歐亞旋覆花總黃酮對肢體缺血再灌注骨骼肌影響的研究

楊盺宇

【摘要】目的：探討歐亞旋覆花總黃酮（total flavones extracted from Inula britannica L，TFIB）對肢體缺血再灌注骨骼肌的保護作用。方法：健康成年家兔20只，隨機分為對照組和實驗組，每組10只，建立兔肢體缺血再灌注損傷動物模型。在即將恢復血流灌注時，兩組分別自耳緣靜脈注射生理鹽水（對照組）、歐亞旋覆花總黃酮注射液（實驗組）。分別在缺血前、缺血后2h、再灌注后1h、再灌注后3h采集術側股靜脈血樣。測定血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）的含量。取上述各時相點動物脛前肌組織，測定骨骼肌組織濕/干重比值并觀察肌組織微細和超微結構變化。結果：實驗組再灌注后LDH、CK明顯低于對照組（P<0.01），骨骼肌組織濕/干重比值低于同期對照組（P<0.05）。光鏡及電鏡下觀察實驗組骨骼機損傷輕于對照組。結論：歐亞旋覆花總黃酮能夠緩解組織水腫，保護缺血再灌注骨骼機。

【關鍵詞】歐亞旋覆花總黃酮;骨骼肌;再灌注損傷

【中圖分類號】R681;【文獻標識碼】A; 【文章編號】2026-5328（2021）02-025-05

Abstract：Objective：To study the protective effect and mechanism of Total flavones extracted from Inula britannica L （TFIB）on ischemia reperfusion injury of skeletal muscle. Methods：The experimental model of ischemia reperfusion injury in extremity were produced in 20 healthy adult rabbits which were randomly divided

into experimental and control groups（each of 10 rabbits）. Normal saline injection and TFIB were infused intravenously into rabbits of control group，experimental group respectively just before blood reperfusion. At preischemia，2 hours post-ischemia，1 hour post-reperfusion and 3 hours post-reperfusion，sample of blood was collected from the femoral veins respectively for measurements of lactic dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK） by means of biochemical methods in every rabbit. Meanwhile the tibialis anterior muscles were harvested for the measurements of Wet/Dry ratio of skeletal muscle and for the microscope and ultrastructure examinations by using optical microscope and electronic microscope respectively . Results ：After reperfusion，the contents of LDH、CK were dramatically higher in control group（P<0.01） but were not in experimental group（P>0.05）. The Wet/Dry ratio of skeletal muscle had not obvious difference in every group（P>0.05） before reperfusioin. The skeletal muscle injury of experimental groups，after reperfusion was of a mild degree than of control group in light microscope and electronic microscope examinations. Conclusion：TFIB can effectively improve soft tissue swelling and protec skeletal muscle from ischemia reperfusion injury.

Key words：Total flavones extracted from Inula britannica L;Skeletal muscle; Reperfusion injury

肢體的創傷、斷肢再植、血栓形成、組織移植以及止血帶的應用時間過長均可引起肢體缺血。隨著血流的恢復，在隨后的一段時間內組織損傷不僅不減輕反而逐漸加重，這種現象稱為肢體缺血再灌注損傷。它不僅影響缺血肢體組織的存活及功能，而且可累及全身多器官，嚴重時可引發多器官功能衰竭而導致患者死亡[1，2]。歐亞旋覆花是菊科旋覆花屬，多年生草本植物，性味咸、溫;入肺、腎經。其黃酮類物質的含量高達10.9%，黃酮類化合物具有清除自由基和抗應激反應的能力。歐亞旋覆花含有槲皮素、木犀草素、槲皮苷等多種黃酮類化合物，具有抗氧化活性[3，4]。有報道歐亞旋覆花總黃酮（ total flavones extracted from Inula Britannica L.，TFIB）注射液在休克、腎損傷、大腦缺血再灌注損傷中有保護作用[5、6]。然而有關歐亞旋覆花總黃酮對肢體缺血再灌注損傷的作用，目前尚無報道。本文用家兔肢體缺血再灌注損傷模型，探討中藥制劑歐亞旋覆花總黃酮對肢體缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料與方法

1.1 歐亞旋覆花總黃酮的制備

取歐亞旋覆花適量加10倍量水，回流提取3 次，1 h/次，合并提取液濃縮;然后用AB-8大孔吸附樹脂柱富集，提取物上樣濃度為0.2 g/ml，用70%乙醇進行洗脫，冷凍干燥，測得總黃酮含量為89.5%[7]。

1.2 動物分組及模型的建立

健康成年家兔20只，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。參照Crinnion等方法[8，9]建立肢體缺血再灌注損傷動物模型。術前12h禁食，3%戊巴比妥鈉（40～60mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉。無菌手術暴露左大腿股血管鞘，于腹股溝韌帶處用微血管夾阻斷股動、靜脈，在阻斷處以下用橡皮帶彈性環扎以阻斷側支循環。2h后取下橡皮帶和血管夾，恢復肢體血供。在即將恢復血流再灌注時，從耳緣靜脈注射歐亞旋覆花總黃酮注射液（50 mg/kg），對照組從耳緣靜脈注射生理鹽水注射液2ml。

1.3 檢測項目及方法

對照組和實驗組分別在缺血前、缺血后2h、再灌注后1h、再灌注后3h4個時相點自術側股靜脈采集血樣，并取術側脛前肌組織。

血清LDH、CK的測定：采用美國貝克曼CX-4型全自動生化分析儀測定血清中LDH、CK的含量（U/L）[10，11]。LDH、CK測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

骨骼肌組織濕/干重比值的測定： 取上述各時相點動物小塊脛前肌肉標本稱濕重后，置60℃恒溫箱中，60h后稱骨骼肌干重，然后計算骨骼肌組織濕/干重比值。

石蠟切片制備及光鏡觀察： 每組任選2只動物骨骼肌標本切成2cm×1 cm×0.5cm大小的組織塊，固定于標本筐中，然后置于4%多聚甲醛液中固定6h。常規梯度乙醇脫水，透明，包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并照相（每組取4個樣本，每樣本做4張切片，包括肌纖維縱橫兩個切面）。

超薄切片制備及電鏡觀察：將上述肌肉標本切成1mm3大小的組織塊，經3%戊二醛液4℃前固定，0.2M二甲胂酸鈉緩沖液沖洗，1%鋨酸4℃后固定，常規梯度上行乙醇脫水，Epon812包埋劑浸透、包埋，超薄切片，H-7500型透射電鏡觀察并攝片。

1.4 統計學處理

所得數據用均數加減標準差表示（），統計學處理采用t檢驗。P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 血清中LDH、CK變化

血清LDH變化（表1）： 對照組再灌注后LDH明顯增高（P <0.01）。再灌注后實驗組LDH明顯低于對照組（P <0.01）。

2.3 顯微結構的變化

光鏡觀察：缺血后2h鏡下見橫紋肌纖維輕度變性（濁腫），部分橫紋可見，肌核存在。再灌注后1h和再灌注后3h對照組見肌纖維明顯水腫，橫紋消失，部分區域肌核消失，胞漿凝固，肌核固縮（圖A）。再灌注后1h和再灌注后3h實驗組表現部分肌纖維輕度腫脹，間質水腫，肌核接近正常（圖B）。

透射電鏡觀察：缺血2h后見肌纖維邊緣線粒體有髓樣變，糖原、內皮細胞改變不明顯。對照組再灌注后3h顯示線粒體髓泡樣變和空泡樣變、嵴斷裂、糖原顆粒減少、雙側終池電子密度增高、橫小管粗細不等（圖C）。實驗組再灌注后3h三聯體、糖原顆粒較對照組增多，但肌纖維旁有髓樣變線粒體，三聯體較對照組完整（圖D）。

3 討論

本實驗結果顯示，血清中LDH、CK在缺血后2h較缺血前都有所升高，但升高不明顯;再灌注后對照組較缺血前和缺血后2h明顯升高（P<0.01）。光鏡及電鏡觀察也發現骨骼肌在缺血后2h已出現損傷，但并不甚嚴重，再灌注后骨骼肌細胞損傷則非常明顯，說明再灌注后細胞的損害并未停止而是進一步加重，即發生了缺血再灌注損傷。再灌注后3h血清LDH、CK兩組均高于再灌注后1h，尤以對照組明顯，提示可能在肢體缺血再灌注損傷后的一定時間內，灌注的時間越長則組織的損傷程度越重。而歐亞旋覆花總黃酮可減輕骨骼肌缺血再灌注損傷。用藥后LDH、CK含量明顯下降（P<0.01），說明對LDH、CK的釋放有明顯的抑制作用，保護組織細胞膜結構和功能的完整性，減輕骨骼肌細胞損傷程度。光鏡及電鏡的觀察結果也表明實驗組肌細胞損傷程度較同期對照組明顯減輕。

骨骼肌組織濕/干重比值可反映組織損傷后水種程度。組織受損時，花生四烯酸代謝產物增多，吸收大量炎性細胞進入組織或粘附于血管內皮。由于炎性細胞浸潤毛細血管壁，增加血管通透性，導致組織細胞水腫。隨著骨骼肌組織損傷程度進一步加重，組織細胞水腫進一步增加，骨骼肌組織濕/干重比值明顯增大。

實驗結果顯示再灌注后兩組骨骼肌組織濕/干重比值較缺血前和缺血后2h有所升高，而實驗組骨骼肌組織濕/干重比值則低于對照組。光鏡及電鏡觀察到實驗組組織水種程度較對照組明顯減輕。說明歐亞旋覆花總黃酮具有顯著的消腫作用，其消腫機制可能是一方面通過藥物的物理作用，它有明顯高滲脫水作用，減少水流入細胞內，將細胞內水分吸出細胞外，維持細胞容積，防止細胞及細胞器破裂;另一方面通過藥物的化學作用，它能夠清除氧自由基，通過阻斷自由基的連鎖反應，減輕氧自由基對骨骼肌細胞膜的脂質過氧化的損傷，保護內源性SOD和GSH活力，改善肌細胞代謝[3，4]。

缺血再灌注損傷機制非常復雜，已知有許多因素參與再灌注損傷過程，如自由基、興奮性神經遞質效應、細胞內鈣離子超載、一氧化氮、炎性介質損傷等[5～6]，目前認為自由基損傷在其中發揮著重要的作用[7]。

本試驗結果表明，歐亞旋覆花總黃酮對骨骼肌缺血再灌注損傷有保護作用。歐亞旋覆花總黃酮作為中藥制劑，不存在排異反應;藥源廣泛，無明顯毒副作用;歐亞旋覆花總黃酮具有吸收迅速、分布廣泛的特點。因此，歐亞旋覆花總黃酮可應用于骨骼肌缺血再灌注損傷的治療。

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【作者簡介】楊昕宇，（1999-04），女，蒙，內蒙古通遼市，本科，臨床藥學系。