圖5 pH對重組κ-卡拉膠酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of the recombinant κ-carrageenase

圖6 金屬離子對重組κ-卡拉膠酶活性的影響Fig.6 Effects of metal ions on the activity of the recombinant κ-carrageenase

2.3.4 添加試劑對重組κ-卡拉膠酶活性的影響

從表1 可以看出，EDTA 對κ-卡拉膠酶沒有抑制作用。EDTA 是一種螯合劑，可以清除二價陽離子并使金屬離子依賴性酶失活，因此，本文中的重組κ-卡拉膠酶不是金屬離子依賴性酶。還原試劑β-巰基乙醇和DTT 對重組酶有抑制作用，硫醇還原劑可以作用于二硫鍵，改變酶的構象從而改變酶的活性。重組酶對Tween 20、Tween 80 和Triton X-100具有良好的抵抗能力，CTAB 和SDS 對κ-卡拉膠酶表現出強烈的抑制作用。另外，重組酶對2.5 mol/L的尿素和鹽酸胍變性劑具有一定的抵抗能力，這些性質使該酶在工業應用中具有一定潛力。

表1 添加試劑對重組κ-卡拉膠酶活性的影響Table 1 Effects of additives on the activity of the recombinant κ-carrageenase

圖7 重組κ-卡拉膠酶的雙倒數圖Fig.7 The Lineweaver-Burk of the recombinant κ-carrageenase

2.3.5 重組κ-卡拉膠酶的動力學參數 利用Lineweawer-Burk 雙倒數法測定κ-卡拉膠酶的動力學參數，結果如圖7 所示，計算獲得酶的Km和Vmax分別為1.0 mg/ml和32.8 U/mg。

2.4 κ-卡拉膠的酶解終產物鑒定

利用LC-MS 在負離子模式下檢測κ-卡拉膠的酶解產物，在2.85 min出現吸收峰[圖8(a)]，對該出峰時間物質進行MS 分析，結果如圖8(b)所示，在質核比m/z=403.27 處有一個顯著的信號峰，為κ-卡拉膠二糖（[An-G4S]-），在β-D-半乳糖端帶有一個硫酸基團；在m/z=394.30 有一個信號峰，為κ-卡拉膠四糖（[An - G4S]2-2），攜帶兩個硫酸基團。綜上，假交替單胞菌JMUZ2 重組κ-卡拉膠酶水解κ-卡拉膠的終產物為二糖和四糖，與利用Zobelliasp.ZL-4卡拉膠酶降解κ-卡拉膠的產物一致[33]。

2.5 酶解產物的抗氧化活性

圖8 酶解產物的LC-MS分析Fig.8 LC-MS analysis of the enzymatic hydrolysis products

圖9 酶解產物的抗氧化活性分析Fig.9 Antioxidant activity analysis of the enzymatic hydrolysis products

對κ-卡拉膠的酶解產物進行抗氧化活性分析，酶解產物清除·OH 自由基的能力是濃度依賴性的，從1 mg/ml 到12.5 mg/ml，酶解產物的自由基清除率顯著增加[圖9(a)]，當產物濃度為12.5 mg/ml 時，對·OH 自由基的清除率達到69%，接近于陽性對照VC的效果。由圖9(b)可知，酶解產物對DPPH自由基的清除作用也隨著濃度的增大而增強，產物濃度為12.5 mg/ml 時，對DPPH 自由基的清除率達到31%，陽性對照VC的清除率達到80%。由圖9(c)可知，隨著酶解產物濃度增加，其吸光值不斷增大，因此，還原能力不斷增強。由圖9(d)可知，ABTS 自由基與酶解產物濃度基本呈線性關系。當酶解產物濃度為3.0 mg/ml 時，對ABTS 自由基的清除率達到54%，陽性對照VC的ABTS 自由基的清除率達到89%。酶解產物的抗氧化分析表明，酶解產物具有ABTS、DPPH 和·OH 自由基清除能力以及還原能力，有一定的抗氧化活性，具有作為抗氧化產品的潛力。

3 結 論

本研究將假交替單胞菌的κ-卡拉膠酶進行異源表達、純化及酶學性質研究，并進行κ-卡拉膠酶解產物的抗氧化活性分析，得出以下結論。

（1）來源于假交替單胞菌JMUZ2的κ-卡拉膠酶屬于GH16家族，能專一性降解κ-卡拉膠。

（2）重組κ-卡拉膠酶的最適溫度和pH 分別為50℃和8.0，并具有較好的溫度穩定性和pH穩定性。

（3）重組κ-卡拉膠酶酶解κ-卡拉膠產生二糖和四糖，酶解產物具有一定的抗氧化活性。

假交替單胞菌JMUZ2 重組κ-卡拉膠酶的酶學性質研究為該酶的進一步性能優化，以及作為工具酶用于κ-卡拉膠寡糖制備及功能研究奠定基礎。