基于蘆丁分子印跡殼聚糖-離子液體功能化石墨烯-碳納米管的電化學傳感器的制備及應用

王 苑, 趙發瓊, 曾百肇*

(武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072)

蘆丁廣泛存在于蕎麥、漿果及草藥中，因其具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用而常被用于一些疾病的治療[1]。常見的蘆丁檢測方法有化學發光法[2]、高效液相色譜法[3]、分光光度法[4]和毛細管電泳法[5]等。此外，由于蘆丁具有良好的電活性，因此，用電化學法直接檢測蘆丁也有不少報道[6]。采用電化學傳感器檢測時，為了提高選擇性常需引入分子識別元素。分子印跡聚合物(MIPs)因有良好的選擇性、化學和物理穩定性等而常被用于此目的[7]。MIPs的制備方法有化學、電化學和物理方法等，其中物理方法相對較簡便。物理方法印跡的單體一般為帶功能基的大分子。

本工作中，我們用簡單的一步水熱法制備了具有3D網狀結構的離子液體功能化石墨烯-碳納米管復合材料(GN-CNTs-IL)。然后，將殼聚糖與蘆丁混合，再進一步與GN-CNTs-IL混合，加戊二醛交聯。以此制備分子印跡殼聚糖電化學傳感器，用于蘆丁的檢測。結果表明，該傳感器表現出良好的分析性能，而目前尚無采用該方法制備傳感器的報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660D電化學工作站(上海辰華儀器公司)，實驗采用三電極體系:以修飾玻碳電極(GCE，直徑3 mm)為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。Zeiss掃描電子顯微鏡(SEM)(英國，卡爾蔡司公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子株會社)；Bruker D8 X-射線衍射(XRD)儀(德國)，配Cu Kα輻射(40 kV，40 mA)。

氧化石墨烯(GO，99%)和碳納米管(CNTs，95%)購自南京先鋒納米材料科技有限公司；蘆丁購自國藥集團化學試劑有限公司，殼聚糖(CS)(脫乙酰度≥95%，粘度100～200 mpa.s)和戊二醛(GA，50%)購于上海阿拉丁有限公司。0.10 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=5.5)由Na2HPO4和NaH2PO4配制。其它試劑均為分析純，所有溶液均用超純水配制。

1.2 GN-CNTs-IL復合材料的制備

首先，在攪拌下向35 mL GO水分散液中(0.50 mg/mL)加入21.0 mg的離子液體1-氨丙基3-甲基咪唑溴([APMIM]Br)，此時分散液產生大量絮狀沉淀。接著，加入30 mg KOH，超聲30 min，分散液變均一透明。然后，加入10 mg CNTs且超聲混合2 h。再將上述混合液轉入聚四氟乙烯反應釜中，在溫度180 ℃下反應12 h。待反應釜溫度降至室溫后，所得產物依次用乙醇和超純水清洗至中性，真空干燥即得GN-CNTs-IL。

1.3 分子印跡電化學傳感器的制備

將10 mg CS粉末溶于5 mL 0.2%HAc溶液中，在室溫下超聲處理1 h制備CS溶液。取4.95 mL CS溶液和50 μL蘆丁溶液(0.010 mol/L)于小燒杯中，攪拌3 h后，加入10 mg GN-CNTs-IL復合物，超聲20 min。再加入5 μL交聯劑GA(1%，V/V)，并在室溫下繼續攪拌30 min。產物冷凍干燥后配制成2.0 mg/mL的溶液，然后取6 μL分散液滴加到GCE上，自然干燥。接著，在磁力攪拌下用0.05 mol/L NaOH溶液處理電極5 min以去除蘆丁分子。最后，所得電極(MIPs/GN-CNTs-IL/GCE)用超純水洗滌，干燥備用。用相同方法制備非印跡電極，記為NIPs/GN-CNTs-IL/GCE；不加GN-CNTs-IL復合物用同樣的方法制備MIPs/GCE。

1.4 電化學檢測

將洗脫后的修飾電極浸入含一定濃度蘆丁的0.10 mol/L PBS(pH=5.5)中，開路下富集10 min，再在0.2～0.8 V范圍內進行差分脈沖伏安(DPV)掃描，測量在0.5 V處出現的蘆丁氧化峰。電化學阻抗(EIS)實驗在含有0.10 mol/L KCl和5.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行。

1.5 樣品制備

蕎麥茶樣品的制備參考文獻方法[17]，首先用研缽將樣品研成粉末，然后用乙醇超聲提取粉狀樣品(0.100 g)，離心后將上清液置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，放在4 ℃冰箱中避光保存。復方蘆丁片研碎后分散于甲醇中，超聲10 min，離心后取1 mL溶液用甲醇稀釋至10 mL。

2 結果與討論

2.1 MIPs/GN-CNTs-IL/GCE的表征

不同材料的形貌和結構如圖1所示。GN為表面光滑有褶皺的片層結構，引入IL后褶皺變多，層狀更明顯，這與IL在一定程度上可阻止GN團聚有關[18]。CNTs通過π-π相互作用進入GN片層間，使得GN-CNTs-IL呈多孔結構。經GA交聯后的殼聚糖印跡膜MIPs/GN-CNTs-IL(圖1D)保持了GN-CNTs-IL的多孔結構，但孔徑更小更密。圖1E和圖1F分別是GN-IL和GN-CNTs-IL的TEM圖，表明卷曲的CNTs雜亂地連接在石墨烯片層間，而IL則附著在GN褶皺上和CNTs表面。

圖1 GN(A)、GN-IL(B)、GN-CNTs-IL(C)、MIPs/GN-CNTs-IL/GCE(D)的SEM圖像；GN-IL(E)和GN-CNTs-IL(F)的TEM圖像Fig.1 SEM images of GN(A),GN-IL(B),GN-CNTs-IL(C) and MIPs/GN-CNTs-IL/GCE(D);TEM images of GN-IL(E) and GN-CNTs-IL(F)

圖2所示為制備的幾種電化學傳感器的EIS譜圖?？梢?，GN-CNTs-IL/GCE的電子傳遞電阻很??；當有了印跡層后，阻抗較大(曲線b,900 Ω)，表明印跡層導電性較差，對[Fe(CN)6]3-/4-的電化學反應有較大阻礙作用。但當洗脫模板后，阻抗減小(曲線c，約650 Ω)，說明洗脫產生的位點可為探針提供傳輸通道。需要指出的是，其阻抗仍然比GN-CNTs-IL/GCE的大很多，表明NaOH溶液對蘆丁有良好的溶解作用但又不破壞CS膜[19]。當把電極再次浸入到10 μmol/L蘆丁的PBS中富集之后,MIPs/GN-IL-CNTs/GCE阻抗值增大至約800 Ω(曲線d)，這是由于模板分子占據了識別空腔，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-探針的電化學反應。這些表明，GN-CNTs-IL有良好的電子傳遞能力，蘆丁分子被成功印跡在復合膜中。

圖2 不同電極在0.10 mol/L KCl-5.0 mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4溶液中的EIS譜圖Fig.2 EIS of different electrodes in 0.10 mol/L KCl containing 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4(a)GN-IL-CNTs/GCE;(b)MIP/GN-IL-CNTs/GCE before elution;(c)MIP/GN-IL-CNTs/GCE after elution;(d)MIPs/GN-IL-CNTs/GCE(rebinded rutin) and (e)NIPs/GN-IL-CNTs/GCE before elution.

2.2 蘆丁在不同電極上的響應

蘆丁在不同電極上的DPV曲線如圖3A所示。它在GN/GCE、IL/GCE和CNTs/GCE上都有比較明顯的氧化峰，與GN、IL和CNTs良好的導電、催化性有關。當GN、CNTs與IL復合后，蘆丁的峰電流顯著增大，這是由于IL的引入不僅改善了GN、GN-CNTs在水中的分散性，而且使材料結構疏松而具有更大比表面積，從而提高了靈敏度[20]。與GN-IL/GCE相比，引入CNTs后，蘆丁在GN-CNTs-IL/GCE上的峰電流進一步增大，這是因為形成了表面積更大的多孔結構。圖3B是蘆丁在GCE、MIPs/GCE、MIPs/GN-CNTs-IL/GCE、NIPs/GN-CNTs-IL/GCE和GN-CNTs-IL/GCE上的DPV圖。在裸GCE上有一個很小的氧化還原峰，來自蘆丁中酚羥基的氧化還原。在MIPs/GCE上的峰電流有所增加，但增幅較小。與NIPs/GN-CNTs-IL/GCE相比，MIPs/GN-CNTs-IL/GCE對蘆丁的響應明顯增強，峰電流是非印跡時的4～5倍，這是由于MIPs對蘆丁分子的選擇性吸附所致。蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的氧化峰電流是MIPs/GCE上的5～6倍，這與GN-CNTs-IL表面積大、導電、催化性能好有關。而相同濃度的蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE和GN-CNTs-IL/GCE上的氧化峰電流差別不大，說明蘆丁印跡CS膜上的有效印跡位點多且導電性良好。

圖3 (A)蘆丁在IL/GCE(a)、GN/GCE(b)、CNTs/GCE(c)、GN-IL/GCE(d)和GN-IL-CNTs/GCE(e)上的DPV圖；(B)蘆丁在GCE(a)、MIPs/GCE(b)、NIPs/GN-IL-CNTs/GCE(c)、MIP/GN-IL-CNTs/GCE(d)和GN-IL-CNTs/GCE(e)上的DPV圖Fig.3 (A) DPV of rutin at IL/GCE(a),GN/GCE(b),CNTs/GCE(c),GN-IL/GCE(d) and GN-IL-CNTs/GCE(e);(B) DPV of rutin at GCE(a),MIPs/GCE(b),NIPs/GN-IL-CNTs/GCE(c)，MIPs/GN-IL-CNTs/GCE(d) and GN-IL-CNTs/GCE(e)Supporting electrolyte:0.10 mol/L PBS(pH=5.5);accumulation time:600 s;scan rate:50 mV/s.

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 離子液體濃度的選擇IL功能化對改善GN-CNTs在水中的分散性有重要作用。GO中存在大量具有活性的環氧基團[21]，在親核試劑1-氨丙基3-甲基咪唑溴([APMIM)Br])和KOH存在的情況下，GO的環氧基可發生親核開環反應。同時，雙親性的GO -IL可促進CNTs在水中的分散，形成分散均勻的GO -IL-CNTs混合液，在180 ℃反應釜中經12 h的高溫高壓水熱過程后，轉化為GN-CNTs-IL復合物。IL一方面增加了親水性，另一方面引起GN層間靜電排斥。實驗結果表明，當IL濃度從0 mg/mL增大至0.6 mg/mL時，蘆丁在所得MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的響應電流逐漸增大；當IL濃度超過0.6 mg/mL時，其響應電流又降低(圖4A)。這是因為當IL濃度過大時，GN-CNTs分散度隨之降低且不利于模板分子的洗脫。因此，實驗選用0.6 mg/mL IL。

2.3.2 殼聚糖濃度選擇考察了CS濃度對蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的峰電流的影響。取4.95 mL不同濃度的CS溶液和50 μL蘆丁溶液(0.010 mol/L)混合，當CS濃度從0.1%(V/V)逐漸增大到0.8%時，蘆丁的峰電流先增加，然后下降，在0.2%時達最大值。這主要是由于高CS濃度會引起溶脹，增加膜的厚度，阻礙電子傳遞。但過低的CS濃度使印跡位點減少。因此，以0.2%CS用于制備印跡膜。

2.3.3 緩沖體系pH的影響緩沖體系的pH值對蘆丁的電化學行為和聚合物膜的穩定性有一定影響。如圖4B所示，蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的峰電流隨緩沖體系pH的增大先增加，然后逐漸降低。這是因為蘆丁的氧化過程有質子參與[22]，pH過小或過高不利于電化學反應。另外，pH過小CS膜不太穩定。因此選用pH=5.5的PBS為支持電解質。

2.3.4 MIPs/GN-CNTs-IL滴涂量的影響隨著MIP/GN-CNTs-IL(2 mg/mL)用量從4 μL增至12 μL，峰電流先增大后減小，在滴涂量為6 μL時峰電流達到最大值。這是因為起初隨滴涂量增加，特異性識別位點增多；但當MIPs/GN-CNTs-IL的滴涂量過大時，有效位點數目基本不再增加，但膜厚增加阻礙電子傳遞，反而使響應電流變小。而當MIPs/GN-CNTs-IL的濃度大于2 mg/mL，印跡材料易發生表面脫落現象。因此，選擇6 μL 2 mg/mL MIPs/GN-CNTs-IL修飾GCE。

2.3.5 蘆丁與殼聚糖質量比的影響保持CS與蘆丁的總質量不變，改變它們的比例，制備修飾電極(圖4C)。結果表明，蘆丁與CS的質量比由1∶50增加到1∶4時，所得MIPs/GN-CNTs-IL/GCE對蘆丁的響應電流先增加后降低，在1∶30時達到最大值，此時對應的摩爾比約為1∶200。這無疑與印跡位點數目和膜結構變化有關。比例太高和太低時，印跡位點數目均較少，只有在合適比例時才較多。此外，比例低時復合印跡膜結構變得比較致密，不利于傳質。因此，選擇質量比為1∶30制備印跡電極。

圖4 離子液體的濃度(A)、溶液pH(B)和蘆丁與殼聚糖的質量比(C)對蘆丁峰電流的影響Fig.4 Influence of IL concentration(A),solution pH(B),and mass ratio of rutin to CS (C) on peak current Solution conditions:5.0 μmol/L rutin+0.10 mol/L PBS(pH=5.5);scan rate:50 mV/s.

2.3.6 洗脫時間和吸附時間的影響考察了洗脫時間的影響，發現當洗脫時間從3 min增至11 min時，傳感器對蘆丁的電流響應先增加，然后略有下降。這是因為較短的洗脫時間導致洗脫不完全，而過長的洗脫時間可能會由于機械攪拌而影響MIPs穩定性，因此選擇洗脫5 min。此外，還優化了富集時間。對于5.0 μmol/L蘆丁，開路吸附10 min后峰電流達到最大。因此，在測量前進行10 min的富集。

2.4 蘆丁的電化學檢測

在上述優化條件下，記錄了傳感器MIPs/GN-CNTs-IL/GCE對不同濃度蘆丁的DPV響應曲線(圖5A)。隨著蘆丁濃度從0.010 μmol/L增大到200 μmol/L，峰電流先急劇增大后再相對平緩增大，分別與蘆丁濃度在0.010～1.0 μmol/L和1.0～200 μmol/L兩段范圍內成線性關系(圖5B)，線性方程分別為：IP(μA)=17.54c(μmol/L)+4.331(R2=0.9967);IP(μA)=0.1169c(μmol/L)+21.91(R2=0.9915)，檢出限則達到6 nmol/L。

圖5 (A)蘆丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的DPV圖(蘆丁濃度從a到l:0.01，0.1，0.5，0.7，1,10，50，100，150，200 μmol/L；(B)蘆丁的校準曲線Fig.5 (A)DPV of rutin at MIPs/GN-CNTs-IL/GCE;(B)Calibration curve(rutin concentration(from bottom to top):from 0.010 μmol/L to 200 μmol/L)Supporting electrolyte:0.10 mol/L PBS(pH=5.5);accumulation time:600 s;scan rate:50 mV/s.

如表1所示，與其他蘆丁電化學傳感器相比，本研究構建的傳感器具有較寬的線性范圍和低的檢測限。

表1 不同蘆丁電化學傳感器分析參數比較Table 1 Comparison of different electrochemical sensors for rutin analysis

2.5 電極的穩定性、重現性和抗干擾能力

用相同的方法制備了6支修飾電極，分別檢測5.0 μmol/L蘆丁，得到響應電流的相對標準偏差(RSD)為6.2%。同一支修飾電極對5.0 μmol/L蘆丁重復測定5次，RSD為5.4%。將電極在室溫下保存7 d后再測定蘆丁，響應電流值為初始值的92.5%。說明該傳感器具有良好的穩定性與重現性。

在含有5 μmol/L蘆丁的PBS(pH=5.5)中，分別加入100倍的潛在干擾物，包括葡萄糖、蔗糖、多巴胺、抗壞血酸、槲皮素和柚皮素，考察它們對蘆丁電化學響應的影響。實驗表明這些可能的干擾物對蘆丁的檢測影響較小，峰電流變化范圍為94.2%～107%?？梢妭鞲衅骶哂辛己玫倪x擇性。

2.6 實際樣品檢測

在上述優化條件下，按“1.5”處理蕎麥茶和復方蘆丁片樣品并進行了測定。結果如表2所示，蕎麥茶試液中蘆丁的濃度為0.052 μmol/L，計算得蕎麥茶試樣中蘆丁的含量為0.158 mg/g；復方蘆丁片試液中蘆丁濃度為0.032 μmol/L，計算得復方蘆丁片中蘆丁的含量為0.165 mg/g。方法的加標回收率為93.4%～102.3%，RSD為1.9%～4.6%?？梢?，該傳感器應用于實際樣品的檢測有其良好的可行性。

表2 樣品中蘆丁的檢測結果Table 2 Determination results of rutin in samples with the prepared sensor

3 結論

本研究通過將功能單體殼聚糖、模板分子蘆丁與離子液體功能化的石墨烯-碳納米管混合后，再用戊二醛交聯，可制備出具有良好導電性和多孔結構的蘆丁分子印跡復合材料。將該復合材料滴加在玻碳電極表面制備的蘆丁分子印跡電化學傳感器，在優化后的制備和測定條件下，表現出良好的分析性能。發展的方法不僅線性響應范圍較寬、檢出限低，而且重現性好、選擇性和穩定性較高，可以用于實際樣品中蘆丁的檢測。