江蘇徐州地區鴨漿膜炎分離鑒定

趙曉錦，王姣，楊海明

摘 要：疫病防控是畜牧生產中非常重要的一環，漿膜炎癥作為困擾鴨養殖的一種疾病，亟待解決。本研究對徐州地區鴨漿膜炎病例進行細菌分離培養、PCR鑒定，并對分離到的11株鴨疫里默氏桿菌和19株大腸桿菌進行血清型鑒定。試驗結果明確鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌是引起漿膜炎的主因，徐州地區鴨疫里默氏桿菌的主要流行株為Ⅱ型和Ⅰ型，分離到的19種大腸桿菌血清型均不相同。研究結論為鴨漿膜炎的預防控制提供參考。

關鍵詞：櫻桃谷鴨;安全生產;漿膜炎;鴨疫里默氏桿菌;大腸桿菌

中圖分類號：S858.32? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? 文章編號：1673-1085（2021）7-0042-04

疾病是威脅鴨養殖產業的一個重要因素，鴨傳染性漿膜炎流行廣泛，危害嚴重，給鴨養殖產業造成巨大的經濟損失。低飼養密度加上良好的衛生環境以及全進全出的飼養方式下，鴨傳染性漿膜炎發病率較低[1]。但近年來，隨著鴨養殖規模不斷擴大，養殖密度增大，鴨傳染性漿膜炎的流行率呈現升高趨勢[2]。隨著養殖規模的擴大，疫病頻發造成藥物使用頻繁，盲目用藥導致無藥可用[3]。農業農村部第194號公告明確剔除了除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。未來養殖的發展趨勢必定是減抗，而疫苗的正確選用能夠推進減抗發展。為了推進畜牧業良好技術的研究和推廣，本文通過探索2019年徐州地區漿膜炎癥的發病原因，鑒定鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌的血清型，分析徐州地區流行菌株，為選擇最佳防病防疫程序提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 江蘇徐州以及周邊地區自養殖場。

1.1.2 檢測試劑 胰酪大豆胨瓊脂、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂、胰酪大豆胨液體培養基等試劑購自青島海博生物技術有限公司。細菌瓊脂粉，購自北京陸橋技術股份有限公司;氯化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司;小牛血清，購自平睿生物科技有限公司。2×含染料Taq預混PCR反應體系，StarGreen核酸染料10000×，50×TAE DNA Electrophoresis Buffer，購自GenStar北京康潤誠業生物科技有限公司。瓊脂糖，購自廣州賽國生物科技有限公司。革蘭染液，購自北京索萊寶科技有限公司。

試劑均按說明書制備要求進行配制。

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌上下游引物，由江蘇桂柳牧業集團有限公司提供，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

鴨疫里默氏桿菌血清Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅶ型定型血清，大腸桿菌O血清因子為O78，均由山東農業科學院家禽研究所提供。未檢測出大腸桿菌由江蘇桂柳牧業集團有限公司送外檢測（江蘇農牧科技職業技術學院）。

1.1.3 試驗儀器 DNP-9082電熱恒溫培養箱、CX23光學顯微鏡、TC-96/G/H（b）C基因擴增儀、Tanon-1600全自動數碼凝膠圖像處理系統、M1-L213B微波爐、HE-120水平電泳槽、ESP-300水平電泳儀、721N分光光度計、LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養 對送檢的病死鴨進行解剖，取內臟和腦進行無菌分離，接種于含5 %小牛血清的胰酪大豆胨瓊脂平板，置玻璃干燥皿中，皿中放入點燃蠟燭，放在37 ℃培養箱培養24～48 h，觀察菌落形態。對分離出的細菌進行純化，對疑似鴨疫里默氏桿菌或大腸桿菌的菌落進行染色，革蘭染色后使用光學顯微鏡1000×油鏡下觀察，記錄細菌形態。將疑似大腸桿菌的菌落劃在麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板上，置于37 ℃的溫箱培養24 h，觀察菌落顏色、形態。

1.2.2 分子鑒定 取純化后疑似和未鑒定的細菌作為模板，設置鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照。

PCR反應體系為10 μM上下游引物（表1）各0.5 ?L、2× Taq PCR StraMix 12.5 ?L、dd H2O 9.5 ?L、模板2 ?L。

PCR反應條件設置為94 ℃預變性2 min;94 ℃變性 30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30個循環;72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫至停止反應。

取PCR反應產物3 ?L，加入含StarGreen核酸染料的1 %瓊脂糖凝膠板樣品孔中，放入水平電泳儀中，150 V穩壓電泳 30 min，凝膠成像處理系統觀察結果。

1.2.3 血清型鑒定

1.2.3.1 抗原制備 取分離純化后的大腸桿菌接種于胰酪大豆胨液體培養基中，鴨疫里默氏桿菌接種于含5 %小牛血清的胰酪大豆胨液體培養基中，37 ℃培養箱培養24 h，100 ℃水浴2 h，5000 r/min離心20 min，取上清，制備成相應的抗原。

1.2.3.2 鴨疫里默氏桿菌血清型鑒定 用生理鹽水配制1.5 %瓊脂板，梅花打孔器打孔，并用針頭挑去孔中瓊脂，用酒精燈微烤平板底部封底。在中心孔中加入10 ?L鴨疫里默氏桿菌血清，在周圍孔加入10 ?L制備抗原。將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內，于37 ℃溫箱內放置 24 h后觀察結果。

1.2.3.3 大腸桿菌血清型鑒定 分別取10 ?L菌體抗原和大腸桿菌O78血清置于玻板上混勻。明顯凝集者為陽性，同時以菌體抗原與生理鹽水混合物作陰性對照。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

2019年從徐州及其周邊接收到剖檢疑似漿膜炎病例32份，有27份分離到疑似鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌菌落，在含5 %小牛血清的胰酪大豆胨瓊脂平板上進行分離培養，圓形邊緣整齊，表面光滑，透明，菌落較小，邊緣泛熒光，生長較慢，在32 h后生長才較好，判定為鴨疫里默氏桿菌疑似菌落（圖1 A）;圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起，生長較快，16 h內生長較密，判定為大腸桿菌疑似菌落（圖1 B）。革蘭氏染色后使用光學顯微鏡1000×油鏡下觀察，鴨疫里默氏桿菌為革蘭氏陰性桿菌，菌體較小，少數呈雙排列或長絲狀（圖1 C）。大腸桿菌為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓的短小桿菌，多單在、偶有2～3個菌體相連（圖1 D），所有疑似大腸桿菌的菌落在麥康凱瓊脂平板上均呈桃紅色（圖1 E），在伊紅美藍瓊脂平板上均呈現金屬光澤（圖1 F）。而疑似鴨疫里默氏桿菌在兩種培養基上均不生長。

從徐州市及其周邊搜集到的32份漿膜炎疑似病例檢測出鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌菌落陽性率為84.4 %（27/32）。其中，大腸桿菌和鴨疫里默氏桿混合感染為2例，表明大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌是引起漿膜炎的主要原因。大腸桿菌分離到19例，占相關病例的59.4 %，且多引起產蛋鴨產蛋下降，說明大腸桿菌對種鴨的危害大于鴨疫里默氏桿菌，此外，通過臨床剖檢發現漿膜炎亦是造成鴨腿病的重要致病因素。

2.2 分子鑒定結果與分析

分別對11株鴨疫里默氏桿菌菌株及19株大腸桿菌菌株進行PCR驗證，其中鴨疫里默氏桿菌目的條帶為690 bp，鴨疫里默氏桿菌PCR鑒定結果見圖2 A;大腸桿菌目的條帶為400 bp，大腸桿菌PCR鑒定結果見圖2 B。PCR陽性對照送生工生物工程（上海）股份有限公司檢測確定為陽性。

2.3 血清型鑒定結果與分析

2.3.1 鴨疫里默氏桿菌血清型鑒定結果與分析 鴨疫里默氏桿菌抗原與陽性血清抗體孔間形成一條沉淀線，說明鴨疫里默氏桿菌抗原與相對應的血清抗體可以發生特異性結合，表明鴨疫里默氏桿菌對應的血清型為陽性血清的血清型。徐州及周邊地區鴨疫里默氏桿菌血清型比例見表2。

鴨疫里默氏桿菌主要血清型為Ⅱ型和Ⅰ型，Ⅶ型僅1例，占9.09 %，防治重點在Ⅱ型和Ⅰ型血清型，與之不同的是Ⅶ型發病不多，混合感染會造成較大的傷亡，應引起重視。

2.3.2 大腸桿菌血清型鑒定結果與分析 利用玻板凝集試驗，測定血清型，結果顯示：大腸桿菌的血清型較為復雜，凝集試驗結果顯示，O78僅有一例，其余血清型分別為O1、O4、O6、O11、O12、O14、O17、O26、O40、O88、O91、O103、O128、O132、O133、O138、O141，此外一例檢測結果為多凝集，無法準確判定。分離到的19 種血清型全不相同，給免疫帶來極大的困擾。

3 討論

本試驗發現徐州地區鴨疫里默氏桿菌主要血清型為Ⅱ型，占63.64 %;其次為Ⅰ型，占27.27 %;Ⅶ型僅一例，占9.09 %，與往年調查趨勢大致相同[4]，亦與我國主流血清型相同[5]。大腸桿菌的血清型較為復雜，很多報道都認為O78為優勢血清型[6]，凝集試驗結果顯示，O78血清型并不是本地優勢血清型，分離到的19 種血清型全不相同，給免疫帶來極大的困擾。

漿膜炎的防治應該從管理措施、免疫防治和藥物治療三個方面著手[7]。在臨床病例描述中，發現鴨群飼養密度和衛生條件與漿膜炎的發生密切相關，因而保持合適的飼養密度和改善鴨場衛生條件對漿膜炎的預防至關重要。接種疫苗可以有效預防漿膜炎的發生，對于鴨疫里默氏桿菌，徐州地區的養殖戶可以選擇Ⅱ型和Ⅰ型疫苗進行接種，大腸桿菌血清型復雜，應該嘗試新型疫苗，例如轉基因疫苗等，能夠抵抗不同血清型的侵擾。鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌耐藥性增加，在臨床治療中，應根據藥敏試驗結果選擇用藥，不能長時間使用同一種藥物，也可選擇中藥進行預防治療。

4 結論

大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌是引起漿膜炎的主要原因，江蘇徐州地區2019年度，鴨疫里默氏桿菌主要流行的血清型為Ⅱ型和Ⅰ型，偶見Ⅶ型，而分離到的19種大腸桿菌的血清型分別為O1、O4、O6、O11、O12、O14、O17、O26、O40、O78、O88、O91、O103、O128、O132、O133、O138、O141，各不相同。

參考文獻：

[1]? 唐彩琰，Sara Perez.鴨疫里默氏桿菌感染的全球重要性[J].國外畜牧學（豬與禽），2017，37（10）：21-22.

[2] 沈貴榮，楊月萍.鴨傳染性漿膜炎流行特點及防控措施[J].畜牧獸醫科學（電子版），2019（19）：107-108.

[3] 覃春倫.藥物防治鴨病講究多[J].吉林畜牧獸醫，2015，36（07）：43-44.

[4] 王書峰.鴨傳染性漿膜炎的流行病學、鑒別及防治措施[J].現代畜牧科技，2019（11）：112-113.

[5] 錢學智.徐州地區鴨疫里默氏桿菌病的流行病學調查[J].中國畜禽種業，2011，7（11）：126-129.

[6] 吳彩艷，程淑琴，張建峰，等.我國鴨疫里氏桿菌病流行概述[J].動物醫學進展，2017，38（06）：86-90.

[7] 蘇敬良，黃瑜，胡薛英.鴨病學[M].北京：中國農業大學出版社，2016，12：243，268.