MPN法檢驗大腸菌群的實驗分析

蘇章庭 曾曉琮 劉單單 楊丹婷 周露

（廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510435）

1 前言

大腸菌群（coliform group、coliform）是指一群需氧及兼性厭氧、能在37℃培養24 h內使乳糖發酵產酸產氣的革蘭氏陰性、無芽胞桿菌。它基本包括糞便內所有的兼性厭氧、革蘭氏陰性的桿菌，典型的菌屬包括埃希氏菌屬（Escherichia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、腸 桿 菌 屬（Enterobacter）、克 雷 伯 氏 菌 屬（Klebsiella）、哈夫尼菌屬（Hafnia）等。但大腸菌群不是分類學上的命名，而僅作為一個工作定義[1-7]。

多管發酵法是根據大腸菌群細菌能發酵乳糖、產酸產氣以及具備革蘭氏染色陰性、無芽孢、呈桿狀等有關特性，通過系列稀釋實驗與結合概率理論，來估計水樣中的總大腸茵群數。在一般的多管發酵實驗中，樣品需要先經過梯度系列稀釋，再取一定體積的水樣接種至液體培養基中，每個稀釋度通常需要進行多組平行重復實驗。然后根據培養過后的陽性管數，通過查閱MPN統計表估計實驗結果[8-10]。

多管發酵法的結果以最可能數（Most Probable Number，MPN）來進行表示。實際上是根據統計學理論，估計水體中的大腸菌群密度的一種方法。如果從理論方面考慮，并且進行最大的重復實驗，可以發現這種估計有大于實際數字的傾向，但是只要每一稀釋度試管重復數目增加，這種差異便會減少。所以對于細菌含量的估計值，大部分取決于那些既顯示陽性又顯陰性的稀釋度。因此，在實驗設計時，水樣檢驗所要求的平行實驗數目，需根據所要求數據的準確度而定[11]。對于直接飲用的如礦泉水等預計不是嚴重污染的樣品，可以采用單個稀釋度作為預實驗。對于稀釋管中培養基的體積和平行數目應當根據水中預期的細菌密度和計劃的稀釋系列梯度而變化。

對于礦泉水水質中大腸菌群的檢驗，《GB 8538—2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》[12]采用5管法（使用5管10 mL乳糖膽鹽培養基分別接種10mL水樣）進行檢驗；世界衛生組織（Wrold Health Organization，WHO）《水質監測—淡水水質研究和監測計劃的設計和實施實用指南》[13]中“第十章：微生物分析檢測”采用6管法（使用1管50 mL乳糖膽鹽培養基接種50 mL水樣，5管10 mL乳糖膽鹽培養基分別接種10 mL水樣）。為了比較這2種方法的性能，本文采用不同的菌株，設計不同的濃度對這2種方法進行驗證。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與菌株

儀器：濁度儀（DensiCHEK plus，生物梅里埃中國）；MS3漩渦混合器（IKA儀器設備有限公司）；移液器（eppendorf中國）；Masticator均質器（IUL）；SX-700高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；PL6001E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LRH-250F生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Milli-Q Reference超純水機（默克化工技術有限公司）。

試劑：PBS緩沖液、乳糖膽鹽培養基、營養肉湯（均由北京陸橋技術有限責任公司生產）。

菌株：大腸埃希氏菌ATCC 25922，產氣腸桿菌ATCC 13048，弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864，糞鏈球菌ATCC 29212。

2.2 方法

2.2.1 測試菌株與濃度選擇

按照《GB 4789.28—2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》[14]以及《SN/T 3266—2012食品微生物檢驗方法確認技術規范》[15]關于生長率、選擇性和特異性的要求，選取了大腸埃希氏菌ATCC 25922、產氣腸桿菌ATCC 13048、弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864以及混合菌（大腸埃希氏菌ATCC 25922+產氣腸桿菌ATCC 13048+弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864+糞鏈球菌ATCC 29212）進行實驗。實驗中使用的培養基為乳糖膽鹽發酵培養液。

弗氏檸檬酸桿菌是檸檬酸桿菌屬的模式種[16]。產氣腸桿菌原本在腸桿菌屬下，但是在最新的分類中已經劃分到克雷伯菌屬下[17]。兩者均為大腸菌群中典型菌屬的成員。大腸埃希氏菌、產氣腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌在乳糖膽鹽發酵培養液中的典型生長現象為產酸產氣?；旌暇旱闹饕饔檬悄M競爭菌群，競爭菌群的存在使微生物檢驗更符合實際和更具挑戰性。加入競爭菌群可使食品樣品最接近于自然狀態，其足以證實某類食品中目標微生物的部分回收率。

《SN/T 3266—2012食品微生物檢驗方法確認技術規范》中，關于人工污染的食品樣品，要求有高、中、低3個接種水平（例如，102CFU/g～103CFU/g、104CFU/g、105CFU/g）和一個未接種對照。對每個接種水平和陰性對照，都要用待確認方法和基準方法各檢測5個樣品。低接種水平應設定在接近檢測限，中、高接種水平應當分別高1和2個對數級。如有必要，可加做中間水平以提高精密度。

將各個測試菌株分別接種到營養肉湯中，過夜培養。

2.2.2 混合菌液制作

混合菌液由大腸埃希氏菌、產氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和高一個濃度水平的糞鏈球菌組成，制作比例見表1。

表1 不同濃度實驗的混合菌比例

2.2.3 梯度系列稀釋

將經過培養的菌液稀釋到0.58±0.02麥氏濁度，近似作為108濃度。在此基礎上作梯度系列稀釋，并制作100CFU/100mL，101CFU/100mL，102CFU/100 mL濃度的測試水樣。

2.2.4 接種

將3個水平濃度的測試菌株水樣分別進行6管法和5管法試驗，同時設置陰性對照。

6管法：每個陽性污染濃度的水樣取50 mL接種到盛有50 mL雙料乳糖膽鹽發酵培養液的100 mL試管，接種1份；再取10 mL接種到盛有10 mL雙料乳糖膽鹽發酵培養液的試管中，共接種5份。每個稀釋度做7個平行。

MPN值按照世界衛生組織（Wrold Health Organization，WHO）《水質監測—淡水水質研究和監測計劃的設計和實施實用指南》第十章：微生物分析檢測中的MPN統計表進行驗證。具體見表2。

表2 用1管50 mL和5管10 mL水樣時各種陽性和陰性結果組合的MPN值及其95%可信限

5管法：每個陽性污染濃度的水樣取10 mL接種到盛有10 mL雙料乳糖膽鹽發酵培養液的試管中，共接種5份。每個稀釋度做7個平行。

MPN值按照《GB 8538—2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》中55.1.2.5.1的MPN統計表進行驗證。具體見表3。

表3 用5管10 mL水樣時各種陽性和陰性結果組合的MPN值及其95%可信限

3 結果

3.1 高濃度實驗

102CFU/100mL濃度的陽性菌（產氣腸桿菌、大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、混合菌）污染試驗，6管法與5管法試驗現象均為所有實驗管產酸產氣。符合大腸菌群細菌能發酵乳糖、產酸產氣的生化特性。

3.2 中濃度實驗

101CFU/100mL濃度的陽性菌（產氣腸桿菌、大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、混合菌）污染試驗結果均大于0MPN/100mL。對于MPN值計算其標準偏差，結果沒有明顯差異。具體見表4。

表4 6管法與5管法的標準偏差

3.3 低濃度實驗

100CFU/100mL濃度的陽性菌（產氣腸桿菌、大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、混合菌）污染試驗，6管法與5管法試驗結果存在不同。其中：

（1）產氣腸桿菌污染試驗6管法試驗出現4次結果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗出現5次結果為0MPN/100 mL。

（2）大腸埃希氏菌污染試驗6管法試驗出現1次結果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗出現3次結果為0MPN/100 mL。

（3）弗氏檸檬酸桿菌污染試驗6管法試驗出現2次結果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗出現3次結果為0MPN/100 mL。

（4）混合菌污染試驗6管法試驗未出現結果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗出現3次結果為0MPN/100 mL。

本次試驗具體結果見表5。

表5 多管稀釋法實驗結果

（續表5）

4 結論

實驗結果表明，在高濃度水平下，所有實驗管均能夠表現出產酸產氣的典型大腸菌群生化特性。在中濃度水平下，結合多個平行試驗結果，5管法和6管法的數據離散程度未表現出較大差異。在低濃度試驗中，6管法比5管法表現出了更高的靈敏度。

6管法加樣量為100 mL，客觀上更符合結果報告為“MPN/100 mL”。5管法加樣量為50 mL，結果報告為“MPN/100 mL”，該種結果報告的單位是理論上的單位體積濃度而并不能體現實際檢驗的實驗體積。所以，在客觀上6管法采樣體積更加符合MPN的結果描述。

根據參考的MPN表，將可以計算出置信區間的MPN值繪制出區間圖。通過圖1和圖2的區間圖的比較，6管法比5管法能夠表現出更多的結果，即具有更好的精確度。從誤差區間上看，6管法比5管法有更高的準確度。

圖1 6管法部分MPN值區間圖

圖2 5管法部分MPN值區間圖

5 討論

5.1 多組MPN的平均值

對于多組發酵管的MPN平均值，應該根據各組發酵管的呈陽性反應管數的平均值來計算MPN值，不能直接取各組MPN值的平均數[18]。

對于中濃度計算MPN平均值。對于5管法，可以使用以下公式求解：

其中：n代表實驗總試管數量；r代表培養后陽性試管數量；v代表接種體積；λ代表細菌密度。

對于6管法，設10 mL管的陽性管數量為r1，陰性管數量為r2，50 mL管的陽性管數量為r3，陰性管數量為r4?？傻茫?/p>

按最大似然方法求解MPN值[19-23]。

5.2 MPN的標準差與置信區間[24-26]

對于MPN的方差可以通過MPN計算公式的二階微分方程求出：

其中：k表示稀釋數；x表示陽性管數；d表示稀釋因子；w表示接種量；λ表示細菌密度。

在以往的許多研究中，由于每管稀釋液可能只含有少量樣品。在這種情況下，MPN的分布會非常偏斜，而lgMPN的分布更接近對稱。因此建議從lgMPN而非直接從MPN進行顯著性檢驗和置信限的構造[27]。則有：

其中，6管法和5管法的MPN平均值與置信區間見表6和表7。

表6 6管法的MPN平均值與95%置信區間

表7 5管法的MPN平均值與95%置信區間

根據計算的MPN結果，將MPN值的置信區間繪制出區間圖。從圖3和圖4誤差區間上看，6管法比5管法有更高的準確度。

圖3 6管法MPN平均值區間圖

圖4 5管法MPN平均值區間圖

5.3 MPN的數值差異

判斷MPN值之間差異的顯著性，可以使用2個MPN值的合并標準差和t分布標準統計表來確定[28]?？傻霉綖椋?/p>

計算6管法與5管法的SDlgMPN值與t檢驗統計量，結果見表8。

表8 6管法與5管法的SD lg MPN值與t檢驗統計量

自由度為f=5+6-2=9，查閱置信度a=95%的水平下的t檢驗分布表，結果表明無統計學意義。即6管法與5管法的MPN結果未表現出顯著差異?？赡茉蚴鞘軐嶒灅颖緮盗?、抽樣量以及其他引起統計信噪比增大的因素的影響，需要進一步實驗以提高實驗精確度。