基于PCR—DGGE的間作油茶林土壤細菌多樣性

文亞雄??+劉君昂??+劉小平??+周國英??

摘要：土壤微生物多樣性是評價土壤質量的重要指標，為探究林農間作對油茶林土壤微生物多樣性的影響，采用PCR-DGGE方法研究了油茶林間作大豆、間作花生2種間作模式不同時期對油茶林土壤細菌多樣性的影響。結果表明：間作處理各時期的土壤微生物種群相似性、微生物多樣性指數均高于對照處理；間作處理微生物多樣性指數保持在3.2～3.4之間；間作處理各時期土壤微生物均勻度指數為0.960～0.982；各處理的微生物種群相似性、微生物多樣性指數與季節變化相關。

關鍵詞：油茶林；林農間作；土壤微生物；多樣性

中圖分類號： S154.38+1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0057-03

林農間作是指將多年生木本植物通過空間或時間布局與農作物合理安排在同一土地經營單位內，使其中各組分在生態和經濟上具有相互作用[1]。研究表明，間作能顯著提高土壤微生物的生物量[2]，改變土壤微生物群落結構，提高土壤微生物的群落結構多樣性[3-4]，對土壤有機質的分解、腐殖質的形成、養分的轉化與循環等過程[5]也有促進作用。間作豆科植物還能通過生物固氮提高土壤氮素水平、增加產量[6-7]。目前，關于林農間作的研究大多關于間作系統中的物理因素，如間作對林下小環境中光、熱、水[8-9]、土壤養分[10]的影響，而關于間作體系中土壤微生物多樣性的研究較少，對油茶林土壤微生物多樣性的研究未見報道。

油茶是世界四大木本油料植物之一，是我國特有的木本油料植物，廣泛分布于我國南方地區[11]。近年來，隨著市場需求的發展及國家對油茶產業的支持，油茶逐漸成為我國南方地區的一種重要經濟作物。

通過對間作大豆、花生油茶林根區（距植物根系0～20 cm）土壤微生物多樣性進行對比研究，探討間作大豆、花生對油茶根區土壤微生物多樣性的影響，以期為提高油茶林間套作生產的經濟效益提供依據。

1材料與方法

1.1試驗設計

試驗于江西省宜春市袁州區西村鎮（27°44′9.83″N，114°11′24.32″E）油茶基地進行，該地屬于中亞熱帶季風氣候區，具有四季分明、熱量豐富、降水充沛、日照充足、霜期短、氣候資源豐富等特點，有利于農作物和林木生長。試驗地的年均日照時數約為1 737.1 h，年均氣溫為16.2～17.7 ℃，年均降水量約為1 624.9 mm，日均溫度≥10 ℃的活動積溫為 5 050～5 644 ℃。試驗地土壤為紅壤，地力均勻，便于排灌。

試驗處理包括間作花生、間作大豆、無處理對照。試驗用油茶林為4年生油茶幼林，株行距為2 m×3 m，長勢良好。

處理1：于造林后1年開始每年間種大豆，本研究中于2014年4月底間種，于同年7月收獲，收獲后將大豆苗覆于樣地。處理2：于造林后1年開始每年間種花生，本研究中于2014年5月間種，于同年8月收獲，收獲后將花生苗覆于樣地。CK處理：選取1塊純林樣地作為無處理對照。

1.2林間取樣

本研究分別采集間作花生油茶林、間作大豆油茶林、對照純林間作植物收獲時及收獲后的土壤樣品，間作大豆、間作花生處理第1次采樣時間分別為7、8月，收獲后第2次采樣時間分別為8、10月。每個處理在樣地內以對角線法選取5株油茶，采集油茶根區（距油茶根系0～20 cm）表層0～20 cm土壤樣品，采集后混合。

將林間取得的土樣放入冰盒保存，帶回實驗室后迅速過2 mm土篩，除去雜物。將過篩土樣于-20 ℃下保存，用于土壤微生物群落結構的研究。

1.3.3土壤微生物多樣性的DGGE圖譜分析

使用Bio-Rad DCode Universal Mutation Detection System電泳系統進行DGGE分析。采用濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為45%～65%（100%變性濃度為100 mL聚丙烯酰胺凝膠中加入40 mL去離子甲酰胺與42 g尿素），每孔加樣為25 μL PCR產物、5 μL 6×loading buffer，于60 ℃恒溫條件下[JP3]在1×TAE緩沖液中100 V電泳10 h。電泳完成后銀染照相。

1.4數據分析

采用Quantity one軟件識別PCR-DGGE圖譜中的泳道及條帶，得出量化圖及相應數據，進行數學未成對加權聚類分析（UPGMA），計算物種均勻度、Shannon-Wiener多樣性指數。Shannon-Wiener指數（H）、均勻度（E）的計算公式為：

[HS+7mm][JZ]H=-∑[DD（]s[]i=1[DD）]PilnPi；E=H/lnS。

式中：Pi為第i條條帶的優勢度，S為樣本的總條帶數[12]。

2結果與分析

2.1PCR產物瓊脂糖電泳檢測

所有樣品最終PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，該PCR方法能較好地擴增目標片段，目標片段長度約為200 bp，無非特異性擴增及引物二聚體，可用于后續DGGE分析。

2.2DGGE圖譜分析

對不同間作模式油茶林土壤微生物的16S rDNA V3可變區進行DGGE圖譜分析，結果（圖2-a）表明，各DGGE泳道內條帶被較好地分離，不同間作模式土壤微生物DNA條帶表現出不同的指紋圖譜及灰度，不同樣品的細菌群落表現出一定差別。由DGGE結果量化圖（圖2-b）可知，不同樣本的條帶分別與同批次樣本間有較多相同，表明相同樣地內具有較多的共有微生物種群。該類微生物應是土壤中的常見微生物種群，在土壤中的生長繁殖較為穩定，但該類微生物DNA條帶灰度不盡相同，表明間作處理對土壤微生物的數量也有一定影響。間作處理的條帶數量基本多于對照處理，表明間作處理增加了土壤中微生物的種群數量。 [FL）]

[FL（2K2]2.3DGGE圖譜聚類分析

以非加權算術平均法（UPGMA）對不同間作模式油茶林土壤細菌DNA的DGGE指紋圖譜進行聚類分析。結果（圖3）表明，季節變化對土壤微生物多樣性的影響較大，不同季節各處理間的相似性均低于0.60，相似性水平較低。間作花生與間作大豆處理的相似性較高，第1、2次采樣的相似性均為0.48，第3次采樣的相似性為0.39，表明間作花生與間作大豆對土壤微生物多樣性的影響具有一定相似性。在3個不[JP3]同采樣時間之間，間作處理的相似性均聚于0.39，高于對照處理間的相似性，表明間作處理能提高土壤微生物種群的穩定性。

2.4土壤微生物多樣性指數分析

根據由Quantity one軟件得出的不同條帶光密度峰值，運用Shannon-Wiener指數公式，計算得出不同間作處理土壤微生物多樣性指數。由圖4、圖5可知，間作處理的土壤微生物多樣性指數基本高于對照處理，其中間作花生處理第1次采[CM（25]樣的多樣性指數最高，達3.463；各處理的多樣性指數與季[CM）]

節變化相關，由春季向冬季逐漸降低。間作處理第1次采樣的多樣性指數與對照處理相近，均處于3.3～3.5之間；間作處理第2、3次采樣的多樣性指數略有降低，但仍處于3.1以上，而對照處理下降較多，降至3.0以下，間作處理在后期對土壤微生物多樣性的影響較大。間作處理的微生物群落均勻度變化較大，表明間作植物處理對油茶林土壤微生物群落結構的影響較大。間作花生處理各時期的多樣性指數均高于間作大豆處理，表明間作花生對土壤微生物多樣性的影響較大。

3結論與討論

土壤微生物是土壤生態系統的主要組成部分，對土壤肥力、酶活性[13]、土壤結構等有著重要影響。合理的間作可有效改善土壤微生態環境，提高土壤微生物的群落結構多樣性，并對土壤理化性質產生影響。陳永忠等、王瑞等研究表明，間作能提高油茶林土壤養分及微生物數量[14-15]。張向前等在研究玉米與花生、大豆間作時發現，間作能顯著提高土壤中的微生物數量，且微生物數量與土壤中酶活性呈顯著正相關關系[16]。本研究結果表明，不同間作處理均能提高土壤微生物種群多樣性，對土壤微生物數量也有一定影響。

王玉娟等研究表明，稻草覆蓋能有效調節土壤溫度，具有高溫季節降溫、低溫季節增溫的效果，并能改善土壤理化性質[17-18]。徐華勤等研究發現，稻草覆蓋與間作三葉草處理均可提高土壤微生物的活性與豐富度[19]。在本研究間作豆科植物處理中，豆科植物收獲后將植物殘體覆蓋于林間土地，不僅起到了夏季降溫、冬季保溫的作用，且隨著植物殘體的分解，較多的有機質及營養元素流入土壤中，為微生物的生長繁殖提供了有利條件，使間作豆科植物處理的微生物種群相似性及微生物多樣性指數始終保持在較高水平。另外，間作植物本身伸展的枝葉也覆蓋了地面，可起到降溫作用。

隨著微生物多樣性水平及種群數量的提高，油茶林土壤肥力也受到了影響。賈倩民等研究發現，細菌及放線菌數量與土壤有機質、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量呈顯著或極顯著正相關，真菌數量與土壤全鉀、速效磷、速效鉀含量呈極顯著正相關[20]。邵英男等認為，N、P含量及土壤pH值與細菌和放線菌的數量呈顯著正相關[21]。本試驗數據表明，間作花生并于花生收獲后將花生秸稈覆蓋于林下土地的林農復合經營模式，對調控油茶林土壤微生物多樣性具有較為積極的作用，同時對油茶林土壤肥力具有較好的影響，可在一定程度上促進油茶幼林的生長。

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