外源添加木質素對農田土壤微生物的影響

孫敬文 尹晗 安雪暉 何世欽3 孫月 陳禹竹

摘要 [目的]研究木質素對土壤微生物的影響，為木質素后期的資源化利用提供一定的基礎資料。[方法]采集農田土壤進行培養試驗，設置空白對照和木質素處理組，培養結束后提取土壤DNA，結合定量PCR和高通量測序等技術，研究木質素對土壤微生物的影響，對微生物的群落組成及多樣性進行分析。[結果]定量PCR結果表明，木質素的加入減少了細菌16S rRNA基因豐度，且顯著降低了真菌18S rRNA基因豐度。高通量測序結果顯示，Alpha多樣性分析上，細菌的空白對照多樣性指數均高于木質素處理，真菌則相反，但均未達顯著水平;PCoA分析表明，木質素的加入對細菌和真菌群落均產生了顯著影響，不同處理間的群落結構差異較大。在門水平上對微生物群落組成分析表明，木質素的加入顯著提高了細菌中γ-變形菌、擬桿菌、厚壁菌的相對豐度，降低了酸桿菌、放線菌、δ-變形菌的相對豐度;真菌中明顯增加了擔子菌、被孢霉菌的相對豐度，而降低了子囊菌的相對豐度。[結論]木質素的加入對土壤中細菌、真菌的數量及群落結構均產生了一定影響?？傮w上，木質素不利于土壤微生物群落的生長繁殖和代謝。由于對木質素的利用能力不同，不同微生物呈現出了不同的效果。

關鍵詞 木質素;土壤微生物;定量PCR;高通量測序

中圖分類號 S 154.3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）18-0156-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Exogenous Lignin on Farmland Soil Microorganisms

SUN Jing-wen1，YIN Han1，AN Xue-hui2 et al

（1. PowerChina Roadbridge Group Co.， Ltd.， Beijing 100048; 2. School of Civil Engineering， Tsinghua University， Beijing 100084）

Abstract [Objective] To study the effect of lignin on soil microorganisms， and to provide some basic information for the utilization of lignin as a resource in future. [Method] Collecting the farmland soil for cultivation experiment， control group and lignin treatment group were set up. Soil DNA was extracted after cultivation. Combined with methods such as quantitative PCR and high-throughput sequencing， the effects of lignin on the composition and diversity of soil microorganism and communities were studied. [Result] Quantitative PCR results showed that the addition of lignin reduced the gene expression abundance of bacterial 16S rRNA， and reduced the abundance of fungal 18S rRNA gene expression significantly. The results of high-throughput sequencing showed that in the Alpha diversity analysis， the diversity index of bacteria for the control group was higher than that of lignin treatment group， while that of fungi was the opposite， but they did not reach a significant level. The PCoA analysis showed that the addition of lignin had an effect on bacteria and fungi. The communities all had a significant impact， and the community structure differed greatly among different treatments. The analysis of the microbial community composition at the phylum level showed that the addition of lignin significantly increased the relative abundance of Gammaproteobacteria， Bacteroides， and Firmicutes for the bacteria， and reduced Acidobacteria， Actinobacteria， and Deltaproteobacteria. For the fungi， the relative abundance of Basidiomycota and Mortierellomycota was increased significantly， but the relative abundance of Ascomycota was decreased. [Conclusion] The addition of lignin has a certain impact on the copy number of microorganisms and community structure of bacteria and fungi in the soil. On the whole， lignin is not conducive to the growth and metabolism of soil microbial communities. Due to the different utilization capacity of lignin， some microorganisms show different effects.

Key words Lignin;Soil microorganism;Quantitative PCR;High-throughput sequencing

基金項目 中電建路橋集團有限公司科技項目“海綿型城市廣場透水鋪裝與雨水花園關鍵技術開發”。

作者簡介 孫敬文（1983—），男，山東德州人，工程師，從事巖土工程管理研究。*通信作者，碩士，從事環境微生物研究。

收稿日期 2021-01-08

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在土壤有機質分解、土壤營養轉化和循環、植物生長的促進或抑制以及各種土壤物理過程中，發揮重要作用[1]。土壤微生物在生態系統物質循環和能量轉化中占有重要地位，當土壤環境發生變化時，微生物能快速作出反應，是土壤環境質量評價不可缺少的重要生物學指標[2]。土壤微生物會與所種植物根系形成一個穩定的動態系統，在這個系統中它們相互作用、相互影響。植物根系為土壤微生物提供養分，土壤微生物反過來也促進植物根系的發育，從而促進了植物的生長[3]。合理利用土壤微生物，充分發揮土壤微生物的優勢，對促進植物生長、提高作物產量的作用是不可估量的。

木質素是一種存在于大部分陸地植物木質部中的復雜

高分子化合物，是植物骨架的主要成分，在自然界非常豐富，在數量上僅次于纖維素[4]。木質素的來源非常廣泛，由于其是植物的主要成分，我國又是一個農業大國，每年會產生大量的植物纖維性廢棄物，包括秸稈、雜草、落葉等，都含有木質素[5]。工業木質素的來源主要是紙漿生產的副產物，分為堿木質素和木質素磺酸鹽兩大類[6]。近年來，人們開始逐漸開發和利用木質素，已發現木質素可以作為土壤的改良劑和修復劑[7]，也可以作為肥料與氮肥配施[8]。另外，其作為共代謝底物時，也可以刺激土壤微生物促進多環芳烴污染物的降解[9]。但目前，人們對木質素的利用才開始，利用率仍較低，在實際修復及應用中也存在一定的局限性[9-10]。因此全面了解木質素的作用機制，以及更合理地利用木質素對農業生產和環境保護都具有重要意義。筆者通過設立培養試驗，添加木質素處理組，并利用定量PCR和高通量測序等技術，研究外源添加木質素對土壤微生物基因豐度、群落組成及多樣性的影響，評估木質素對土壤微生物的影響，以期為后續木質素的資源化利用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

采集江蘇省南京市西南郊農田表層土壤，土樣放置于室溫下自然風干，過2 mm篩。土壤基本理化性質：pH 6.84，有機質含量12.7 g/kg，總氮1.3 g/kg，全磷0.57 g/kg，全鉀19.3 g/kg。

1.2 主要試劑與儀器

堿木質素（Lignin），美國Sigma-Aldrich試劑公司;引物，上海英駿生物技術有限公司;FastDNA SPIN Kit for Soils試劑盒，美國MP Biomedicals公司;Top Green qPCR SuperMix（SYBR Green），北京全式金生物技術有限公司。

熒光定量基因擴增儀，德國Analytik Jena公司;NanoDrop超微量分光光度計，美國Thermo Fisher公司;Illumina MiSeq高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.3 試驗設計

利用黑麥草盆栽進行培養試驗，設置空白對照組和木質素處理組，每個處理4個重復。每盆加入2 kg土壤，處理組在土壤中加入木質素，充分混勻使其終濃度為8 g/kg。培養90 d后，收集土壤樣品，每盆用不銹鋼土鉆隨機取5個點混合，置于-20 ℃保存以供微生物分析。

1.4 土壤DNA提取

取0.5 g土壤，使用FastDNA SPIN Kit for Soils試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。并用NanoDrop儀器測定DNA的濃度和純度，提取完成后保存于-20 ℃。

1.5 定量PCR

采用定量PCR方法測定樣品中細菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因。土壤樣品總DNA稀釋至10-1濃度，作為定量模板，定量PCR反應體系（20 μL）：Top Green qPCR SuperMix（SYBR Green）10 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH 2O 7.2 μL，模板DNA 2.0 μL。采用細菌16S rRNA基因序列PCR通用引物Eub338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和Eub518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）[11]，擴增目的片段。定量PCR擴增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環;72 ℃ 10 min。采用真菌18S rRNA基因序列PCR通用引物nu-SSU-0817（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和nu-SSU-1536（5′-ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3′）[12]，擴增目的片段。定量PCR擴增程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環;72 ℃ 10 min。

1.6 高通量測序數據分析

高通量測序得到的原始數據使用QIIME（V1.9.1）和USEARCH（V8.1.1861）流程進行分析，序列經拼接、過濾和質控后，在97%相似性水平劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），細菌序列通過與SILVA數據庫（https：//www.arb-silva.de）比對確定系統學分類，真菌序列通過與Unite數據庫（http：//unite.ut.ee/）比對確定系統學分類，得到每個樣品的OTUs和物種注釋的基本分析結果，同時對物種注釋在各個分類水平上進行組成結構的統計分析。再對OTUs豐度、多樣性指數等進行分析。

1.7 數據分析

試驗數據采用SPSS 20、Graphpad Prism 8.0，Excel 2016和R-Studio進行整理、分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 基因豐度

定量PCR測定結果見圖1。2種處理中，細菌16S rRNA的基因拷貝數均在1.6×109 copies/g左右，木質素處理下的細菌16S rDNA基因拷貝數略少于對照，但未達顯著水平;對照處理中的真菌18S rRNA基因拷貝數為8.43×106 copies/g，木質素處理下的真菌18S rRNA基因拷貝數為3.78×106 copies/g，木質素處理顯著降低了真菌18S rRNA基因拷貝數。

2.2 微生物群落分析

在細菌16S rRNA基因的高通量測序中，2種處理8個樣品一共獲得20萬條序列，經質量控制，單個樣品的序列數在11 920～36 307，在97%序列相似性水平獲得9 139個OTU。在真菌18S rRNA基因的高通量測序中，2種處理8個樣品一共獲得45萬條序列，經質量控制，單個樣品的序列數在42 154～73 266，在97%序列相似性水平獲得1 750個OTU。

2.2.1 微生物群落的Alpha多樣性分析。

對2種處理的樣品在97%相似性閾值水平下的Alpha多樣性分析指數進行統計，結果見圖2。對2種處理得到的細菌Alpha多樣性分析發現，木質素處理下各樣品的多樣性指數均小于空白對照。而真菌Alpha多樣性分析則相反，木質素處理下各樣品的多樣性指數均高于空白對照。2組樣品均未達顯著水平。

2.2.2 微生物群落的PCoA分析。

在OUT水平上基于Bray-Curtis距離對對照組與木質素處理組進行了PCoA分析。由圖3可知，細菌群落中，對照組的樣品能夠緊密地聚集在一起，且明顯與木質素處理的樣品分開（P<0.05）;真菌群落中對照組與木質素處理組的樣品分布較為集中，且2組樣品能明顯地分開（P<0.05）。木質素的加入使微生物的群落組成發生了變化，說明木質素會對微生物群落產生影響。

2.2.3 微生物在門水平上的相對分布。

對細菌中相對豐度大于1%的門進行分析，結果見圖4A。在對照處理中，主要細菌門類包括γ-變形菌（Gammaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）、α-變形菌（Alphaproteobacteria）、放線菌（Actinobacteria），分別占24.28%、21.75%、14.73%、9.61%。加入木質素的處理明顯提高了γ-變形菌、擬桿菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）的相對豐度，分別達45.73%、8.77%、3.14%;明顯降低了土壤中酸桿菌、放線菌、δ-變形菌（Deltaproteobacteria）的相對豐度，分別為12.14%、4.06%、2.93%。

對真菌中相對豐度大于2%的門進行分析，結果見圖4B。在對照處理中，主要真菌門類包括子囊菌（Ascomycota）、被孢霉菌（Mortierellomycota）、梳霉菌（Kickxellomycota）、擔子菌（Basidiomycota），分別占比73.38%、14.09%、4.73%、2.35%。木質素的加入明顯增加了擔子菌、被孢霉門的相對豐度，達12.37%、20.32%;降低了子囊菌的相對豐度，為55.13%。

2.2.4 LefSe分析。

將木質素處理與對照處理進行LefSe分析，結果見圖5。圖中的結點從內圈至外圈代表細菌的各分類水平（界、門、綱、目、科、屬），不同顏色代表在各自處理中顯著富集的菌屬。木質素處理與對照處理相比，其顯著富集的結點達109個，包含53個變形菌、20個擬桿菌、19個厚壁菌、8個酸桿菌、5個BRC1、2個Armatimonadetes、2個Nitrospirae。其中相對豐度大于1%的科（Family）主要包括Burkholderiaceae、Methylophilaceae、Pseudomonadaceae、Prolixibacteraceae、Lentimicrobiaceae、Koribacteraceae、Enterobacteriaceae等，在木質素處理中分別占比13.84%、4.82%、4.72%、2.07%、1.94%、1.58%、1.55%、1.47%、1.39%、1.01%。

3 結論與討論

土壤微生物是土壤中的主要成分，它們參與土壤有機質分解、腐殖質合成、養分轉化等重要過程。木質素可以用作土壤改良劑、修復劑和肥料等，也被認為是具有修復潛力的污染土壤生物刺激材料。該研究通過盆栽培養試驗，對空白對照和木質素處理的土壤微生物進行了研究。

結果表明，木質素的加入對細菌、真菌的數量以及群落結構均產生了一定的影響。木質素降低了細菌的基因豐度，且顯著降低了真菌的基因豐度。木質素對細菌和真菌的數量顯示出抑制作用，對細菌和真菌的群落結構也產生了很大的影響。張杰[13]利用Biolog Eco板法研究了木質素等5種處理對土壤微生物的影響，結果發現木質素會對土壤微生物性狀和生化功能產生抑制作用，不利于土壤微生物的繁殖和代謝。

從微生物群落分析可以看出，木質素對一些微生物產生抑制作用的同時，也促進了部分微生物的快速生長和繁殖。結果發現，木質素明顯提高了細菌中γ-變形菌、擬桿菌、厚壁菌的相對豐度和真菌中擔子菌、被孢霉菌的相對豐度，這可能與木質素的降解過程有關。已發現細菌γ-變形菌綱假單孢菌屬（Pseudomonas），如Pseudomonas putida[14]，厚壁菌門芽孢桿菌屬（Bacillus），如Bacillus atphaeus[15]、Bacillus ligniniphilus[16]等具有木質素降解能力。通過LefSe的分析，發現木質素處理顯著富集了Burkholderiaceae、Methylophilaceae、Pseudomonadaceae、Prolixibacteraceae、Lentimicrobiaceae、Koribacteraceae、Enterobacteriaceae等細菌，其中Burkholderiaceae和Methylophilaceae已被證實屬于甲基營養菌[17-19]，也可能參與木質素的自身代謝過程，是木質素的潛在降解菌。真菌是迄今為止發現的參與木質素代謝的最活躍微生物，根據真菌對木質素的降解類型可以分為白腐菌（Phanerochaetc chrysosporium）、褐腐菌（Cyathus stecoreus）和軟腐菌（Erwinia carotovora）[20]，白腐菌[21]和褐腐菌[22]屬于擔子菌綱，而軟腐菌多屬于子囊菌綱。木質素的加入可能促進了能利用這類碳源的潛在降解菌的富集，顯著提高了這部分微生物的豐度。

另一方面，由于這類降解菌的富集，促進了土壤中木質素的分解，木質素結構復雜含有多種活性官能團，其在分解過程中會產生大量酚酸類等小分子物質[23-24]，這類物質常被認為是會對植物自身產生毒害作用的自毒物質[25]，這些物質會在土壤中與微生物互作，進而改變土壤生態環境，這類物質的產生可能也是導致部分微生物群落豐度減少的原因。尹淇淋等[26]研究發現，酚酸類物質的自毒作用會影響土壤微生物活性和土壤理化性質，劉曉珍等[27]研究發現菊花連作障礙引起的酚酸物質的積累會對土壤微生物產生影響，使微生物區系發生改變。

此外，筆者所在課題組在前期試驗過程中發現，木質素的加入會導致土壤一定程度的板結，這一現象會影響土壤的吸水、吸氧、營養物質吸附和通透能力等，會使土壤中的好氣性微生物的活動受到抑制，影響這部分微生物的生長和代謝。

目前，對木質素的研究仍存在一定的局限性，今后研究中可采用在種的水平上對土壤微生物的群落組成進行分析，進一步研究木質素對土壤微生物的作用，為木質素的資源化利用提供更多的科學依據。

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